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高等植物启动子克隆方法的研究进展


生物技术通报
技术与方法 ? ?

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2007 年第 3 期

高等植物启动子克隆方法的研究进展
王莹
摘 要:

韩烈保

曾会明
100083)

( 北京林业大学草坪研究

所, 北京

启动子是植物基因工程中一个重要的研究对象, 文章简述了启动子的定义、 分类和启动子的研究策略, 从组

成型启动子、 组织特异型启动子和诱导型启动子 3 个方面介绍了它们的功能和结构的研究现状。启动子的克隆对于构建基 因工程载体, 表达目的蛋白有着重要的意义。 着重介绍了启动子克隆的方法, 从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到

PCR 方法的应用, 及此后相继出现的一些基于 PCR 法的克隆启动子技术, 像 I-PCR , P-PCR , SSP-PCR , YADE, TAIL-PCR
等, 为克隆启动子提供了更可靠, 更合理的方法。 关键词: 启动子 基因工程 克隆

PCR

Advances on Studies of Plant Pr omoter s
Wang Ying Han Liebao Zeng Huiming
( Turfgrass Institute of Beijing Forestry University, Beijing 100083)

Abs tra ct :

As the promoter is an important research object in the plant genetic engineering, the article sketches its

definition , classification and research tactics.Meanwhile, the function and structure of the promoter are emphasized in respect of constitutive type , organ-specific type and inducible type.Promoter is an important cis-acting element , it is also an important element of gene engineering expression vectors.The way of promoter cloning is important for constricting gene engineering vectors and expressing the aim proteins.From the frequently used way that applying probe vectors for choosing promoter to the using of PCR , there were lots of ways for promoter cloning.Afterwards, a series of techniques based on PCR for promoter cloning such as I-PCR , P-PCR , SSP-PCR , YADE, TAIL-PCR were developed in succession. They offered more reliable and reasonable ways of cloning the promoter. Ke y words : Promoter Genetic engineering Cloning PCR

启 动 子 ( promoter ) 是 一 段 提 供 RNA 聚 合 酶 识 别 和 结 合 的 DNA 序 列 , 它 位 于 基 因 的 上 游 , 其 长 度 因 生 物 种 类 而 异 , 一 般 不 超 过 200bp 。 一 旦 RNA 聚 合 酶 定 位 并 结 合 到 启 动 子 序 列 上 , 即 可 启 动 转 录 [1]。 根 据 真 核 基 因 编 码 的 产 物 和 RNA 聚 合 酶 的 种 类 可 把 真 核 生 物 的 启 动 子 分 为 三 类 : rRNA 基 因 启 动 子 ( I 型) 、 mRNA 基 因 启 动 子 ( II 型 ) 和 tRNA 基 因 启 动 子 ( III 型 ) 。 I 型 启 动 子 和 III 型 启 动 子 位 于 转 录 起 始位点的上游, 结构相对简单。高等植物启动子属 于Ⅱ型启动子, 该 型启动子相对复杂 , 大 多 数 位 于 转录起始位点的下游。 物基因工程中常用的启动 植 子按其功能及作用方式可将它们分为三类: 组成型

启动子、 导型启动子、 织特异型启动子。 诱 组


1.1

启动子结构和功能的研究现状
启动子功能和结构研究的策略
目前, 研究启动子功能的方法主要有瞬间转化

分 析 、 变 分 析 , 以 及 近 年 来 发 展 起 来 的 RNA 干 涉 突 技术等。

1.1.1

转化分析

某些基因将其启动子序列连接上

报告基因( Report gene) , 通过载体主要是质粒介导转 化 植物细胞, 分析检测 转基因植物中报告 基 因 的 表 达, 结合构建 不同的缺失( deletion) 序列, 从而 确定负 责组织特异性表达的作用序列和调控元件。 研究较多 的 有 CaMV35S 启 动 子 [2] 和 农 杆 菌 ( Agrobacterium) 中

收稿日期: 2006-12-26 基金项目: 国家转基因植物研究与产业化专项项目( J2002-B-006 ) ; 教育部“ 新世纪优秀人才” 支持计划 作者简介: 王莹( 1982- ) , 女, 在读硕士研究生, 研究方向: 草坪草生物技术, E-mail:wangyinghouzi@163.com 通讯作者: 韩烈保( 1965- ) , 男, 博士生导师, 研究方向 :草坪草育种, Email:hanlb@tom.com, 电话: 010-62337982

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质粒有关基因启动子。

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物中特异表达, 从而克服了组成型启动子启动的外源 由于载体构建和转化基因 基因在受体植物中非特异性的持续、 高效表达所造成 浪费, 而在需要该基因大量表达的特定组织部位则因 例如: 种子特异性启 表达量过低又达不到预期效果[6]。 动 子 ( nap inB promoter) , 甘 蓝 型 油 菜 BcNA1 基 因 启 动子和玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子被分别转入
9] 烟 草 获 得 转 基 因 植 株 [7~ 。

1.1.2

瞬间表达分析

检测启动子的特性周期长, 费时费力, 近年来, 人们 又发展了启动子的瞬间表达分析法。 目的启动子 即 连上一种易检测的报告基因并转化到受体中, 观察 报告基因的表达情况, 从而确定启动子的活性。 : 如 钟 蓉 等 利 用 基 因 枪 转 化 法 将 连 接 有 GUS 基 因 的 蕃 TA29 启 动 子 转 入 烟 草 、 茄 花 药 , 证 明 TA29 启 动 子在烟草和蕃茄花药中具有时空特异性 。本实验
[3]

虽然组织特异性启动子一直以来都是植物基 维 因工程中研究的重点和难点, 但在根、 管束和韧 皮部特异表达启动子研究中还是取得了很大进步。

室 已 经 利 用 基 因 枪 转 化 法 将 连 接 有 GUS 基 因 的

35S 启 动 子 转 入 到 日 本 结 缕 草 中 , 并 获 得 了 转 基 因
植株 。
[4]

1.4

诱导型启动子的功能和结构
所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或

1.1.3

点突变分析

点突变分析是研究启动子的

化学刺激下, 此种类型的启动子可以大幅度地提高 基因的转录水平, 因此, 亦称为诱导型调节序列或 诱 导 型 增 强 子 ( inducible enhancer ) 。 该 类 启 动 子 的 共同特点如下 : ①启 动 子 的 水 利 化 受 到 物 理 或 化 学 信 号 的 诱 导 ; ②启 动 子 的 分 子 结 构 都 具 有 增 强 子 , 沉默子或类似功能 的 序 列 结 构 ; ③感 受 牧 民 性 诱 导 的序列都必 须有明显的专一性; ④ 一部分 该 类 型 的 启 动子同时具组织特异 性表达特点。该类启 动 子 通 常以诱导信号 命名, 可分为光诱导表 达基因启动子、 热诱导表达基因启动 子、 创伤诱导表达基因 启动子、 激 素 诱 导 表 达 基 因 启 动 子 等 。 Tada 等 [10]把 LHCPⅡ 基 因 与 GUS 连 接 形 成 嵌 合 体 转 化 水 稻 , 黑 暗 中 生 长的植株检测不到表达活性, 但在光照后诱导表 马 达 。 此 外 , 泛 素 核 糖 体 蛋 白 融 合 基 因 ubi3 、 铃 薯

特定核苷酸序列常用的方法, 一般是利用转座子插 入突变或者是限制性酶切除去某一特定启动子元 件, 并把该缺失启动子转化植物来确定特定序列的 功能。此方法是最常用的研究启动子的方法, 已见 报 道 的 启 动 子 功 能 序 列 如 : TATA 序 列 、 CAT 序 列 和 CAAT 序 列 等 都 是 运 用 此 方 法 研 究 得 到 。

1.2

组成型启动子的功能和结构特征
该类型启动子称之为非特异性表达组成型启

动 子 ( constitutive promoter ) 由 这 类 启 动 子 控 制 的 结 构基因的表达大体恒定在一定水平上, 在不同组织 部位表达水平也没有明显差异。其特点是: 表达具 持 续 性 , RNA 和 蛋 白 质 表 达 量 也 是 相 对 稳 定 ; 不 表 现出时空特异性, 也不受外界因素的诱导影响。从 结构上看, 大多数组成型启动子转录起始位点上游 几 百 个 核 苷 酸 处 , 存 在 有 六 聚 体 花 纹 ( hexamer

pin2 基 因 启 动 子 都 属 于 受 到 创 伤 诱 导 时 才 能 启 动
下 游 基 因 表 达 的 启 动 子 [11]。

motifs ) 序 列 TGACTG。 目 前 使 用 最 广 泛 的 两 个 组 成
型 启 动 子 是 烟 草 花 叶 病 毒 ( CaMV) 35S 启 动 子 和 来 自 根 癌 农 杆 菌 Ti 质 粒 T-DNA 区 域 的 胭 脂 碱 合 成 酶 基 因 启 动 子 ( Nos ) 和 章 鱼 碱 合 成 酶 基 因 启 动 子 ( Ocs ) 。 另 外 , 水 稻 Actl 启 动 子 序 列 结 构 也 研 究 得 比较清楚 。
[5]



启动子的克隆方法
随着基因工程的发展, 常常需要构建一种能高

水平表达异源蛋白质的表达载体。 动子对外源基 启 因的表达水平影响很大, 是基因工程表达载体的重 要元件。 此, 研究启动子的克隆方法, 对研究基因 因 表 达 调 控 和 构 建 表 达 载 体 至 关 重 要 [12]。近 年 来 有 许 多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功, 本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述, 以 期促进对启动子分离技术的应用。

1.3

组织特异型启动子的功能和结构
组织特异性启动子也称之为器官特异性启动

子 ( organ-specific promoter ) 。在 这 些 启 动 子 调 控 下 , 基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织 部位, 并表现出发育上的时空特异性。这种类型的 启动子最大优点是: 它所启动的外源基因在受体植

2.1

利用启动子探针载体筛选启动子
利用启动子探针载体筛选启动子是一种常用

的方法。 是利用缺失启动子的产物易检测的报告 它

2007 年第 3 期

王莹等: 高等植物启动子克隆方法的研究进展

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基因, 构建启动子探针质粒载体来克隆有启动功能 的 DNA 片 段 。 一 般 程 序 是 : 先 选 用 一 种 适 当 的 核 其 酸 内 切 限 制 酶 , 消 化 切 割 染 色 体 DNA; 接 着 将 切 割 产 生 的 DNA 限 制 片 段 群 体 与 一 种 无 启 动 子 的 质 粒 载体重组, 并按照设计的要求使克隆的片段恰好插 在紧邻报告基因的上游位置; 随后再把重组混合物 转化给寄主细胞, 构成质粒载体基因文库, 并检测 报告基因的表达活性。 最 早 由 Rachael 等
[13]

DNA 连 接 酶 进 行 自 连 接 , 产 生 环 状 DNA 片 段 ; 以 环
化产物为底物, 用根据已知片段设计的反向引物进 行 PCR 扩 增 , 从 而 得 到 含 有 未 知 片 段 的 扩 增 产 物 。 韩 志 勇 等 [21] 以 I-PCR 技 术 为 基 础 克 隆 了 转 基 因 水 稻 的 外 源 基 因 旁 侧 序 列 。李 竹 红 等 [22]利 用 改 进 的 反 向 PCR 方 法 克 隆 了 Tc1 转 座 子 左 侧 反 转 重 复 序 列 的 旁 侧 序 列 。 王 新 国 等 [23] 采 用 衔 接 头 PCR 方 法 , 从 胡 萝 卜 基 因 组 DNA 中 成 功 地 克 隆 到 一 个 新 的 sⅡ 基 因 启 动 子 片 段 。

在大肠杆菌中以四环素抗

性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒 其后 pBRH3B, 并克隆了一些原核和真核启动子片段。

2.3.2

P-PCR

P-PCR 是 由 Jones 等 [24] 提 出 的 利 用

末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状 单链模板, 有效增强了引物与模板结合的特异性。 反应需要 3 个根据已知序列设计的引物, 3 个引物 在已知序列内呈线性排列, 其中第 3 个引物可作为 接头使用, 可与已知序列互补配对形成锅柄状单链 模板。

Donna 等

[14]

以 氯 霉 素 抗 性 基 因 作 为 报 告 基 因 , Fodor

等 [15] 以 大 肠 杆 菌 LacZ 为 报 告 基 因 , 构 建 了 酵 母 启 动 子 探 针 质 粒 并 克 隆 了 一 些 启 动 子 片 段 。李 维 等 [16] 曾 构 建 了 含 有 hph 抗 性 基 因 的 启 动 子 探 针 型 载 体

pSUPV8 , 直 接 在 大 肠 杆 菌 中 分 离 黄 抱 原 毛 平 革 菌
基因的启动子。该方法不需要知道具体基因的序 列, 可随机筛选启动子, 避免了引物设计, 能获得大 量的启动子片段。

Jones 等 [25]利 用 改 进 的 P-PCR, 在 形 成 panhandle
结 构 之 前 3′ 端 连 上 ddCTP , 使 引 物 错 配 的 机 率 减 末 少 , 特 异 性 增 加 。 P-PCR 是 目 前 能 够 扩 增 距 已 知 序 列 最 远 的 未 知 DNA 序 列 的 方 法 , 有 很 高 的 特 异 性 。

2.2

利 用 PCR 技 术 克 隆 启 动 子
根据发表的基因序列, 设计引物, 克隆基因的

2.4

启 动 子 , 由 于 PCR 法 简 便 快 捷 , 近 年 来 人 们 较 多 采 用此方法克隆基因启动子。 苏宁等
[17]

YADE 法 端 Prashar 等 [26] 在 扩 增 cDNA3′ 时 采 用 “ ” 接 Y 形

头, 以减少接头引物的单引物扩增。其原理是接头 引物处于“ ” 头的 2 个分叉单链上, 序列与接头 Y 接 一样, 只有与特异引物引导合成了接头的互补序列 后, 接头引物才能退火参与扩增。

根 据 已 报 道 的 水 稻 叶 绿 体 16S rRNA

启 动 子 基 因 序 列 设 计 5′ 动 子 序 列 的 引 物 , 以 水 稻 启 叶 绿 体 DNA 为 模 板 , PCR 扩 增 出 16S rRNA 基 因 启 5′ 动 子 区 的 片 段 。彭 仁 旺 等
[18]

根据已报道的序列

YADE 法 延 伸 的 起 始 片 段 可 以 是 基 因 组 DNA
片 段 , 也 可 以 是 cDNA 片 段 , 在 延 伸 cDNA 片 段 时 , 设计的引物需要避开内含子和外显子的边界, 在内 含 子 的 位 置 未 知 的 情 况 下 , 可 考 虑 多 合 成 1 ̄2 条 特 异引物, 以提高扩增未知片段的机率。该方法假阳 性低、 率高, 理论上能扩出所有目的片段。 效

设 计 引 物 , 通 过 PCR 扩 增 , 从 烟 草 中 克 隆 了 花 药 特 异 表 达 基 因 TA29 的 启 动 子 。蒋 浩 等 [19]用 PCR 方 法 从 美 洲 黑 杨 基 因 组 DNA 中 扩 增 到 了 BSA 基 因 启 动 子片段。 上 述 的 PCR 方 法 简 便 、 捷 、 作 简 单 , 是 人 快 操 们转为广泛使用的技术。

2.5

TAIL- PCR
很 早 就 有 用 随 机 引 物 的 PCR , 但 由 于 无 法 有 效

2.3

环 状 PCR 环 状 PCR 包 括 I-PCR ( Inverse-PCR ) 和 P-PCR ( Panhandle-PCR ) 。 这 2 种 PCR 都 是 根 据 一 端 已 知

地控制由随机引物引发的非特异产物的产生, 所以 一直未能广 泛应用。近年来由 Liu 等 [27]设 计的 TAIL-

序 列 设 计 的 嵌 套 式 引 物 进 行 PCR 。

PCR ( Termal Asymmetric Interlaced PCR ) 又 叫 热 不
[20]

2.3.1

I-PCR

I-PCR 是 1988 年 由 Triglia

最早提

对 称 交 错 PCR , 则 解 决 了 这 个 问 题 。 后 来 有 研 究 表 明 , 经 改 良 过 的 TAIL-PCR [28] 成 功 地 从 突 变 体 中 克 隆到外源插人基因的旁侧序列, 从而为启动子的克

出 的 一 种 基 于 PCR 的 改 进 的 染 色 体 步 行 方 法 。 I-

PCR 的 实 验 程 序 包 括 , 基 因 组 DNA 经 酶 切 后 用 T4

100
隆提供了有效的新方法。

生物技术通报 Biotechnology Bulletin

2007 年第 3 期

的 PCR 步 行 技 术 , 能 成 功 地 克 隆 到 T-DNA 区 的 旁 侧序列, 有助于分析突变体中突变区序列。 随着分子生物学、 传学和生物信息学的高速 遗 发展, 将有更多的启动子序列得到分析, 各顺式作 用元件的功能也会逐渐明确。 织特异型、 导型、 组 诱 双向和串联等启动子应用技术的成熟将有力推动 植物基因工程的进步。可以预言, 对植物启动子的 深入研究和正确应用一定会给人类生活带来不可 估量的作用。
参考文献

Gento 等

[29]

曾用构建的含有潮霉素抗性基因

( hph ) 的 双 元 表 达 载 体 pBIG2RHPH2 转 化 真 菌 , 然 后 利 用 TAIL-PCR 法 克 隆 得 到 的 真 菌 转 化 子 基 因 组 DNA 的 T-DNA 插 人 区 的 旁 侧 序 列 并 取 得 了 成 功 。 TAIL-PCR 不 需 要 PCR 前 的 任 何 DNA 操 作 , 避 免了环化和连接, 速度快, 特异性强, 效率高, 灵敏, 在分子生物学研究的各个领域都有广泛的应用。



问题与展望
近 20 年 人 们 在 启 动 子 研 究 方 面 进 行 了 大 量 的

工作, 不仅克隆到数量丰富的启动子, 而且对其结 构和功能有了一定的认识。 从遗传信息到基因的 但 表达是一个十分复杂的过程, 还有许多问题有待解 决。基因表达与否以及表达时间、 达部位需要启 表 动子上的顺式作用元件与相应的转录因子的协同 作用。从植物中已知的启动子分析, 组织特异性及 诱导型启动子的顺式作用元件有一定的保守性, 如
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

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B-box 是 种 子 特 异 启 动 子 的 高 度 保 守 区

[30]

, G-box

32] 通 常 受 光 敏 色 素 A 诱 导 , 参 与 多 种 信 号 调 节 [30~ 。

而且, 启动子驱动基因表达通常需要两种或两种以 数 上的顺式元件, 这些元件的种类、 量以及彼此之 间的顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转 录程度。如果能发现其中的规律, 将会对基因表达 的调控取得突破性进展。另外, 基因的特异性表达 不仅包括在特定时期激活某些基因的表达, 还涉及 到在其他组织器官或发育时期抑制某些基因的表 达, 对抑制子的研究将使人们更好地理解基因表达 的调控过程。 目前, 启动子克隆的方法种类繁多, 进展迅速。 启 动 子 克 隆 方 法 绝 大 多 数 是 建 立 在 PCR 的 基 础 上 的染色体步行技术, 因而利用启动子克隆的方法不 仅可以克隆到基因的启动子, 同时还可以用于克隆

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