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PCR和ELISA在食源性致病菌检测中的应用


PCR和ELISA在食源性致病菌检测中的应用 摘要 阐述了 PCR 和 ELISA 这两种技术在食源性致病菌检测中的研究,并 对这两种方法特点与应用进行了探讨。 关键词 PCR;ELISA;致病菌检测 近几年,中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、 熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的动态监测, 结果表明,微生物源性食物中毒占居首位,高达 39.62%[1]。随着食品工业的 发展以及对食品安全的重视, 传统分析方法已经远不能满足食品检测的需要,迫 切需要灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法。因此, 近年来世界各国的许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究, 改进和 开发了一些快速的检测技术和方法。其中聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸 附试验(ELISA)以其简便、快速、灵敏、成本低、检测谱广等特点在食源性致 病菌检测方面的应用也越来越受到人们的青睐。 1PCR 技术 PCR 技术即聚合酶链式反应,也称无细胞克隆系统,是 1985 年诞生的一项 DNA 体外扩增技术,该技术自问世以来,就以惊人的速度广泛地应用于生命科 学的众多领域。 目前在食品工程领域中致病微生物、转基因食品的检测等方面的 应用也越来越受关注。 1.1PCR 技术原理 PCR 是在体外合适条件下,以单链 DNA 为模板,以 1 对人工合成的寡核苷 酸为引物,在热稳定 DNA 聚合酶作用下特异性扩增 DNA 片段的技术。整个反 应过程通常由 20~40 个 PCR 循环组成, 每个 PCR 循环包括高温变性—低温复性 —适温延伸 3 个步骤。方法是:首先将靶 DNA 双链加热变性为单链,然后加入 2 段人工合成的与靶 DNA 两端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物,即左端 引物和右端引物;该对引物与互补的 DNA 单链碱基互补结合后,在有 DNA 聚 合酶和 4 种 dNTPs 底物存在的情况下,引物沿模板 DNA 链(靶 DNA 单链)按 5′末端向 3′末端方向延伸, 自动合成新的 DNA 双链, 新合成的 DNA 双链又可作 为扩增的模板,继续重复以上的 DNA 聚合酶反应。经过 20~40 次循环,可将 靶 DNA 序列扩增近百万倍。 1.2PCR 技术在食品致病菌检测中的应用 利用 PCR 检测食品中的致病菌,首先要富集细菌细胞,通常经离心沉淀、 滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞,然后裂解细胞,使细胞中的 DNA 释 放, 纯化后经 PCR 扩增细胞靶 DNA 的特异性序列, 最后用电泳法或特异性核酸 探针检测扩增的 DNA 序列。 1.2.1 单核细胞增生李斯特氏菌的检测。单核细胞增生李斯特菌( Listeria monocytogenes,LM)是食品卫生中的重要病原菌,多通过食品经口感染,被列 为 20 世纪 90 年代食品中的四大病原菌之一。过去对食品中 LM 进行检测时,克 隆培养的标准方法需要 3~4 周的时间才能得出结果。 国外已广泛将 PCR 技术用 于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌,国内的报道也不少。杨百亮等(1994)通过 条件优化,建立了快速检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌的试剂盒 [2],并在同 年报道了以 l 对位于该菌 β-溶血素基因内的 26bp 寡核苷酸为引物,用 PCR 对市 售猪肉和牛奶中的单核细胞增生李斯特菌的检测 [3] 。金大智等运用实时荧光 PCR(Real-time PCR)技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法,设计 的引物和探针的序列特

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