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复合酶降解羽毛粉的效果研究


第 35 卷 第 1 期 2007 年 2 月

福州大学学报 (自然科学版 )
Journal of Fuzhou University (Natural Science )

Vol 35 No. 1 . Feb. 2007

文章编号 : 1000 - 2243 ( 2007 ) 01 - 0142 -

05

复合酶降解羽毛粉的效果研究
裴敏雅 , 张 洋 , 靳伟刚 , 叶秀云 , 饶平凡
(福州大学生物工程研究所 , 福建 福州  350002)

摘要 : 运用物理法与酶解法相结合的方法 , 对一种复合酶的酶解效率进行了研究 . 羽毛粉经高温高压处理 后 , 采用不同复合酶浓度和不同酶解时间对羽毛粉样品进行酶解 , 通过测定其中的可溶性蛋白质含量 、 胃蛋 白酶消化率来考察其酶解效率 , 并且对酶解上清液中多肽和氨基酸进行初步的分析 . 研究结果表明 , 该复 合酶在一定的条件下可有效降解羽毛产生的多肽 、 寡肽和游离氨基酸 , 并且酶解上清液中多肽和氨基酸的 分子量均在 6 kDa以下 . 关键词 : 复合酶 ; 羽毛粉 ; 降解 ; 可溶性蛋白 中图分类号 : Q512 文献标识码 : A

Study on the effect of com pound enzym e to hydrolyze fea therm ea l
PE IM in - ya, ZHANG Yang, J I W ei - gang, YE Xiu - yun, RAO Ping - fan N
( Institute of B iotechnology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

角蛋白在自然界中以羽毛 、 、 、 蹄 鳞 毛发以及角质层等形式大量存在 , 其粗蛋白含量在 80%以上 , 各种氨基酸总量在 70%以上 , 是一种营养价值很高的饲料蛋白来源
[1]

交互作用 , 使其有很稳定空间结构而成为一种抗性极强的硬蛋白 , 普通水解酶如胰蛋白酶很难将其降 [2 - 4] 解 . 角蛋白酶是一种复合酶 (由二硫键还原酶和多肽酶组成 ) , 其降解角蛋白分 3 个步骤 , 即变性 作用 、 水解作用和转氨基作用 . 二硫键还原酶首先特异性地作用于角蛋白二硫键 , 使其变性 , 变性角蛋 白在多肽水解酶作用下水解成多肽 、 寡肽和游离氨基酸 , 最后由转氨基作用产生氨气和硫化物而使角 蛋白彻底水解
[5]

氨基酸的组成 , 并对未处理的羽毛粉 、 酶解上清液及酶解残渣进行氨基酸含量的测定 .

1  材料与方法
1. 1   材料

鸭毛由福建省长乐市长鹤羽绒公司提供 ; 复合酶液由福大百特公司提供 ; 凝胶柱 : SuperdexT M
收稿日期 : 2005 - 12 - 22 作者简介 : 裴敏雅 ( 1978 - ) , 女 , 硕士研究生 ; 通讯联系人 : 叶秀云 , 教授 .

Abstract: The efficiency of the compound enzym e app lication in the feathermeal degradation was studied in the paper The physical and enzymolysis technique were found app licable in the p rocess, . which the feather eal was hydrolyzed by compound enzym e w ith different concentration and differ2 m ent tim e after the feathermeal was dealt in high temperature and high p ressure. In order to exp lore the efficiency of the keratin degradation, it is necessary to attain the character of p roduct including p rotein solubility and pep sin digestion rate. In addition, polypep tide and free a m ino acid in the su2 pernatant were p rim arily investigated. The results showed, on this condition the keratin decomposed effectively into polypep tides、oligopep tides and free a m ino acids, and most fraction of molecular weight distribution in the supernatant were below 6 kDa. Keywords: compound enzyme; feathermeal; degradation; p rotein solubility

. 但由于二硫键 、 氢键 、 盐键等的

. 本课题研究一种复合酶对羽毛粉进行酶解的工艺条件 , 分析了酶解上清液中多肽和

第 1期

裴敏雅 , 等 : 复合酶降解羽毛粉的效果研究

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Pep tide 10 /300 GL , 瑞典 Pharmacia公司 ; 缓冲液 : pH 8. 3, 0. 01 mol/L PB S + 0. 25 mol/L NaC l溶液 ; 所

用试剂均为分析纯 . 1. 2   仪器
B I F微生物玻璃发酵罐 (上海理工大学高机生物工程有限公司 ) , 高效液相色谱仪 ( 126 - solvent O module及 166 - detector, 美国贝克曼公司 ) , 高速离心机 ( J - 25 I型 , 美国 B ECK MAN 公司 ) , 可见紫外

分光光度计 ( Spectrum 752 型 , 上海光谱仪器有限公司 ) , 恒温气浴摇床 ( CHA - S 型 , 江苏常州国华仪 器厂 ) , PH 计 ( PHA - 10A 型 , 萧山市科学仪器厂 ) , 电热恒温水槽 ( DK - 8D 型 , 上海精宏实验设备有 限公司 ) .
1. 3   实验方法 1. 3. 1   羽毛样品的制备

长鹤羽绒公司提供的鸭毛 , 经冲洗 、 、 干燥 粉碎即成羽毛粉 . 1. 3. 2   酶液添加量试验 复合酶液的酶活测定为 300 U /mL ; 鸭毛粉润湿后 121 ℃ 处理 60 m in, 60 ℃ 烘干过夜 ; 称取 5 g 烘 干鸭羽毛粉 , 分别添加 10、20、30、40、50、60、70 mL 复合酶液 , 再添加自来水至总体积 100 mL , 充分 润湿羽毛 , 40 ℃ 反应 48 h, 取样测定反应液中可溶性蛋白含量 . 1. 3. 3   酶解时间试验 200 g鸭毛粉用自来水润湿 , 121 ℃ 处理 60 m in, 添加复合酶液 800 mL ( 450 U /mL ) , 再添加自来水 至总体积 3 000 mL , 40 ℃ 反应 68 h, 按时间取样测定反应液中可溶性蛋白含量 . 1. 3. 4   酶解上清液的理化分析 根据确定的酶液添加量和酶解时间酶解 200 g鸭毛粉 , 离心取上清液 , 4 ℃ 保存待用 ; 取适量 4 ℃ 保存的酶解上清液于 4 ℃, 10 000 r/m in离心 10 m in, 经 0. 22μm 微孔滤膜过滤后 , 取 10μL 直接上样 T M Superdex Pep tide 10 /300 GL 色谱柱 , 以含 0. 25 mol/L NaCl的 0. 01 mol/L , pH 8. 3 PBS缓冲液为洗脱 液 , 流速为 0. 25 mL /m in, 检测波长为 228 nm , 根据酶解液组分分布曲线 , 收集各峰组分 , - 20 ℃ 保存 备用 . 1. 3. 5   水溶性蛋白含量的测定
[6] 采用 Folin - 酚试剂法 (Low ry法 )测蛋白含量 , 以牛血清白蛋白为标准蛋白 , 测定波长为 700 nm , 计算水溶性蛋白含量 (mg /mL )及酶解率 ( % ) , 绘制曲线 . 蛋白含量的计算方法如下 : [ (样品 OD 值 - 空白 OD 值 ) - 0. 0133 ] × 稀释倍数 蛋白质含量 = 0. 0026 酶解率的计算方法如下 : 酶解液中水溶性蛋白含量 ( g) 酶解率 ( % ) = × 100% 羽毛样品中总蛋白质含量 ( g)

1. 3. 6   羽毛氨基酸组成的测定

采用 W aters公司的 ACCQ - Tag① 的方法对未处理羽毛粉 、 酶解上清液及酶解残渣进行氨基酸含量 的分析 . 1. 3. 7   体外消化率的测定 根据 GB / T 17811 - 19999, 采用胃蛋白酶盐酸溶液进行体外消化率测定 .

2  结果与分析
2. 1   蛋白质含量标准曲线

蛋白质含量标准见图 1.
① W aters液相色谱通讯增刊 ——ACCQ. Tag专集 [ C ]. W aters中国有公司 , 1997. —

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2. 2   酶液添加量试验

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在一定的时间和温度的条件下 , 以不同浓度的复合酶液对羽毛粉酶解 , 结果见图 2. 从图 2 可以看 出 , 当添加 30 ~40 mL 复合酶液时 , 酶解液中可溶性蛋白含量较高 , 其酶解率达到 21% ~23% , 随着复 合酶液继续添加 , 酶解率上升缓慢 , 因此在酶解鸭毛粉制备可溶性蛋白液过程中 , 复合酶液的最适添加 量为 6 ~8 mL 处理 1g鸭毛粉 (即 1 800 ~2 400 U 复合酶液处理 1 g鸭毛粉 ) .

2. 3   酶解时间实验

在一定的浓度和温度条件下测定酶解过程中不同时间酶解液中的可溶性蛋白含量 , 结果见图 3. 从图 3 可以看出 , 经 28 ~32 h酶解 , 溶液中可溶性蛋白含量较高 , 其酶解率达到 52% ~55% , 随着 酶解时间的增加 , 酶解率上升缓慢 , 因此在酶解鸭毛粉制备可溶性蛋白液过程中 , 酶解的最适时间为 28 ~32 h. 2. 4   酶解上清液组成分析 酶解上清液采用 Superdex
T M

Pep tide 10 /300 GL 色谱柱进行分离 , 结果见图 4. 并计算图中各峰面积

占总峰面积的比例 , 结果见表 1.

图 3  酶解鸭毛粉时间试验
Fig 3  Effects of ti e on feather degradation . m

表 1  各色谱峰峰面积比 Tab. 1  The area ra te of peaks of chroma togram
1 2 3 4 5 8 698% . 6 4 374% .

图 4  SuperdexTM Pep tide 10 /300 GL 色谱图
Fig 4  Chromatogram of Superdex . 10 /300 GL
T M

12 147% 27 643% 36 599% 10 167% . . . .

Pep tide

  : 注

1~5表示多肽 ; 6表示氨基酸

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裴敏雅 , 等 : 复合酶降解羽毛粉的效果研究

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   将图 4 的色谱图与 Super Pep tide 10 /300 GL 标准图谱比较可以得知 , 酶解上清液中的组分分子量 基本都在 6 kDa以下 . 各峰面积占总峰面积的百分比见表 1, 其中 6 号峰为氨基酸 , 其峰面积占总峰面 积的 4. 374% ; 1 号至五号峰为多肽 , 多肽的峰面积占总峰面积的 95. 254% ; 多肽与氨基酸占到总峰面 积的 99%以上 . 这说明鸭毛角蛋白经过复合酶液的酶解成为多种可溶的多肽与氨基酸 , 大分子量的蛋 白已不存在 .
2. 5   羽毛粉与酶解液残渣的理化分析

对试验中所用的鸭毛进行成份分析 , 结果见表 2. 从表 2 可以看出鸭毛的粗蛋白含量高达 87% , 粗 蛋白与水分的含量占鸭毛的 99%. 经离心分离得到的酶解残渣中可溶性蛋白含量占 17. 96% , 粗蛋白含量大于 80% , 胃酶消化率也 大于 80%. 将酶解残渣与进口鱼粉
[7]

进行氨基酸组成 、 粗蛋白含量及胃酶消化率的比较 , 结果见表 3. 表 2  鸭毛成分分析

Tab. 2  The ana lysis of con ten t of fea ther
w粗蛋白 w粗脂肪 w粗纤维 w水份 w灰份

87%

0. 3%

< 0. 1%

12%

0. 8%

表 3 酶解残渣与进口鱼粉的比较
Tab. 3  Com pare of draff of hydrolysis w ith i port f ishm ea l m
氨基酸
w (A sp ) w ( Ser) w ( Glu) w ( Gly) w (H is) w (A rg) w ( Thr) w (A la) w ( Pro ) w ( Cys) w ( Tyr) w (Val) w (M et) w (Lys) w ( Ile ) w (Leu) w ( Phe) w粗蛋白

(% )

澳大利亚鱼粉
7. 6 3. 6 10. 2 5. 1 2. 7 6. 0 3. 9 5. 0 3. 4 1. 0 2. 7 4. 0 2. 3 6. 9 3. 6 5. 9 3. 3 73. 2 (78. 9 + 2. 2)

丹麦鱼粉
6. 7 3. 6 10. 2 5. 1 1. 9 5. 9 3. 6 4. 8 3. 2 0. 8 2. 3 3. 8 2. 2 6. 2 3. 4 5. 6 3. 0 72. 9 (93. 9 + 1. 1)

秘鲁鱼粉
6. 2 3. 0 9. 4 4. 8 2. 3 5. 1 3. 2 4. 6 3. 5 0. 7 2. 3 3. 7 2. 0 5. 5 3. 5 5. 3 2. 9 70. 2 (76. 8 + 0. 2)

鸭毛酶解残渣
7. 15 11. 00 9. 35 9. 03 0. 71 5. 85 4. 37 4. 48 10. 56 6. 69 5. 45 7. 14 0. 26 0. 91 4. 51 7. 88 4. 64 ( 82 + 0. 4 ) (88. 5 + 1. 8)

胃酶消化率 / %

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   由表 3 可以看出酶解残渣中组氨酸 、 赖氨酸及蛋氨酸含量较低 , 这与文献报道的羽毛粉氨基酸组 [8] 成不平衡 , 组氨酸 、 赖氨酸及蛋氨酸含量较低一致 . 除了上述 3 种氨基酸外 , 天冬氨酸 、 谷氨酸 、 精 氨酸 、 丙氨酸 4 种氨基酸含量与进口鱼粉的含量一致 , 其余 10 种氨基酸的含量均远高于进口鱼粉 , 并 且粗蛋白含量与胃酶消化率也高于进口鱼粉 . 因此 , 酶解残渣可烘干粉碎制成优质羽毛粉 , 并可以代替 饲料添加剂中的鱼粉 .

3  结语
1 ) 采用高温处理法与复合酶酶解法相结合的方式对鸭毛粉进行降解的适宜工艺条件为 : 鸭毛粉经 121 ℃ 高温处理 60 m in后 , 以每克羽毛添加 1 800 ~2 400 U 的复合酶浓度 , 在 40 ℃ 条件下酶解 32 h, 酶 解率达到 55% , 具有较好的酶解效果 . 2 ) 通过对酶解上清液进行分析表明 , 其中绝大部分为分子量在 6 kDa 以下的多肽和氨基酸 , 可分 别被加工成高品质的氨基酸产品与多肽产品 . 3 ) 酶解残渣中富含 17 种氨基酸 , 粗蛋白含量大于 80% , 胃酶消化率也大于 80%. 其粗蛋白含量

与胃酶消化率均高于进口鱼粉 , 因此酶解残渣可制成优质羽毛粉 , 替代饲料添加剂中的鱼粉 . 所以对酶 [9] 解残渣进一步利用 , 可作为一种直接的 , 高品质的动物饲料蛋白源 . 参考文献 :
[ 1 ] 沈银书 , 霍启光 . 羽毛粉的营养价值及其影响因素 [ J ]. 粮食与饲料工业 , 1996 (7) : 20 - 23. [ 2 ] Friedrich A B , Antranikian G Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans, a novel thermophilic anaerobic species . of the order Thermotogales[ J ]. App l Environ M icrobiol, 1996, 62: 2 875 - 2 882. [ 3 ] Kunert J. Keratin decomposition by dermatophytes[ J ]. Z F A llg M ikrobiol, 1973, 13: 489 - 498. [ 4 ] Kaluzew ska M , W aw rzkiew icz K, Lobarzew ski J. M icroscop ic exam ination of keratin substrates subjectedto the action of the enzymes of strep tomyces fradiae [ J ]. Int B iodeterior, 1991, 27: 11 - 26. [ 5 ] 涂国全 , 于 静 . 一株分解羽毛角蛋白的弗氏链霉菌变种的初步鉴定 [ J ]. 江西农业大学学报 , 1994, 16 ( 4) : 399 - 403. [ 6 ] Lowery O H. Protein measurement w ith the Folin phenol reagent[ J ]. J boil Chem istry, 1951, 193: 265. [ 7 ] A llan G L , Parkinson S, Booth M A , et a l Rep lacement of fish meal in diets for Australian silver perch, B idyanus bidyanus: . I digestibility of alternative ingredients[ J ]. Aquaculture, 2000, 186: 293 - 310. . [ 8 ] Hahn H. Anim al meal: p roduction and determ ination in feedstuffs and the origin of bovine spongiform encephalopathy[ J ]. Natur issenschaften, 1999, 86: 62 - 70. w [ 9 ] Latshaw J D. Processing of feather to maxim ize its nutritional value for poultry [ J ]. Ani al Feed Sci Technol, 1994, 47: 179 m - 188.


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