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稀释平板计数法


稀释平板计数操作方法 稀释平板计数操作方法 操作方
实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后, 其中的微生物充分分散成单个细胞, 取 一定量的稀释样液接种到平板上, 经过培养, 由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落, 即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。 统计菌落数, 根据其稀释倍数和取样接种量即 可换算出样品中的含菌数。但是,由于待测样品往往不易完全

分散成单个细胞,所以,长成 的一个单菌落也可能来自样品中的 2—3 或更多个细胞。 因此平板菌落计数的结果往往偏低。 为了清楚地阐述平板菌落计数的结果, 现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数 来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁, 结果需要培养一段时间才能取得, 而且测定结果易受多 种因素的影响,但是,由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息,所以被广泛用于 生物制品检验(如活菌制剂),以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程 度的检测。 实验器材 实验器材 LB 液体、固体培养基 1m1 移液器,平皿,试管,试管架,恒温培养箱等。 实验步骤 实验步骤 1.无菌器材的准备 (1) 无菌培养皿:取培养皿 9 套,包扎、灭菌。 (2) 无菌水:取 6 支试管,分别装入 4.5m1 蒸馏水,加棉塞,灭菌。 2.样品稀释液的制备 (1) 编号 取无菌平皿 9 套, 分别用记号笔标明 10-4、 -5、 -6(稀释度)各 3 套。 10 10 另取 6 支盛有 4.5m1 无菌水的试管,依次标是 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 (2) 稀释 用 1m1 移液器吸取 0.5m1 己充分混匀的菌悬液(待测样品),至 10-1 的试管中,此即为 10 倍稀释。 将 10-1 试管置试管振荡器上振荡,使菌液充分混匀。用 1m1 移液器在 10-1 试管中来回 吹吸菌悬液三次, 进一步将菌体分散、 混匀。 吹吸菌液时不要太猛太快, 吸时吸管伸入管底, 吹时离开液面。混匀后吸取 0.5ml 至 10-2 试管中,此即为 100 倍稀释。……其余依次类推, 整个过程如图所示。 3.平板接种培养 平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。 (1) 浇注平板培养法

1) 取样 用三支 1ml 无菌吸管分别吸取 10-4、10-5、和 10-6 的稀释菌悬液各 1ml,对号放入编好 号的无菌平皿中,每个平皿放 0.2ml。 稀释菌液放入平皿中, 不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀释菌液放入平皿中,这样容易加大同一 稀释度几个重复平板间的操作误差。 稀释度几个重复平板间的操作误差。 2) 倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒人融化后冷却至 45℃左右的培养基约 15 毫 升/平皿,置水平位置迅速旋动平皿,使培养基与菌液混合均匀,而又不使培养基荡出平皿 或溅到平皿盖上。待培养基凝固后,将平板倒置于 37℃恒温培养箱中培养。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加入到培养皿后, 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加入到培养皿后,应尽快倒入融化并己冷 却至 45℃左右的培养基,立即摇匀,否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起,影响计 ℃左右的培养基,立即摇匀,否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起, 数。

(2) 涂布平板计数法: 平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外,还可以用涂布平板的方式进行。 二者操作基本相同,所不同的是后者先将培养基融化后倒平板,待凝固后编号,并于 37℃ 左右的温箱中烘烤 30min,或在超静工作台上适当吹干,然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液 对号接种于不同稀释度编号的平板上, 并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀, 平 放于实验台上 20—30 min, 使菌液渗入培养基表层内, 然后倒置于的恒温箱中培养 24—48h。 较为适宜,如果过少,菌液不易涂布开; 涂布平板用的菌悬液量一般以 0.1ml 较为适宜,如果过少,菌液不易涂布开;过多则在 涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动,不易形成单菌落。 涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动,不易形成单菌落。

实验结果 将培养后菌落计数结果填入下表: 稀释度 1 cfu 数/平板 每 ml 中的 cfu 数 2 10-4 3 平均 1 2 10-5 3 平均 1 2 10-6 3 平均

计数和报告 1.操作方法:培养到时间后,计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察,必要时用放大 镜检查,以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数,计算 处原始样品中每克(或每 ml)中的菌落数,进行报告。 2.到达规定培养时间,应立即计数。如果不能立即计数,应将平板放置于 0-4℃,但不 得超过 24h。 3.计数时应选取菌落数在 30~300 之间的平板,若有二个稀释度均在 30~300 之间时,按 国家标准方法要求应以二者比值决定, 比值小于或等于 2 取平均数, 比值大于 2 则其较小数 字(有的规定不考虑其比值大小,均以平均数报告)。 4.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于 300,则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。如均小于 30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数 有的大于 300,有的又小于 30,但均不在 30~300 之间,则应以最接近 300 或 30 的平均菌落 数乘以稀释倍数报告之。 如所有稀释度均无菌落生长, 则应按小于 1 乘以最低稀释倍数报告 之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 5.不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比(同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接

近),即稀释倍数愈高菌落数愈少,稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象,则应视为 检验中的差错,不应作为检样计数报告的依据。 6.当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限,则应作为一 个菌落计,如存在有几条不同来源的链,则每条链均应按一个菌落计算,不要把链上生长的 每一个菌落分开计数。 如有片状菌落生长, 该平板一般不宜采用, 如片状菌落不到平板一半, 而另一半又分布均匀,则可以半个平板的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数。 7.当计数平板内的菌落数过多(即所有稀释度均大于 300 时),但分布很均匀,可取平 板的一半或 1/4 计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 8.菌落数的报告,按国家标准方法规定菌落数在 1~100 时,按实有数字报告,如大于 100 时,则报告前面两位有效数字,第三位数按四舍五入计算。固体检样以克(g)为单位报告, 液体检样以毫升(ml)为单位报告,表面涂擦则以平方厘米(cm)报告。

每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5


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