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土壤和空气中纤维素酶高产菌株的筛选


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研究报告

土壤和空气中纤维素酶高产菌株的筛选
解玉红, 宋文华, 葛艳辉, 曹杨, 贾记红, 强艳艳, 冯炘
天津理工大 学 环境科学与安全工程学院, 天津 A992;2 [ 摘要] 目的: 分别从土壤和空气中分离纤维素分解菌株, 以提高纤维素利用率。方法: 将分离得到的菌株进行纯培养, 并 用刚果红染色, 找出能出现透明圈的菌株, 测定透明圈直径与菌落直径比, 筛选产纤维素酶的菌株。结果: 通过对比, 从分离 并对其进行鉴定, 初步确定一株为曲霉属真菌, 一株为放线菌。结论: 本研 到的 ? 株菌株中选出产纤维素酶活力高的 8 株, 究为提高纤维素利用率提供了微生物资源, 为相关后续研究提供了物质和实验基础。 [ 关键词] 纤维素; 纤维素酶; 菌株筛选; 鉴定 [ 中图分类号] B;A<AA2 [ 文献标识码] C

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[ 67"&2%4&] 879.4&’:.; &6 /HKEH J/ HERS0J JDE TH/U0EI /L E6FGH/6IE6J50 T/00SJG/6 56K NHGRGR /L E6EHPM HER/SHRE7 JDE SJGV

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GR/05JEK LH/I JDE R/G0 56K 5GH1 #DE RJH5G6 /L RET5H5JG/6 XG00 UE 5 RET5H5JE JH5G6G6P1 QRG6P */6P/ HEK RJ5G6G6P IEJD/K7 JDE 56K JDE JH56RT5HE6J NGHN0E KG5IEJEH Y N/0/6M KG5IEJEH X5R N50NS05JEK1 =."/$&"; ? RJH5G6R XEHE /UJ5G6EK7 G6 XDGND 8 DGPD NE00S05RE<TH/KSNG6P RJH5G6R XEHE GKE6JGLGEK7 /6E RJH5G6 UE0/6PEK J/ LS6PG
( 5 :;1<3*3==%: ) 7 56K JDE /JDEH UE0/6PEK J/ 5NJG6/IMNEJE1 -#(4$/"’#(; #DE 5U/FE HERS0JR PGFE R/IE U5RGR L/H JDE RJSKM /L SV

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[ >.? @#23"] N5HU/DMKH5JEZ NE00S05REZ NS0JSHE GR/05JG/6Z GKE6JGLGN5JG/6 纤维素是大量存在于自然界的可再生 资 源 , 它产量巨大, 但 未得到充分利用, 如蔗渣、 稻草、 麦杆等。全球每年通过植物光合 中国每年生产的小麦等秸 作用产生的生物量总量达 212@[2928 J, 秆皮壳多达 :[293 J,然而这些材料中的大部分都会在田里被烧 掉, 既降低了能源利用率, 又污染了环境 \2]。若能将这些纤维废弃 物转化为简单糖类或蛋白质等产品, 既可以 减 少 环 境 污 染 , 又可 以此作为饲料, 缓解粮食短缺、 能源危机等对当前社会的影响, 因此国内外对微生物分解转化纤维素的研究极为重视。 分解转化纤维素的首要条件是要获得工业规模的纤维素 酶, 而要使纤维素酶真正能够用于工业生产 , 首先要降低纤维素 酶的成本, 因此, 选育高产的纤维素分解菌株就成了关键之一。 多年来,在世界范围内己经广泛研究了 许 多 纤 维 素 分 解 细 菌 和 居 多 数 \8<^]。 除 此 之 真菌, 其中以中 温 好 气 性 木 霉 ( ><3?’()@1<A2) 外, 还得到了一些其他具有潜在工业价值的 菌 株 , 如梭状芽孢杆 、 黄单胞菌( 等 \?<3]。 从 生 产 应 用 的 角 菌( 4=(:B<3@%A) !2)B’(A()2: ) 度看, 它们各有自己的优点和缺点。木霉具有产酶量大和酶系比 较齐全等优点, 但它们却不能利用木质素, 其纤维素酶比活力和 各国学者目 葡萄糖苷酶活力都不太高, 并且生产较缓慢 \;]。因此, 前仍然在进一步选育优良性能的菌株, 特 别 是 一 些 极 端 环 境 下 高活性的纤维素分解菌。 我们从土壤和空气中筛选了数株 纤 维 素 酶 产 生 菌 , 为 高 产 纤维素酶菌株的选育提供了良好的研究材料。
[ 收稿日期] 899?<9?<83 [ 基金项目]天津市科委自然科学基金项目( 9@A?22222 ) , 女, 讲师, [ 作者简介]解玉红( 2;:?< ) [ 通讯作者]冯 炘 , ( "<I5G0 )

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212

材料和方法
材料 培 养 基 C : 蛋 白 胨 29 P , 酵 母 膏 29 P , 羧 甲 基 纤 维 素 钠

( 蒸馏水 2 999 I!。 *_*<’5 ) 29 P , ’5*0 ^ P , ‘+8a)@ 2 P , 蛋白胨 29 P , 酵母膏 29 P , 培养基 ( : *_*<’5 29 P , ’5*0 ^ 琼脂 89 P , 蒸馏水 2 999 I!。 ‘+8a)@ 2 P , P, 酵 母 膏 2 P, 蛋 白 胨 ^ P, 琼脂 882?" 培 养 基 : bE*0A 9192 P , 蒸馏水 2 999 I!, 23 P , T+:1?c:13 。 蛋白胨 ^ P , 琼脂 89 刚果红纤维素下层培养基: 酵母膏 2 P , 蒸馏水 2 999 I!, P, T+:1?c:13 。 柠檬酸 刚果红纤维素上层培养基: 琼脂 : P , *_*<’5 29 P , 蒸馏水 2 999 I!, 钠 @9 II/0 , T+^1@c^1? 。 刚果红染液 ( ; ;生理盐水 2 IP Y I!) ’5*0 溶 液 ( 2 I/0 Y !) ; 革兰染液( 草酸铵结晶紫, 碘酒, 番红染 ( 91;d ’5*0) ;^d 乙 醇 , 液) 。 将试验用玻璃器皿、 配置好的培 养 基 、 生理盐水在高压蒸汽 灭菌锅内, 于 282e 灭菌 A9 IG6 。

解玉红等: 土壤和空气中纤维素酶高产菌株的筛选

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个体形态观察 插片培养法观察: 采用插片培养法 观 察 菌 丝 的 形 态 特 征 、 生 长趋势, 孢子的形状、 大小、 颜色, 同时观察菌落特征。 革兰染色法观察: 用革兰染色的方 法 在 显 微 镜 下 观 察 , 鉴定 其革兰染色特性, 并观察菌体、 孢子的形态特征。

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土壤中菌株的 筛选方法 土壤中样品的采集 采集时记 录 采 集 的 时 间 、 地点、 采集

时温度、 采集深度、 土样等。分别在天津 理 工 大 学 校 园 内 $ 处 地 编号为 %!&%$ ) , 在天津市河北区一居民家小菜 点采集土样 $ 份( 编号为 %(&%) ) 。 园中采集土样 ’ 份(

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土壤样品的处理

将采集 到 的 土 壤 样 品 放 到 生 化 培 养 箱

然后在超净工作台上用生理盐水洗涤, 取上清液 ! 中 驯 化 # *, 放入温箱中, 在 ’/0 下 +, 分 别 加 入 到 - +, 液 体 培 养 基 . 中 , 培养 #$ * 使其增殖。

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结果与讨论
菌株的筛选 土壤中菌株的筛选 样 品 在 培 养 基 . 中 于 ’/0 培 养 #$

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土壤样品的分离纯化
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将增殖后的培养液倍比稀释, 稀
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释 率 分 别 为 ! 1 !/ 、 ! 1 !/ 、 ! 1 !/ 和 ! 1 !/ 。 将 ! 1 !/ 稀 释 液 分 别 接 种于培养基 . 中,以空白管的培养基作为对照观察培养基 . 中 的变化, 找出减少明显的样品管进行菌种 羧甲基纤维素( 232) 的分离。 将 与 上 述 232 减 少 明 显 的 样 品 增 殖 管 相 对 应 的 ! 1 !/ 、 !1 分别 !/#、 ! 1 !/’ 和 ! 1 !/$ 稀释样各取 ! +, 接种到培养基 4 平皿( 标记为 %!5!&%!5$ 、 ……, 直至 %)5!&%)5$ ) , 放入温 %#5!&%#5$ 、 箱, 于 ’/0 培 养 #$ * , 找出形成单个菌落的稀释率, 并给菌株编 号, 进行分离。 将分离得到的单个菌株以划线 接 种 法 接 种 到 刚 果 红 纤 维 素 下层培养基, 然后倒入 $(0 时 的 刚 果 红 纤 维 素 上 层 培 养 基 , ’/0 培养 #$ * 。

%’ 、 %( 、 %> 、 %) 等 $ 个 样 品 中 的 232 液 面 明 * 后 的 结 果 见 图 !,
显下降,菌体沉淀在试管底部,说明 这 $ 个 样 品 中 存 在 能 降 解

232 的菌株。
对上述 $ 个样品的倍比稀释样 进 行 平 板 培 养 , 选 出 纯 培 养 的单个菌株, 并对单个菌株进行刚果红染 色 , 一共分离出 = 株纯 培养菌株,但没有发现产生透明圈的 菌 落 , 重 复 $ 次 的 结 果 一 样。 土壤标本培养液能降解液体培养基中的 232 ,说明其中的 菌株有产纤维素酶的能力,但分离到 的 单 个 菌 落 却 没 有 降 解 能 单一菌 力。笔者认为 232 的降解是由多 菌 种 共 同 作 用 的 结 果 , 种不能产生纤维素酶降解纤维素。虽 然 从 从 土 壤 样 品 中 未 能 分 离到能够高效降解纤维素的菌株,但 其 中 的 多 菌 种 协 同 对 纤 维 素的降解能力值得深入研究和探讨。

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土壤样品中菌株的筛选

将刚果红纤维素培养基中的菌

染色 # * , 然后 株进行刚果红染色。先用刚果红染液( ! +6 1 +,) 脱 色 # *, 观察菌落周围是否出现透明 用 7829 溶 液 ( ! +:9 1 ,) 圈, 若出现透明圈则证明该菌种有分解纤 维 素 的 能 力 , 即能产生 并记录; 选出 纤维素酶。计算透明圈直径与菌落直径之比( ; 1 <)

; 1 < 值较大的菌株进行初步鉴定。 !"’ !"’"!
空气中菌株的筛选方法 空气中样品的采集 采集时记 录 采 集 的 时 间 、 地点、 采集

时温度等。在实验室周围室外设 = 个采样点采集空气菌, 将培养 皿 中 的 ##!>? 培 养 基 暴 露 于 空 气 中 ’/ +@A , = 个培养皿分别编 号为 B!&B= 。

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空气中样品的分离纯化

将 B!&B= 培 养 皿 于 ’/0 温 箱

分离单个菌落, 编号。将单个菌落以复划线的方式 中培养 #$ * , 分离进行纯培养, 并做好编号记录; 将 接 种 到 ##!>? 培 养 基 中 , 纯培养菌株进行增殖培养, 在 ’/0 温箱中培养 #$ * 。 将纯培养单个菌株分别接种于刚果红纤维素下层培养基 ( 真菌采用点种法, 细菌采用划线培养法) , 然后倒入冷却到 $(0 的刚果红纤维素上层培养基, ’/0培养 #$ * 。
图! 土壤样品混合菌液体培养结果

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空气中菌株的筛选

将采集到的空气样品于 ’/0 培养 #$

得到 != 个真菌菌株和 ’’ 个细菌及放线菌菌株。根据菌落 * 后, 特征对其进行编号 , 用刚果红染色筛选, 选出产生透明圈且 ; 1 < 值较大的 ( 株菌株进行研究, 分 别 是 B(5) 、 空 $5! 、 空 $5 B)5# 、 空 )5! 。 #、 ( 株菌的染色结果见图 # , ; 1 < 值见表 ! 。B)5# 、 B(5) 、 空 $5# 的 ; 1 < 平均值较大。 根据菌落特征选出 ! 株丝状真菌( 空 和 ! 株放线菌( 进一步研究, 并作出初步鉴定。 $5# ) B)5# )

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空气样品中菌株的筛选

对上述培养基及所生长的菌落

进行刚果红染色。先用刚果红染液( 染色 # * , 然后用 ! +6 1 +,) 脱 色 # *, 观察菌落周围是否出现透明圈, 7829 溶 液 ( ! +:9 1 ,) 若出现透明圈则证明此菌种有分解纤 维 素 的 能 力 , 即 能 产 生 纤 并记录; 选出 ; 1 维素酶。计算透明圈直径与菌落直径之比( ; 1 <)

< 值较大的菌株进行初步鉴定。 !"$ !"$"!
菌株的鉴定 群体形态观察 从菌落的 外 部 形 态 特 征 进 行 鉴 定 。 用 游

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菌株的鉴定 真菌的鉴定 对空 $5# 做平板培养 和 插 片 培 养 , 观 察 菌

图 $。 菌 落 在 生 长 过 程 中 落特征、 生长状况和孢子特征, 见图 ’ 、 先产生白色菌丝,其后随着菌株的生 长 菌 落 颜 色 也 随 之 渐 变 为 棕黄 ! 墨绿 ! 深褐色, 且菌落如毡状向四周辐射状生长。

标卡尺测定菌落直径、 菌落高度; 观察菌落质 地 、 菌落边缘、 菌落 表面及纹饰、 菌落顶部及底部的颜色、 菌落生长状态, 以及菌落 有无气味等。

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图8 表2 菌株

从空气中筛选到的 > 株菌株的染色结果

> 株菌的 A B C 值
重复测定次数 极差( DE)

平均 A B C 值

=:<8 =><: 空 :<2 空 ;<2 空 ;<8

81?9> 213>> 212>9 218@> 21@2>

8 8 8 8 8

9192 9192 9198 9192 9192

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菌株 =:<8 的菌落特征

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菌株空 ;<8 的菌落特征

图?

菌株 =:<8 的革兰染色结果

图;

菌株空 ;<8 的插片培养结果

在显微镜下观察插片培养的菌株, 菌丝稀疏, 呈淡绿色, 分 生孢子梗从壁厚而膨大的足细胞垂直生出 , 上部较粗大, 顶端膨 大成椭圆形的泡囊, 从泡囊的表面放射状 地 生 出 小 梗 , 分生袍子 串生于小梗顶端, 呈辐射状排列; 孢子圆形, 表面粗糙; 整个分生 孢子头呈蒲公英状。 根据以上观察结果, 初步判定菌株空 ;<8 为曲霉属种。 放线菌的鉴定 对菌株 =:<8 进行平皿培养, 观察菌落形
图: 菌株 =:<8 的插片培养结果

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结语 我们通过刚果红染色试验从空 气 中 筛 选 得 到 了 产 纤 维 素 酶

下表面为淡黄色, 菌落 态特征, 结果见图 > 。菌落上表面为白色, 干燥致密, 在培养基上辐射状生长, 呈绒布装, 并且有土腥味。 对菌株 =:<8 进行革兰染色, 并用插片培养法观察菌丝孢子 图 : 。 =:<8 菌 体 为 丝 状 , 革兰染色阳性, 插片 状态, 结果见图 ? 、 培养可见分生孢子。 综合菌落特征和个体特征, 初步确定 =:<8 为放线菌。

的菌株。刚果红染色方法简单, 易操作, 结果易于分析, 测量出 便可进行筛 分 判 断 。 在 本 实 验 中 , 我们根据测量得出的 A B C 值, 放线菌各 2 株菌株进行了初步鉴定。 A B C 值的大小分别对 真 菌 、 由于放线菌结构简单, 更易于分离提取出 粗 酶 液 , 而且其基因易 于获取和表达 7 所以我们选择放线菌 =:<8 进行后续研究。

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参考文献
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王 倩 $ 纤 维 素 酶 高 产 菌 株 选 育 与 玉 米 秸 秆 生 产 酒 精 工 艺 研 究 !%#$ 河北农业大学硕士学位论文, &’’($) 许修宏, 肖玉珍, 陈建平, 等 $ 高效纤维素分解菌分离筛选的研究 !*#$ 东北农业大学学报, : "++, , &+ ( -) ((’ 杨礼富, 谢贵水, 王真辉, 等 $ 木质纤维素酶高产菌株的筛 选 和 鉴 定 : !*#$ 热带作物学报, &’’" , && ( () .’ 张秀红, 张彩琴, 张 云 茹$ 高 活 性 纤 维 素 分 解 菌 株 的 筛 选 及 其 产 酶 条件的研究 !*#$ 山西师范大学报( 自然科学版) , : &’’& , "/ ( () )/ 马承铸, 顾 真 荣 $ 醋 酸 纤 维 素 高 产 菌 株 筛 选 和 菌 物 鉴 定 !*#$ 上 海 农 业学报, &’’’ , "/0(1 : .,

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熊鹏钧 $ 低温纤维素酶基因的克隆、 表达和产淀粉酶嗜 热 菌 的 筛 选 及基因克隆 !%#$ 国家海洋局第三海洋研究所硕士论文, &’’-$) 韩韫, 蔡 俊 鹏 $ 产 纤 维 素 酶 海 洋 菌 株 的 筛 选 及 鉴 定 !*#$ 现 代 食 品 科 技, : &’’) , &" ( () (/ , -邱燕临 $ 纤维素酶的研究和应用前景 !*#$ 粮食与饲料业 F&’’"F0,1G(’

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第二届植物分子育种国际学术研讨会 &’’. 年 ( 月 &(H&. 日在海南省三亚市召开
( I88JG K K LLL$3=JM5$E7N)
现代农业已经发展到了“ 分子农业” 时代, 基因工程、 转基因技术等分子生物学手段广泛应用于植物的遗传育种, 基因 组学的研究成为植物基因资源发掘的基本科学平台, 分子育种成为植物育种的最主要手段之一。为加强与国际植物分子育 种领域的合作与交流,推动应用基因与组学植物分子育种科学的发展, 全球挑战计 OI6 26@67<83E@ PI<446@N6 Q7EN7<MM6 ( 划) 、 国际水稻研究所、 海南省科学技术协会、 中国农业科学院、 海南省热带农业资源开发利用研究所等单位发起, 定于 &’’. 年 ( 月 &(H&. 日在海南省三亚市举办“ 第二届植物分子育种国际学术研讨会” 。 大会荣誉主席 国际挑战计划主席, 国际小麦玉米改良中心主任; *6<@HD<7=64 R35<>8 博士, 张启发博士, 亚洲水稻生物技术协作网指导委员会主席, 中国科学院院士、 华中农业大学教授, 作物 遗 传 改 良 国 家 重 点实验室主任。 大会主席 黎志康博士, 国际水稻研究所资深科学家、 作物基因资源与遗传改良国家重大工程首席科学家、 中国 农 科 院 作 物 所 研 究员、 国际分子育种项目协调科学家。 组委会执行委员 方宣钧博士, 海南省热带农业资源开发利用研究所, 所长、 研究员, 海南农作物分子育种重点实验室主任; 黎志康博士, 国际水稻研究所资 深 科 学 家 、 作物基因资源与遗传改良国家重大工程首席科学家、 中国农科院作物所研 究员、 国际分子育种项目协调科学家。 大会主题 本次大会主题为“ 应用基因组学与植物分子育种” 。 主要议题 ( 一) 应用植物基因组学: 从基因组走向大田; ( 二) 分子标记与植物育种: 一种整合; ( 三) 植物育种中新型的分子工具和技术; ( 四) 转基因新技术、 产品及其市场; ( 五) 设计育种: 基因发现和性状改良的连接; ( 六) 转基因植物中知识产权的问题。 组委会办公室联系方式 邮编: 海南省海口市海秀中路 "’. 号北岸青年公寓 )’. 室; ).’&’/ 电话: 传真: ,/H,+,H/,+//-") ; ,/H,+,H/,+/,",’ 手机: "(,’.)(&’(.

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