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几种野生药用植物内生放线菌的遗传多样性及抗菌活性


第 29 卷

第 2期

四川农业大学学报 Jour nal of Sichuan A g ricultur al U niv ersity

V ol. 29

N o. 2

2011 年 6 月

Jun. 2011

do i: 1

0. 3969/ j. issn. 1000 2650. 2011. 02. 016

几种野生药用植物内生放线菌的遗传多样性及抗菌活性
赵 珂, 徐 宽, 陈 强, 敖晓琳, 王 旭, 张小平
611130) ( 四川农业大学资源与环境学院, 四川 温江

摘要: 从四川省雅安市采集的 7 份中药材植物样品中分离出 106 个内生放线菌 菌株, 采 用 16S r DN A R FL P 和 16S rDN A 序列分析研究了其系统发育。16S rD NA RF LP 将供试菌株分成了 6 个遗传群; 代表菌株的系 统发育分 析表 明 , 供试菌株主要为链霉菌属( Str ep tomy ces) ; 其余菌株分布于野野村菌属( N onomur aea) , 小单孢菌属( M icr omono s p or a) , 拟诺卡 氏菌 属( N ocard iop sis ) , 糖霉 菌属( Gly comy ces) , 厄 氏菌 属( Oers kovi a) , 纤 维菌 属( Cellulosimicr obi um) 等 6 个稀有放线菌属, 大多数供试菌株对细 菌及病 原真菌 有较为广 谱的抗 菌活性。 揭示了 该区域药 用植物 内 蕴 藏着丰富的内生放线菌资源。 关 键词: 药用植物; 植物内生放线菌; 多样性; 抗菌活性 中 图分类号: Q 938. 1 文献标志码: A 文章编号: 1000 2650( 2011) 02 0225 05

The Genetic Diversity and Antibiotic Activity of Endophytic Actinomycetes from Medicinal Plants in Sichuan
ZH AO Ke, XU Kuan, CH EN Qiang, AO Xiao ling , WA NG Xu, Z H ANG Xiao ping
( Co llege of Reso urce and Env iro nment, Sichuan Ag r icultural U niversit y, W enjiang 611130, Sichuan, China)

Abstract: 106 endophy tic act ino mycet es were isolated fr om 7 medicinal plant s in Yaan. Accor ding to t he pheno ty pe, the g enetic div ersit y and phylo geny w ere det ermined by 16S rRNA RF LP , the phylo genic t ree w as co nst ruct ed by 16S r DNA sequences. 16S rDNA RF L P analy sis divided the representat ive strains int o 12 g enot ypes, which rev ealed t hat t he genet ic diversit y existed. T he phylogenic analysis classified the representative st rains as genera Str ep tomyces, Micromonsp ora, Nocar diop sis, Gly comyces, Oerskovia, Nonomuraea and Cellulosimicrobi um, respectively, and most of t he iso lat ed strains had broad ant ibiotic activity t o the pathogenic bact erial and f ungal strains. T he result s showed that the endophyt ic act inomycet e resources w ere very abundant in this dist rict. Key words: medicinal plant; endophy tic act inomy cetes; diver sit y; ant ibiot ic act ivit y 放线菌广泛分布于自然界的各种生境, 因其产 生多种具有重要经济价值和广泛实际用途的次生代 谢产物而备受国内外研究者关注。由于微生物耐药 性日益增强, 人们急需寻找新的具有拮抗动、 植物病 害及环境友好的天然活性物质
[ 1]

植物内生菌( Endophy tes) 是指以共生或寄生方 式存在于植物组织内部、 不引发植物明显病症的微 生物 , 生长于不同环境和生态系统中的植物资源 为人类继续寻找有用的内生放线菌提供了可能。 四川省复杂多样的地质地貌和气候特征, 药用 植物资源丰富多样。其中既有抗癌的、 抗肿瘤的、 抗 菌的作用, 也有活血化淤、 清热解毒之功效。与这些 植物形成内生关系的放线菌, 在长期进化的过程中, 由于适应环境 包括外界环境和植物内 部环境的结
[ 6]

。然而, 由于长期
[ 2]

从土壤重复的筛选抗生素, 进一步筛选出具有产生 新的活性成分的放线菌日益困难 境, 海洋环境, 植物内部等
[ 3 5]

。因此, 人们逐

渐把目光投向土壤以外的其他特殊环境, 如极端环 。

收稿日期: 2011 04 11 基金项目: 国家自然科学基金( 30570062) ; 四川省科技厅国际合作项目。 责任作者: 张小平( E mail: zhangx iao ping phd@ 126. com)

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果, 形成能与高等植物进行信息转换的遗传机制 [ 7] , 具有与药用植物相似或极其特 殊的遗传与代 谢特 性, 极有可能存能产生新颖活性物质的新的放线菌, 因此药用植物内生放线菌作为一类新的微生物资源 具有很好的开发潜力。本文以从四川雅安市采集的 野生药用植物分离的内生放线菌为对象, 对其种群 多样性、 系统发育进行了研究, 并对其抗菌活性进行 了初探, 以期获得有效的野生药用植物内生放线菌 资源。

选取整株药用植物, 自来水冲洗干净, 超声清洗 仪处理 5 min, 清洗后无菌滤纸吸干, 分别将根、 茎、 叶剪开, 放入装有灭菌滤纸的无菌培养皿, 室温干燥 48 h。 分离时, 用 0 1% T w een 20 浸泡样品 30 s, 无 菌水漂洗 4 次; 随后用 75% 乙醇浸泡 5 min, 无菌水 漂洗 4~ 5 次; 继而用 2% 次氯酸钠浸泡 5 m in, 无菌 水漂洗 4 次; 最后用 10% NaH CO 3 处理 3~ 5 min, 无菌水漂洗 5 次。取 5 板, 28 1. 4. 2 L 清洗液涂布于 T SA 平 培养 1 d, 检验表面灭菌效果。 内生放线菌分离

1
1. 1

材料和方法
样品采集

将表面灭菌的植物组织放置于无菌搅拌机打碎 后, 均匀地涂抹于分离培养基中, 28 培养 15~ 30 d 后, 挑单菌落, 用 ISP4 培养基平板纯化, 4 保存 备用[ 8 9] 。 1. 5 形态及培养特征观察 采用 ISP 4 培养基埋片培养法, 显微观察菌丝、 孢子形态, 肉眼观察培养特征, 如气丝、 基丝、 产色素 [ 10] 以及孢子丝吸水等情况 。 1. 6 抑菌活性检测 本研究采用对峙生长法对供试菌株的抑菌活性 进行检测[ 11] 。 1. 7 16S rDNA PCR RFLP 分析及系统发育研究 菌株总 DNA 提取、 16S r DNA 片段扩增 参考 Cui X. L. 等 的方法, 扩增产物经检测后, 各 取 6 ~ 8 L 分别用 H ae 、 sa R 2 种限制性内切酶于 37 浴温 6 h, 用 2 5% 琼脂糖凝胶电泳( 80 V, 4 h) 检测。代表菌株 16S rDNA 扩增片段送到上海生物 工程有限公司测序。 1. 8 数据处理 16S rDNA PCR RF L P 指纹图谱均一化处理后 转化成计算机可以识别的数值 1 和 0 , 应用软件 NT SYS 2. 1 计算各菌株间的相似性, 平均连锁聚类 法( U PGM A) 构建 树状图。获得 的代 表菌 株 16S rDNA 序列, 用 Blast 从 GenBank 等数据库中获得 相似 性 较 高 的 相 关 菌 株 16S rDNA 序 列, 用 Clust al X进行比对[ 13] , MEGA 4. 0 软件采用邻接法 ( Neighbor Joining) 构建系统进化树[ 14] 。
[ 12]

从雅安市采集供试野生药用植物麦冬( Op hio p ogon j ap onicas ) , 红 牛 膝 ( A chy rant hes bid ent a ta) 、 青蒿 ( A r tem isi a annua L . ) 、 枯草( Pr unel l a 夏 vulg ar is Linn. ) 、 银杏( G inkgo bil oba ) 、 茴香( Foe ni cul um vul gar e) 、 马鞭草( H er ba Ver benae Of f ici nal i s) 样品 7 份, 装入无菌袋中 4 保存, 带回实验 室分离。 1. 2 培养基及试剂 分离培养基共 5 种: H V 培养基( E1) 、 天门冬酰

胺- 酪 素 - 丙 酸 钠 培养 基 ( E2) 、 藻 糖 培 养 基 海 ( E3) 、 改良高氏一号培养基( E4) 、 柠檬酸盐培养基 ( E5) 。分别向培养基中添加 25 m g/ L K 2 Cr 2 O 7 , 25 mg/ L 萘啶酮酸作为抑制剂。 溶菌 酶、 白酶 K、 T Ps、 aq 酶、 切酶、 蛋 dN T 内 DNA M arker 等购自宝生物工程( 大连) 有限公司, 16S r DNA 扩增引物( F27, R1523) , 由 上海生工 生 物工程技术服务有限公司合成, 其他试剂均为国产 分析纯。 1. 3 拮抗指示菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ( S tap hy lococcus aur eus

AT CC25923 ) 、 大 肠 杆 菌 ( Escher ichi a col i AT CC35218) 由国家海洋局第三海洋研究所生物重 点实验室提供。棉花黄萎( V ert i cil l iam w il t ) 、 棉花 枯萎病( Fusari um ox y sp orum ) 、 黑曲霉( A sp er gi l lus nig er ) 、 西瓜枯萎( Fusar ium ox y sp or um ) 、 黄瓜 炭疽 病 ( Col l et ot ri chum orbi culare ) 、 谷 镰 刀 菌 禾 ( Fusar ium gr am inear um ) 、 玉米 小斑病 ( Ex erohi lum t ur ci cum ) 、 玉米弯孢菌( Curv ul ar i a l unat a) 、 番 茄灰霉菌( Botr y ti s cinerea) 等植物致病真菌由四川 农业大学植物病理实验室提供。 1. 4 药用植物内生放线菌的分离 1. 4. 1 植株前处理

2

结果与分析
采用 5 种不同培养基从 7 种野生药用植物的

2. 1 野生药用植物内生放线菌的分离结果 根、 叶中共分离得到内生放线菌 106 株。 茎、 不同培养基分离 的内生放线菌数量差异较大

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( 图 1) , 其中以培养基 E1, E3 和 E4 分离的 放线菌 数量最多, 分别为 26, 24 和 33 株, 培养基 E5 分离的 数量最少。内生放线菌在植株内的分布也有很大差 异( 图 2) , 其中根系占 63 株, 占分离总数的 53% , 叶 中的放线菌比例最小。

2. 2 内生放线菌形态观察 根据气丝、 基丝、 色素颜色及孢子吸水情况初步 将 106 株内生放线菌分为 12 个不同类群, 从中选取 42 株代表菌株, 其中的 34 株具有柔曲、 螺旋、 顶端 卷曲呈球状的孢子链, 呈现明显的链霉菌特征; 其余 8 株菌气丝弱或无, 与典型的链霉菌存在明显的区 别。 2. 3 抗菌活性 供试的 42 株内生放线菌对 2 株细菌和 9 株病 原真菌均有不同程 度的抗性, 抗菌 谱较广( 表 1) 。 抑菌圈大小表明, 供试放线菌对不同病原菌株的拮 抗效果存在差异, 其中, 对玉米小斑病( Ex erohil um t ur ci cum ) 抑菌效 果最佳, 90% 的 菌株具 有抑 菌活 性, 最大抑菌圈达到 15 m m; 对西瓜枯萎病( F usar i

图 1 不同培养基内生放线菌分离效果 Figure 1 Number of endophytic actinomycete isolated by different media

um ox y sp or um ) 、 玉米 弯孢病 ( Cur vulari a l unat a) 以及禾谷镰刀菌病 ( Fusar i um graminear um ) 抑制 作用 较 强, 抑 菌 率 在 70% 以 上。但 对 棉 花 黄 萎 ( V er ti ci ll i am w il t ) 、 大肠杆菌( Escher ichi a col i ) 抑 菌效果不明显。 2. 4 16S rDNA PCR RFLP 及系统发育分析 经扩增, 获得了供试菌株 16S rDNA 片段, 其大 小约 1 5 kb, 扩 增产物分 别用 H ae ( 图 3) , 得到了 12 和 9 种酶切带型。 对 16S rDNA PCR RF L P 图 谱进行聚 类分析 ( 图 4) , 结果表明, 供试菌株在 70% 水平上, 分成了 6 个遗传群, 其中以群 最大, 由 24 个菌株组成, 表 、 Rsa 酶切

图 2 野生药 用植株不同部位内生放线菌分布 Figure 2 Distribution of endophytic actinomycete in diff erent tissues of wild Chinese herbal plant

明该地区野生药用植物内生放线菌在系统发育上的 差异明显。

Table 1

表 1 供试野生药用植物内 生放线菌抗菌活性 Antifungal/ Antibacterial activity of endophytic actinomycetes isolates against pathogens 拮抗活性 A ntifungal/ A ntibacter ial act ivity + + + 1( 2. 3% ) 3( 7. 1% ) 7( 16. 7% ) 1( 2. 3% ) 2( 4. 8% ) 10( 23. 8% ) 2( 4. 8% ) 3( 7. 1% ) 7( 16. 7% ) + + 2( 4. 7% ) 5( 11. 9% ) 11( 26. 1% ) 2( 4. 8% ) 7( 16. 7% ) 18( 42. 8% ) 13( 30. 9% ) 2( 4. 8% ) 2( 4. 8% ) 2( 4. 8% ) + 2( 4. 7% ) 24( 57. 3% ) 11( 28. 3% ) 14( 33. 3% ) 21( 50% ) 15( 35. 7% ) 8( 19% ) 18( 42. 8% ) 8( 19% ) 3( 7. 1% ) 2( 4. 8% ) 40( 93. 3% ) 15( 35. 7% ) 23( 48. 3% ) 10( 23. 8% ) 18( 42. 8% ) 18( 42. 8% ) 6( 14. 3% ) 9( 21. 4% ) 29( 69% ) 30( 71. 4% ) 38( 90. 4% )

病原菌 Patho gens 棉花黄萎 棉花枯萎病 黑曲霉 西瓜枯萎病 黄瓜炭疽病 禾谷镰刀菌 玉米小斑病 玉米弯孢菌 番茄灰霉菌 金黄色葡萄 球菌 大肠杆菌

注: + + + 为抑菌圈> 10 mm; + + 为 5~ 10 mm; + 为 1~ 5 mm。 N ote: + + + w idth of g ro wth inhibition zo ne> 10 mm; + + 5~ 10 mm; + 1~ 5 mm.

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1. X3002; 2. X3007; 3. X3010; 4. X3019; 5. X 3024; 6. X3041; 7. X3021; 8. K2020; 9. X3037; 10. X 3018; 11. X3005; 12. X3013; 13. X3016; 14. X3032; 15. X3025; 16. X3015; 17. X3030; 18. X3028; 19. X 3034; 20. K 2029; 21. X 3022; 22. X3003; 23. X3026; 24. X3042M ; DL 2000 ladder. 图 3 部分菌 株 16S rDNA 的 Hae ( A) 、 Rsa ( B) 限制性酶切图谱 Figure 3 Patterns of 16S rDNA of patial strains digested with H ae ( A) and Rsa ( B)

图 4 供试菌株 16Sr DNA PCR RFLP 分析 UPGMA 树状图 Figure 4 Dendrogram of UPGMA obtained from 16SrDNA PCR RFLP

NA 基因序列相似性大于 97% 的菌株归于同一个种 的规则[ 15] , 供试菌株分布于 7 个属 中, 即链霉菌属 ( S tr ep tomy ces sp. ) 、 厄氏菌属( Oerskovi a sp. ) 、 野 野村 菌 属 ( N onomuraea. sp. ) 、 单 孢 菌 属 ( Mi 小 cr omonosp ora sp. ) 、 拟诺卡氏菌属( N ocar diop sis) , 糖霉菌属 ( G ly comy ces) 和 纤维 菌属 ( Cell ulosi mi crobium ) 。 供试链霉菌属菌株 16S rDNA 序列系统发育结

结合形态特征, 从 6 个遗传群中选取了 10 株代 表菌株进行 16S rDNA 序列测定, 构建了野生药用 植物 内生放 线菌的 系统 进化树 ( 图5) 。 按16 SrD

分支上的数字表示可信度, 比例尺表示 100 个核苷酸里有 2 个替换, 括号里的为 GenBank 序列登录号。 T he numbers at the nodes indicate the levels of boo tst rap suppo rt ( % ) based o n 1 000 resampled data sets; o nly v alues above 50% ar e giv en. T he scale bar cor respo nds to 0 02 substitut ions per nucleotide position. N umber s in parentheses r e pr esent the sequences accession number in G enBank. 图 5 药用植物内生放线菌 16S rDNA 序列 N J 系统发育树分析 Figure 5 Phylogenetic tree ananlysis of 16S rDNA of endophytic actinomycetes

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果( 图 5) 表明, 供试链霉菌菌株形成了最大的一系 统发育分支群 , 不同链霉菌属内的不同种又形成 小的分支, 表明分离自不同药用植物的链霉菌具有 较高的多样性, 与 16S rDNA P CR RFL P 分析中各 菌株限制性酶图谱聚类分析结果一致。

muraea 以及 Cel l ul osimi cr obi um 在药 用植物 不常 见。 链霉菌属能产生类型多样的次生代谢产物, 是 寻找有用天然产物的重要来源 [ 19] , 目前从不同生境 中分离链霉菌属菌株仍是筛选新的生物活性化合物 的重要方式。本研究表明, 分离自不同野生药用植 物的链霉菌菌株, 虽然大多聚在同一遗传群内, 但从 它们的抗菌活性结果看, 供试菌株对 11 种指示菌均 表现出不同程度的抗菌活性, 预示这些内生放线菌 产 生是 多 种 活 性 成 分 的 化 合 物, 而非 单 一 化 合 物[ 2 0] , 为进一步寻找新型生物活性物质提供了良好 的放线菌种质资源。
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3

讨论
植物内生菌广泛存于不同的植物中, 因其与植

物各组织长期共生或寄生, 而具有与其他生境中微 生物不同的特性, 如促生、 抑制病原菌, 参与寄主某 种化合物的合成等作用。近年来, 受到研究者的广 泛关注。据统计, 全球大约有 300 000 种植物, 目前 仅对少部分植物进行过相关内生菌的研究 , 少见 对野生药用植物内生放线菌的研究。 本研究从采集 的 7 种野生药用植物中 分离出 106 株内生放线 菌, 从分 离效果看, 培养 基 E1、 E3 和 E4 较好, 这说明寡营养培养基分离野生 药用植 物内生放线菌效果最佳, 这与 P. Sar di 等人[ 16] 的研 究结果相似; 添加抑制剂 K 2 Cr 2 O7 、 萘啶酮酸可有效 抑制内生真菌及细菌的生长, 提高内生放线菌分离 率。植株不同部位内生放线菌的数量存在较大的差 异, 从根中分离的放线菌数量最多, 为 63 株, 占总数 的 59% , 而茎、 叶中分离的放线菌数量分别为 33 株 和 10 株, 占 31% 和 10% , 这与 J. H allmann 等人 的结果相似。
[ 17] [ 6]

[ 3]

[ 4]

[ 5]

[ 6] [ 7]

16S r DNA RFL P 分析是目前广泛应用于微生 物遗传多样性和种间系统发育关系研究, 其限制性 酶切图谱的类型具有种甚至菌株的特异性。对其中 的 42 个菌株进行 16S rDNA 扩增, H ae 切, 供试菌株被分成了 6 个遗传群。 从中选取 10 株代表菌 株, 测 定 16S rDNA 序 列、 构建了系统发育树状图。结果表明, 供试放线菌 分布于 7 个属, 即链霉菌属( Str ep tomy ces sp. ) 、 厄 氏菌属( Oerskovi a sp. ) 、 野野村菌属( N onomur aea. sp. ) 、 小单孢菌属( M icr omonosp ora sp. ) 、 拟诺卡氏 菌属( N ocar di op sis ) , 糖霉菌属 ( Gly comy ces) 和 纤 维菌属( Cel l ul osimi cr obi um ) 。这与从 巴拿马热 带 雨林 、 泰国木本及草本植物 以及澳大利亚禾本 [ 5] 科植 物 中 分 离 的 内 生 放 线 菌 类 群 存 在 区 别, Str ep tomy ces, Mi cr om onosp ora 在不同地点的不同 寄主 中都 有分布, 其 中 S tr ep t omy ces 属于 优势 菌 群, 数量大、 种群多, 表明链霉菌属对不同生境适应 能力较强。研究结果还反映出采自雅安的药用植物 中放线菌具有一定 的独特性, 如 Oerskovi a, N ono
[ 2] [ 18]

[ 8]

、 sa R


[ 9]

[ 10] [ 11]

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( 本文审稿: 艾晓辉; 责任编辑: 秦碧雯; 英文编辑: 刘益平)

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( 本文审稿: 卢伟东; 责任编辑: 巩艳红; 英文编辑: 李清源)


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