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基因工程8-DNA诱变


第十章 DNA诱变
突变是研究基因结构与功能的最基本手段。
经典方法:分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获 得突变,再根据突变体的表型,采用遗传学方法鉴定相应基因。 体外诱变:对克隆化的DNA进行诱变处理,改变其核苷酸序列, 从而获得突变基因,用于基因工程、蛋白质工程等研究。

定向进化的原理

第一节

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随机诱变

体外随机诱变:指随机地在克隆化DNA中引入碱基臵换突变。 特点:不需要有序列针对性的合理设计,引入突变的位臵随机; 结果:在目的DNA片段中引入大量的序列多样性; 方法:错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变; 用途:诱变基因的编码区,改变氨基酸序列,从而改造蛋白质的 性质或活性,得到符合需要的蛋白质。 定向进化:对于某些实验目的,一次突变很难获得满意的结果, 通常采用反复多次诱变和循环,其目的是获得满足人们需要的 性能改良的蛋白质,又称为试管进化。

一、错误掺入突变
概念:在体外DNA扩增中,使用具有错配倾向的DNA聚合酶 以及反应条件,使碱基错误掺入到新合成的基因中,又称易错 PCR(error-prone PCR)。

error-prone PCR的实质:通过改变PCR反应条件来调整PCR 反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提 高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入 到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合 适的载体克隆突变基因。

易错PCR采用的方法:
? 增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对; ? 加入0.5mM的MnCl2,Mn 2+能降低聚合酶对模板的特异性; ? 增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应; ? 限定4种碱基中的一种,通常为正常浓度的1-10%,在缺乏正 确核苷酸时,DNA聚合酶经短暂停顿后,会插入另外3种可用

核苷酸的一种;
? 3种为正常浓度的正常碱基,第四种为次黄嘌呤dITP(可与C、 T、A配对);

? 增加dCTP和dTTP的浓度到1mM,促进错误掺入;
? 使用突变DNA聚合酶,如Mutazyme。

二、盒式诱变
种类

盒式取代诱变
混合寡核苷酸诱变

简单的盒式取代诱变是通

过限制性酶切除去特定的
双链DNA片段,再与含有 突变的单一序列双链寡核 苷酸连接,得到取代突变, 是一种定点诱变。 盒式取代诱变

混合寡核苷酸诱变:若 用于取代的是含有随机

突变的混合双链寡核苷
酸,则可在限定区域内 引入大量的随机突变。

混合寡核苷酸诱变

三、增变菌株的诱变作用
概念:与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后, 细胞内基因的突变频率大大增加,这样的菌株叫增变菌株 (mutator strain)。

常用增变菌株:E.coli XL1 - Red (mutD mutS mutT)
mutD突变造成DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’外切核酸酶活性缺陷,失 去错配碱基的校正功能;

mutS突变使DNA错配修复系统失去功能;
mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP, 8-羟基鸟嘌呤 在复制时掺入DNA中,造成突变。

四、化学诱变
用化学诱变剂处理双链DNA片段,将发生随机突变的片段群

体克隆到合适的宿主中,构建成一个重组突变体库。用适当
的功能分析可鉴别携带突变的重组子。

常用的化学诱变剂:
? 烷化剂

1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐——甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES) 2. 亚硝基烷基化合物——亚硝基乙基脲(NEH)、N-亚硝基-N-乙基脲烷(NEU) 3. 次乙胺和环氧乙烷类——乙烯亚胺(EI) 4. 芥子气类——氮芥类、硫芥类

作用机制——作用重点是核酸,导致DNA断裂、缺失或修补。

? 核酸碱基类似物
这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。

代表药剂:
5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR) 为胸腺嘧啶(T)的类似物 2-氨基嘌呤(AP) 为腺嘌呤(A)的类似物

马来酰肼(MH) 为尿嘧啶(U)的异构体

作用机制——作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去,使 DNA复制时发生配对错误,从而引起有机体变异。

? 其它诱变剂
亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨,改变核酸结构和性质,造成DNA复制紊乱。 HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。

叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂,能引起基因突变,可获得较高的突 变频率,而且无残毒。

第二节 DNA体外重组
依赖序列同源性的DNA体外重组技术。
要求:DNA亲本序列之间要有一定程度的同源性,重组交换在局 部序列完全相同的片段内发生。 关键:引入DNA片段的重新组装过程,又称有性PCR(sexual PCR)或分子育种PCR(molecular breeding PCR)。 优点:可以将大量突变中的有益突变快速地组合,加速产生DNA 序列多样性,使定向进化从以往的“突变—选择”模式变为与自 然进化更为相似的“突变—重组—选择”模式。

一、DNA洗牌法(DNA shuffling)
美国Stemmer 于1994 年首次提出 。
DNA shuffling技术是通过对一组序列相关DNA序列,经过超声波处理
或在DNaseI的作用下随机切成小片段,然后在没有引物的情况下,采用有 性PCR方法进行合成;随着循环数的增加,PCR产物将越来越接近切割前

的目的基因的长度;最后用基因两侧的引物合成全长的基因。

DNA shuffling技术的优点:①可在短时间内通过重组有效的突变体发
掘所有可能的重组体与突变序列,从而大大加快进化速度;而且对可操作 的靶序列没有任何要求,长度可达几十kb;②通过多轮筛选或选择,可以使 有益突变迅速积累,导致功能的明显提高;③从表型上早期进行选择,而 不必了解DNA片段上序列的信息,简化了操作程序;④比随机突变显著提

高了良性突变的概率。

二、交错延伸重组
(staggered extension process)
交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术。它不是由短片段组 装全长基因,而是在PCR样反应中 将含不同点突变的模板混合,随之 进行多轮变性、短暂(5sec)复性/ 延伸反应,在每一轮PCR循环中, 那些部分延伸的片段可以随机地杂 交到含不同突变的模板上继续延伸, 由于模板转换而实现不同模板间的 重组,这样重复直到获得全长基因 片段,重组的程度可通过调整反应 时间和温度来控制。

三、随机引发重组
(random priming in vitro recombination,RPR) RPR以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生 大量互补于模板不同位点的短DNA片段,由于碱基的错配 和错误引发,这些短DNA片段中也会有少量的点突变,在 随后的PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合, 再组装成完整的基因长度。 该法可以用一条DNA单链为模板,因此可以直接以cDNA 为模板进行随机引发重组。

随机引发合成短 DNA片段混合物;

过滤并纯化DNA片 段混合物;

做无引物PCR;

用两端引物进行标 准PCR,扩增全长 的杂交DNA链。

第三节 寡核苷酸介导的定点诱变

70年代初Φx174DNA(ssDNA 5386bp),当用带琥珀突变的 ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时,观察到 “标记获救”现象,即产生带野生型基因组的噬菌体。

一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程

化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火,并携带所需 突变的寡核苷酸,作为体外合成DNA的引物。 由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸,产生含有预定 突变的双链DNA。 对突变体DNA进行测序,验证靶点的突变,并确保其他区 域没有发生额外的突变。

二、诱变寡核苷酸的设计要求
①与靶DNA的适当链互补,并注意与模板的其他区域不能错 误杂交; ②足够的长度与靶序列特异地结合,1-2个碱基改变的引物 要求至少25个碱基长度; ③错配碱基位于中央位臵,使每侧有10-15个碱基与模板链 完全匹配; ④含有与模板完全杂交的5’端区,这样从上游引物起始的 DNA合成不至于取代诱变寡核苷酸引物; ⑤诱变寡核苷酸引物3’区域有10-15个碱基与模板链完全匹配, 形成足够稳定的杂交分子; ⑥无回纹、重复或自身互补序列; ⑦ 必要时可在诱变寡核苷酸上加入新的酶切位点,或消除 靠近诱变点的已有酶切位点。

三、经典DNA定点诱变
在PCR技术得到广泛使用之前,定点诱变程序均采用普通的 DNA聚合酶催化DNA的复制。通常以单链DNA为模板,大部 分方案利用了M13噬菌体可制备单链DNA的特点。M13噬菌体 是一种丝状噬菌体,只感染雄性大肠杆菌,不裂解大肠杆菌细 胞,可形成模糊噬菌斑,其基因组为闭合环状DNA,插入M13 的DNA可以分别回收到两种形式:dsDNA和ssDNA。

(一)Kunkel定点诱变法(又称“U”法)
1.背景知识
dut-:dUTP酶(dUTPase)缺陷,细胞不能把dUTP转化为 dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加,其中一些dUTP可 掺入DNA中正常情况下由T占据的位臵。

ung-:UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入
DNA中的尿嘧啶残基

在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+ dut+菌
株后,只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制,而 野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。

(二)位点选择诱变
(altered sites in vitro mutagenesis)

位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物,一个是用来引入突变

的引物,另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷
的抗生素抗性基因,同时可用来选择引入突变的DNA链。 特点:可正向选择突变链,使用高保真的T4DNA聚合酶合成 DNA,可以使用双良DNA作模板,可进行多轮筛选。但需特定

载体,即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。

(三)转化子诱变
(transformer site-directed mutagenesis)
转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物,除了突变引物外,还

使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶
切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上,该载 体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA 合成时,突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点,而模板 DNA在该位臵能被切割。通过转化大肠杆菌,线性化的模板 DNA不能复制,只有突变保持环状,可以获得转化子。

四、PCR介导的定点诱变
优点:
?突变体回收率高;

?快速简便,不需制备单链DNA模板;
?高温的利用可降低模板DNA形成二级结构的几率; ?所有反应可在同一试管进行。

缺点:
?PCR扩增DNA时会产生一定程度的碱基错配;

?在扩增DNA的3’末端加上非预设碱基;
?对每套引物和模板,PCR反应的条件都需要优化; ?标准PCR不能有效扩增大于3kb的DNA片段。

(一)大引物PCR诱变

(二)重叠延伸PCR诱变
(overlapping extension PCR)

(三)重叠延伸剪接技术
(splicing by overlap extension, SOE)

(四)同源重组法

(五)双向PCR快速定点诱变

五、野生型DNA的筛选和排除
限制性内切酶 DpnI 可 特异性切割dsDNA中的

Gm6ATC位点,对半甲
基化的DNA效率较低, 完全不能切割非甲基化

DNA。大肠杆菌体内
DNA在Dam甲基化酶催 化下完全甲基化,对 DpnI 敏感。

第四节 嵌套缺失
逐步从感兴趣的DNA的一端或两端删除多个寡核苷 酸,得到一套终末端长短不同的嵌套缺失突变体,这 个突变体群体也称渐次截短文库。

? 外切核酸酶Ⅲ(3’→5’外切核酸酶活性) ? BAL 31核酸酶(3’→5’外切核酸酶活性)

? DNaseI(内切核酸酶活性)

一、外切核酸酶Ⅲ的消化

二、BAL 31核酸酶消化
?主要活性为3’外切核酸酶活性,可从线性DNA两条链的3’端去 掉单核苷酸; ?具有较弱的单链内切核酸酶活性; ?依赖Ca 2+ EDTA可抑制其活性

三、DNaseI消化
内切酶,可优先在嘧啶处水解ds或ssDNA Mg 2+:独立作用于每条DNA链,切点随机 Mn 2+:大致在同一位臵切割dsDNA 产生平端或1-2个核苷酸突出


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