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糖化酶的生产流程设计方案


糖化酶的生产流程设计方案 糖化酶即葡萄糖淀粉酶(1 ,4 - α - 葡聚糖葡聚糖水解酶, EC. 3. 2. 1. 3) ,是淀粉糖化工艺的主要酶类,被广泛地应用于 食品、医药、发酵等工业。目前,糖化酶的生产菌种主要为 黑曲霉。根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同,工业 生产中,糖化酶的发酵生产水平在35 000~55 000UPmL 不等。 糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪90 年 代初,液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。液体发酵 工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升 了糖化酶的发酵生产水平。但现有糖化酶发酵生产技术共同 存在不足之处,其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一 个较突出的问题,如实验室的种子制备需要15d 以上,发酵周 期通常 200h 以上。 生产流程图

一、 试验菌种的分纯

1、

培养基

(1) 固体培养基,察氏培养基+1%酵母膏+1%蛋白胨; (2)初筛培 养基,玉米粉:麸皮:米糠:硫酸胺=7:3:2:0.16 (3)诱变后 培养基,玉米粉:麸皮:米糠:硫酸胺=8:3:1.5:2:0.16,水 80ml。 (2) 原料:玉米粉、麸皮等 (3)菌种分纯 将麸皮采集菌种取出一部分,置入装有 10mL 生理盐水和若干玻 璃珠的小三角瓶内,振荡 15 分钟,将上清液一次稀释成 10-1、10-2、 10-3,各取 0.1mL 做平板划线,29℃培养 5~6 天,分别挑取单个菌落 接入斜面,29℃培养一周。 以大连某厂的生产用菌 B-11 为对照,对分离菌株做摇床发酵试 验,96h 后测定糖化力,配合镜检,确定诱变的出发菌株。 二、试验菌株的诱变 用生理盐水洗下成熟出发株的孢子、倒入 5mL 麦汁种 1%酵母 膏的三角瓶中,振荡 1.5h,使孢子活化,后 3500r/min.离心分离 15 分钟,用 pH7.2 磷酸缓冲液洗涤一次,再用缓冲液 5ML 洗转入小三角 瓶内(内有数枚无菌玻璃珠),振荡 10 分钟,使孢子分散均匀,过 滤,制成单孢子悬浮液,将浓度调至 106 个/ml 取 10ml 孢子悬浮液于 9cm 平板中,紫外线(UV)照射诱变 2 分钟(避光操作),紫外线动率 15W,室温,搅拌,照射距离 30cm。 向经紫外线处理的菌液中加入硫酸二乙酯(DES)稀液(原液

1ml,95%乙醇 4ml 配制)0.1ml,32℃恒温处理 15 分钟,不断摇动 平皿,处理后立即稀释至 10-2、10-3(中止反应),各取 0.1~0.2ml 涂平板,29℃培养 5 天后挑取单菌接入试管。 摇床发酵试验,优选出糖化力高的新菌株 UD-7 等。

三、糖化酶的制备 (一)材料:菌种:黑曲霉 仪器:恒温培养箱离心机水浴锅恒温液体振荡 培养器小型液体发酵罐分光光度计等 试剂:链霉素0.1%苯甲酸钠乳酸氢氧化钠硫酸 铵等 (二)设备 LRH-250 型生化培养箱 上海一恒科技有限公司; TGL-16C 型台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂; 1086型精密水浴锅 德国GFL公司;HYG-II型迴转式恒 温调速摇瓶机 上海新星自动化控制设备成套厂;UV2100 型紫外分光光度计 UNICO(上海)仪器公司;LS350L 型立式压力蒸气灭菌锅 上海医用核子仪器厂; MP2000D 型电子天平 精科仪器(上海)有限公司;DG2B 多功能恒温箱 上海医疗器械修造厂;超净工作台 苏净集团安泰公司。 (三)方法

液体深层发酵 工艺流程:试管斜面菌种一种子扩大培养一液体深 层通风发酵一过滤一离心一干燥一粗酶制剂一酶活测定 配方:斜面种子培养基:蔗糖30g硫酸铵3g磷酸 氢钾lg硫酸镁0.5g硫酸铁0.Olg水1000ml琼脂2% 液体摇瓶扩大培养基:玉米面4%。豆饼粉3% 麦麸1% Kel O.5g水lO00ml 自然PI-I通风 恒温液体深层通风发酵培养基:玉米粉10% 豆饼 粉4% 麦麸l% 水lO00ml PH4.5 1.粗酶提取 发酵液一过滤一盐析一固形物一烘干一加入淀粉添 充剂一磨粉一粗酶制剂。 2.酶活力测定 酶活力测定方法 (一)钢圈法:5ml 3% 琼脂倒皿一再加5ml 可溶性淀粉与3% 琼脂一放入三个灭过菌的钢圈分 别滴人不同浓度的酶液一定期测定透明圈直径。 (二)比色法:lOml 20% 可溶性淀粉 5ml柠 檬酸PH4.8 (对照不加酶液。处理加lm1) 加lml 10%NaOH终止反应,对照补加lml酶液一滤纸过渡一 比色。 四、结果 与分析

(一)结果 1.钢圈实验结果如下表:

2.DNS 测定结果如下表

(二)分析 用液体深层发酵生产糖化酶,由于黑曲霉具很强的抗污染力,生产力 强,易培养,所以菌种培养条件一般很好控制,不会受到污染,而发 酵条件难以控制。这正是提高酶活的关键。据中科院研究认为,酶的 形成时刻与培养时间无关, 而与培养基的PH变化有关, 只有当PH从3. 0 回升时才能开始检测出酶活力,PH回升到4.5以后酶开始大量形成。 五、包装与保存 (一)保存

将用容器装好的食品级糖化酶放入钴源辐照室的某一位置, 根据该位 置剂量率的大小,来确定辐照时间,使吸收剂量控制在1000-1 0000戈瑞之间。 辐照后的糖化酶制剂放在25℃以下的温度条件 下贮藏一年,活性保存率仍在90%以上,该发明使食品级糖化酶不 需加工成粉剂贮存,而是直接贮存,以备使用。 (二)包装 用无毒塑料桶和纸箱包装


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