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浅谈液相色谱串联质谱


浅谈液相色谱质谱联用技术
刘谦 保定出入境检验检疫局,保定 071000 摘要:液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统,质谱作为检测系统,经纯化后 的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化, 经由检测器得到质谱图。 液质联用体现了 色谱和质谱优势的互补, 结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性, 高灵敏度 及能够提供相对分子量和结构信息的优点,在药物分

析,食品检测等领域有广泛的应用。 关键词:液相色谱 质谱 食品检测 高效液相色谱是一种准确度高,分离范围广的快速分离方法,它对化合物的结构破坏性 小,适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度,对于未知 化合物的结构分析定性十分准确, 对相应的标准样品要求也比较低。 质谱可以和气相联用如 GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如 HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当,再加上分离效 果很好的色谱可以作为质谱的进样系统,质谱作为色谱的鉴定仪速度快,分离好,应用广。 色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。 在1970年后,质谱-质谱法(mass separetion-mass spectra Characterization)迅猛 发展起来。这种方法让母离子进一步裂解,从而获得裂解过程和分子结构的信息,通常我们 称为串联质谱,二维质谱法,序贯质谱等。 我们知道,质谱的分析建立在物质离子化的基础上,按照荷质比分离离子,通过测量离 子谱峰的强度实现分析目的。 通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的 综合作用下, 按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。 常见的质谱图的纵 坐标是离子信号强度,横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI 和APCI,我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式,应用范围较APCI 的 大,只有少部分有机分子ESI 做不出,可以用APCI 辅助解决问题。 一般用ESI 和 APCI 搭 配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。 下面说一说ESI和API源的异同点。 化学源 项目 离子化过程 样品先带电再喷雾,带电液滴去溶 剂化过程中形成带电离子,是液相 离子化 适合检测物质 适合检测极性大,分子量大,不稳 定的分子,如蛋白质,肽,糖 产生离子 小分子产生单电荷离子,生物大分 子产生多电荷离子 ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子,源参数调整简单,容易使用,仪器 灵敏度高。对APCI源来说,不足就是给出的结构信息有限,样品易发生热裂解,低质量时基 线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰,可以直接测定混合物,并可以测定热不稳定的极性
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ESI

APCI

样品先形成雾再被电离, 是气 相离子化

适合极性小的样品

主要产生单电荷离子

化合物。 其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA 等生物大分子; 通过调节离子源电 压控制离子的碎裂(源内CID)得到化合物的部分结构。 当然有机质谱也有自身局限性。 有机分子多数有异构体, 而质谱在立体化学方面区分能 力差;色谱的重复性稍微差一些,需要严格控制操作条件,不能像 NMR,IR 等可以直接动手 操作,需要专人负责;质谱有离子源的记忆效应,操作起来也很复杂;尽管如此,色谱-质 谱联用在天然产物的分析〔1〕 ,药物代谢结合物(如苯丙酮尿症 PKU)的测定〔2〕 ,药物合 成的监测(如 Ractopamine) 〔3〕具有重要的应用。美国耶鲁大学教授 J.Fenn 等 1984 年首 次发表 ESI-MS 的研究成果,并于 1988 年成功地进行了蛋白质的分析。 先天性疾病中有很大一部分是先天性遗传代谢疾病,就目前医学发展已经了解的有一百 多种。这些疾病虽不致死,但是对患儿的智力和体格可能造成痴呆、残缺和畸形,是家庭、 社会、国家的沉重负担。目前有 30 多种代谢失常遗传性疾病如各种氨基酸代谢失常血症包 括同构胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥 珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症、短链和长链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症(SCAD 和 LCAD)、异 戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其它各种有机酸代谢失常疾病等都可 用 LC/MS/MS 进行临床检测〔4〕 。 我们知道, 保证药品质量的一个重要方面是杂质检查及限度控制, 使用 LC/MS/MS 可以很 方便的对药品进行监控。Nicolas 建立了不同批次抗癌药物 DuP941 的 LC/MS/MS 谱图达到质 量控制目的;Rourick 建立了鉴定药品杂质的方法,利用 LC/MS/MS 功能鉴定头孢羟氨苄降 解产物的结构。对分析化学家来说是一个挑战的体内药物分析利用 LC/MS/MS 也显示很大的 优越性。有报道 Takeshi 对血液和尿液中 11 个添加的吩噻嗪类药物进行分析,采用 SPME 和 LC 分离经 MS/MS 检测。Wong 开展了微透析-LC/MS/MS 生物活体分析,将微透析探针插入 动物的颈动脉,实时了解松果体素在体内的生化过程和代谢情况。LC/MS/MS 还可以鉴别体 液中很多药物,这在很多文献中都有报道〔5,6〕 。 LC/MS/MS 也用于生物技术中分子量的测定〔7〕 。对分子量 10000 以上的蛋白质用离子 喷雾技术进行精确的质量测定是常规的分析。有研究用离子喷雾测定甲硫酸氨基-人体生长 激素(MET-HGH)的分子量为 22,256.32±0.44Dr,与实际计算分子量 22,256.2Dr 相差很小。 , 同聚丙烯酰胺凝胶电泳、 蔗糖密度离心法等经典的蛋白质分子量测定技术相比, 分析时间短, 样品消耗少,测定快捷准确。还有研究者利用 LC/MS/MS 开展 DNA-药物结合态的分析,蛋白 质与金属离子配位研究〔8〕 。 司法鉴定中LC/MS/MS也是毒品检测的一个有力工具〔9〕 。Soenoff建立了新生婴儿血液 中苯甲酰爱康宁的确证方法,这就可以对可疑吸毒者出生的婴儿进行鉴定。Clauwean用 LC/MS/MS和LC/荧光检测了头发中可卡因及其代谢物,得到的结果是一致的,并且在很低的 浓度时仍可以进行MS/MS全扫描。 Wang对可卡因和它的15个代谢物的裂解机理在改变CID源和 标准品的条件下进行了深刻探讨,取得很大的成就。 LC/MS/MS在食品检测中的地位更是不可低估。例如蜂蜜中氯霉素的LC/MS/MS 分析,鱼 肉中孔雀石绿的LC/MS/MS 分析,LC/MS/MS同时分析多种抗生素,动物组织中19种β肾上腺 素兴奋剂的检测,苏丹红的LC-MS/MS方法的测定,水果和蔬菜中100种农药及其代谢物的同 时检测,干炸食品中丙烯酰胺的测定。硝基呋喃是国际动物源性食品贸易的必检项目,硝基
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呋喃类药物主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因,用于治疗和预防由埃希氏 菌和沙门氏菌引起的哺乳动物消化道疾病。研究发现,呋喃西林、呋喃唑酮及其代谢物具有 致癌作用〔10〕。 1995年欧盟禁止在食用动物中使用硝基呋喃类药物, 2002年我国颁布了禁止使用该类 兽药的禁令〔11〕。虽然硝基呋喃类药物代谢快而且对光敏感,母体化合物在动物体及产品 中很快就降至检出限以下,但其代谢物以蛋白结合物的形式在体内可残留较长时间 〔12, 。 13〕 目前,各国均将硝基呋喃代谢物作为指示硝基呋喃类药物残留的标示物。彭涛用高效液相色 谱/串联质谱(LC/MS/MS)法同时测定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代 谢物。各界对此都进行了积极的研究〔14,15〕。 随着科技发展, 分析领域对仪器的要求的不断提高, 制药行业对0.1%含量的杂质要求定 性和定量, 在增加检测的选择性和灵敏度基础上得到更多化合物的信息和增加可分析化合物 HPLC/MS/MS结合了LC的强大的分离分析能力和MS灵敏 种类, 对我们分析人员也是一种挑战。 的鉴定及结构解析能力,提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息,简化了试验步骤, 节省了样品准备时间和分析时间, 作为当今最重要的分离和鉴定方法之一, 在分析化学领域 中发挥着更加重要的作用 参考文献: 〔1〕金米聪.若干天然产物和痕量环境有机污染物的液质联用法检测研究.《浙江大学》, 2007. 〔2〕王璐璐,倪坤仪, 戴亮.液相色谱-质谱联用技术在药物分析中的应用.《中南药学》 , 2006,4(2):138-141. 〔3〕周慧.电喷雾质谱及其联用技术在药物分析中的应用.《浙江大学》.2005. 〔4〕 郭智,张煊,宋冬梅,王莲.液相色谱串联质谱法在药物代谢研究中应用最新进展. 《中国 新药杂志》.2007,16(23):1981-1985. 〔5〕 沈凯,王洪允,江骥. HPLC/MS/MS法定量测定人血浆中替比夫定的浓度. 质谱学报, 2007, 28(5):73-77. 〔6〕徐珊珊,郑静,徐红蓉. 液相色谱串联质谱法同时测定人血浆中西替利嗪和伪麻黄碱的 浓度.中国临床药学杂志.2007,16(2):81-84. 〔7〕盛龙生,汤坚.液相色谱质谱联用技术在食品和药品分析中的应用.化学工业出版 社.2008。 〔8〕李蓉,邸泽梅,陈国亮.流动相组成、浓度和pH对蛋白质在金属螯合柱上的保留特性的 影响.色谱,2001,19(5):385-389. 〔9〕马栋,刘伟.液相色谱—质谱联用技术在毒物分析中的应用。中国司法鉴定. 2005(3). 〔10〕彭涛,储晓刚,杨强,李刚,李建中,李重九.高效液相色谱/串联质谱法测定奶粉中的硝 基呋喃代谢物.《分析化学》.2005,33(8):1073-1076. 〔11〕彭涛,邱月明,李淑娟,陈冬东,安娟,蔡慧霞.检验检疫科学.2003,13(6):23-25. 〔12〕 徐一平, 胥传来. 动物源食品中硝基呋喃类物质及其代谢物残留的检测技术研究. 食 品科学.2007,28(10) . 〔13〕郭桢,连瑾,吴淑君. 动物源性食品中呋喃唑酮及其代谢物的检测.广东农业科
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学.2005,(5). 〔14〕葛宝坤,王云凤,常春艳,左国华. 测定鸡肉、水产品中四种硝基呋喃类药物残留量 的固相萃取-液相色谱法.分析测试学报.2003,(5). 〔15〕徐维海,林黎明,朱校斌,王新亭,张干. HPLC/MS法对呋喃唑酮及其代谢物AOZ在罗非鱼 体内残留研究 .上海水产大学学报.2005,(1).

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