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植物启动子克隆技术


实 验 技 术 与 管 理 第 2 卷   第 8 期  2 1 年 8 月 I S  0 2-4 5 S N1 0 96 8 01 C 1 N 1-2 3 /             E prm na eh oo ya d M n g m n        V l2 04 T x ei etlT c nlg  n   a a e et o .8 N . o 8 A g 2 1

u . 01

实验技术与方法

植物启动子克隆技术
尹振君1 ,王秋平2 ,吴延东2 ,李合祥2 ,田景汉3
( 沧州职业技术学院 组培中心,河北 沧州  0 1 0 ; 沧州师范学院 后勤设备处, 1. 6 0 1 2. 河北 沧州  0 1 0 ; 沧州师范学院 生命科学系,河北 沧州  0 1 0 ) 6 0 1 3. 601

摘   要:启动子作为基因表达调控的重要元件, 成为分子生物学研究领域的 热 点。 随 着 P R 技 术 的 发 展, 从 C 已知序列出发, 克隆未知序列的方法日益成熟。综述了 近 年 来 植 物 启 动 子 克 隆 技 术 的 发 展 情 况 , 绍 了 基 于 介 包 反 P R 的染色体步行技术, 括: 向 P R ( vreP R) 随 机 引 物 P R( n o l rm dP R) C C I es   C 、 n C r d mypi e   C 、连 接 介 导 a 重点介绍了 TA L C 技 术, 对 该 技 术 方 法 的 优 点 及 局 限 性 进 行 了 并 P R (gt n eitdP R) C l a o -m dae   C 等方法, i i I -P R 探讨。 关键词:克隆技术;启动子;染色体步行;基因组; C P R 中图分类号:Q 8 - 3   文献标志码:A   文章编号: 0 24 5 (0 1 0 2 3-0 7 53 1 0 - 9 6 2 1 )8-0 5 4

Tcn uso  atpo oe oig ehi e fp n  mtr ln l r c n q
2 YnZ ejn ,W n  ipn 2 ,Wu Y n o g , iH xa g , inJn h n i  h nu 1 a g Qui g L   ein 2 Ta   g a 3 i  a d n

( C ne fTsu  u ue C n z o  oa o a eh oo yC l g , a gh u0 1 0 , hn ; 1. etro is eC l r , a gh u V ct nlT c nlg  o ee C n z o  6 0 1 C ia t i l 2. e at eto oi isa dE up et C n z o  ec es C l g , a gh u0 1 0 , hn ; D prm n  L g t  n  qi m n , a gh uT ahr ’ o ee C n z o  6 0 1 C ia f sc l 3. e at eto i  c ne C n z o  ec es C l g , a gh u0 1 0 , hn ) D prm n  Lf Si c , a gh uT ahr ’ o ee C n z o  6 0 1 C ia f e e l A s at A  n m otn  e et o e ee pes nrglt g tepo oe a eo eahtpt n m - bt c : sa  prat l m n  rg n x rsi  e ua n , h  r m trhsbc m   os o    o r i e f o i i lclrboo y eerhs Ao gwt  edvlp et fP Rtc nq e ,h  eh do  oigu k o ns - eua  lg   sac e . ln  ih h  eeo m n   C   hius tem to   c nn  n n w   i r t o e fl e f h e ir t r e t c i u ne r mt  n w   u ne s ecigm tr y T i a e  v s h  r m tr lnn  eeo m n  q ec  o   ek o nsq ec    ahn  aui . hsp pr eiw   epo oe  oigdvlp et n i t t f ic i rcn er , n  to ue h  c nq e   ho oo ew ligbsdo  h  C  m lia o ,nldn eetyas a d nrd cs e ehiuso cr m s m  akn  ae  nteP Ra p f t n icuig IvreP R, a d mypi e   C , n  gt n eitd P R.T i a e at ual  m hs e   I - n es  C rn o l rm d P R a dl a o -m dae   C i i hsp prpr clr e p ai s TA L z i y P Rtc nq ea d l srts t d atgsa dlmtt n . C   hiu n l tae  sa v na e n  i i s e iu i i ao K yw rs po oe ; ho oo ew lig g n mc P R e  od : r m tr cr m s m  akn ; e o i ; C

基    随着遗传学研究 的 深 入, 因 的 表 达 调 控 成 为 分 子生物学研究的热 点 和 前 沿。 基 因 表 达 的 程 序、 间 时 和位置在不同层次上 受 不 同 的 调 节 因 素 控 制, 种 控 这 制机制不仅决定基因 表 达 的 水 平, 决 定 基 因 表 达 的 也 时空顺序
[] 1

中起着关键作用。 对于基因组已经 测 序 的 生 物, 以 通 过 基 因 组 序 可 列信息获得基因的 5 上 游 序 列 进 行 启 动 子 功 能 分 析。 ′ 对于还未基因组测序 的 生 物, 隆 启 动 子 的 方 法 大 致 克
3 基因组文库筛选 可以分为 3 种 [-4]: NA 标签技术、 T-D 5 和基于 P R 的基因步移技术 [-7]。 C

。其中, 动 子 这 一 调 控 元 件 作 为 最 主 要 启

2 的一种转录调节 因 子 [ ], 所 特 有 的 结 构 在 基 因 调 控 它

1 T D A 标签技术 - N
收稿日期:0 1-0 0 2 1 3-2 基金项目: 国家自然科学基金项目(0 7 1 0 4911 ) , 河 作者简介: 尹振君(9 3—) 女, 北 泊 头, 教 授, 要 研 究 方 向 为 作 副 主 16 物栽培与组织培养 E-m i: q c @ o c m a w pz t m. l o , 河 通信作者: 田景汉(9 8—) 男, 北 沧 州, 教 授, 要 研 究 方 向 为 湿 副 主 16 地生态与分子生物学 . E-m i:n w @1 3. m a an t 6 c l o

又 的 T-D NA 标签技术 ( 称 为 基 因 陷 阱) 基 本 原 理 是向植物受体引入一 个 没 有 启 动 子 的 报 告 基 因, 这 当 一基因被受体基因组 的 一 个 基 因 的 启 动 子 下 游 时, 该 基因被激活, 从而与基因形成可以共转录的融合基因。 此时报告基因的表达模式反应了原有基因所具有的调 控特性。这个插入基因的序列应与原有基因及其启动 子紧密连锁, 这样 就 很 容 易 被 分 离 和 克 隆。 由 于 这 种

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实 验 技 术 与 管 理

报告基因的插入是随 机 插 入, 而 不 能 用 于 定 向 的 克 因 隆某一基因的启动子, 以 这 种 方 法 的 使 用 也 受 到 一 所 定的限制。

结果很难判断。为解决此问题, 人们提出一种新 杂带, 的方法, 不 对 称 交 错 P R[-1 ]( e m lay er 热 C 9 0 t r a s mm t c h i 改 itr cdP R, I - C ) 通 过 对 温 度 的 控 制, nel e   C TA L P R , a 变传统 P R 过 程。 实 现 随 机 引 物 与 特 异 引 物 的 特 异 C 扩增。 TA L P R 技术 的 基 本 原 理 是 利 用 目 标 序 列 旁 I- C 的 已 知 序 列 设 计 3 个 嵌 套 的 特 异 性 引 物 (pc i s ei c f rm r 简称 sls 2, 3, 2 p) 用 它 们 分 别 和 1 pi e , p , s 约 0b , p p 个具有 低 Tm 值 的 短 的 (4 p) 机 简 并 引 物 (ri 1b 随 ab- 以 tayd g nrt rm 简 称 A ) 组 合, 基 因 组 rr  e e eaepi e D 相 根据引物的长短和特异性的差异设计 D NA 作为模板, 不对称的温度循环, 通过分级反应来扩增特异引物。 由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的 ( 由 P R 反应 会 产 生 3 种 不 同 类 型 的 产 物:1) 特 异 性 C () 引物和简并引物扩增出的产物;2 由同一特异性引物 () 扩增出的产物;3 由同一简并引物扩增出的产物。在 后 TA L P R 反应中, 2 种 非 目 标 产 物 可 以 通 过 以 嵌 I- C 套的特异性引物进行的后续反应消除。 TA L P R 一 般 分 为 3 次 反 应。 第 1 次 P R 反 I- C C 应由 5 次高特异性反应、 次低特异性反应,0 次较低 1 1 特异性反应和 1 次 热 不 对 称 的 超 级 循 环 构 成。 通 过 2 使 p 5 次高特异性反应, sl与 已 知 的 序 列 退 火 并 延 伸, 提高目标序列的浓度。1 次低特异性的 反 应 使 简 并 引 物结合到较多的目标序列上,0 次较低 特 异 性 的 反 应 1 随后进行 1 次 TA L 循 使 2 种引物均能与模板退火, 2 I 环。经过上述 反 应 得 到 了 不 同 浓 度 的 3 种 类 型 的 产 。 特异性产物( 型) 非 特 异 性 产 物 ( 型 和 3 型) 和 物: 1 2 第 2 次反应则将 第 1 次 反 应 的 产 物 稀 释10 0倍 作 为  0 模板, 通过 1 次热不 对 称 的 超 级 循 环, 特 异 性 的 产 使 0 物被选择性地扩增, 非 特 异 性 的 产 物 被 压 制 到 极 低 而 的含 量。 第 3 次 反 应 又 将 第 2 次 反 应 的 产 物 稀 释 一 10 0倍作 为 模 板, 般 设 置 为 普 通 的 P R 反 应 或 热 C  0 不对 称 的 超 级 循 环。 通 过 上 述 3 次 P R 反 应 可 获 得 C 与已知序列邻近的目标序列。 TA L P R 技术有以下优点: I- C ( )简单。不涉及连接反应, 只要设计好 引物, 即 1 可用基因组 D NA 作模板直接筛选到目标序列。 ( )特异性高。用短的简并引物和长的特异 性嵌 2 套引物相组合, 通过不对称的温度循环和分级反应, 使 反应体系有利于特异 引 物 的 扩 增, 终 的 扩 增 产 物 中 最 目的片段占绝对优势。 ( )快 速。 整 个 TA L P R 反 应 循 环 能 够 在 一 3 I- C 天内完成, 可以快速地获得目标片段。 3. 连接介导 P R 3  C 用具 有 末 端 的 D NA 限 制 性 内 切 酶 消 化 基 因 组 然后将预先设计好的 D D NA, NA 接头连接在该 D NA

2  基因组文库筛选
基因组文库筛选是定向获得某一特定基因启动子 的方法。为了从基因组文库中获得某一特定基因的启 动子片段, 必须以特 定 基 因 的 部 分 序 列 或 全 序 列 为 探 对文库所有克隆进行筛选, 能杂交的克隆可能含有 针, 该基因及启动子序 列。 但 这 种 方 法 需 要 构 建 载 体、 建 转化、 筛选, 作 量 较 大。 况 且 高 等 生 物 基 因 组 庞 工 库、 杂, 构建基因组文库 困 难, 此 方 法 难 以 实 现, 在 逐 故 现 渐被 P R 方法取代。 C

3  基于 P R 的基因步移技术 C
自 1 8 年 MU L S 发明 P R 技术以来, 人们试 93 LI C 克 图用此进行基因步 移, 隆 位 于 基 因 5 上 游 的 启 动 子 ′ 序列。 典 型 的 P R 反 应 需 要 2 个 分 别 位 于 目 标 序 列 C 而在基 因 步 移 时 目 的 序 列 只 有 一 端 是 已 两端的引物, 知的。因此, 利用 P R 技术进行步移的关键是人工设 C 计 P R 所需的另一引物。到目前为止, 这些方法大致 C 反 可以分为 3 种 类 型: 向 P R( vreP R) 随 机 引 C i es   C 、 n 物 P R (a d my pi e   C ) 连 接 介 导 P R C rn o l  rm d P R 和 C [ 8 (gt n eitdP R) ]。 l a o -m dae   C i i 3. 反向 P R 1  C 反向的基本原理是用已知片段上没有切点的限制 可能会在已知片段的两端 性内切酶酶切基因组 D NA, 产生切口, 切口经分子内连接后, 会产生包含已知片段 的环状 D 用已知片段上两端已知序列合成一个向 NA, 已知序列上游和一 个 向 已 知 序 列 下 游 延 伸 的 引 物, 经 会扩增出被上述限 制 性 内 切 酶 位 点 分 隔 的 P R 以后, C 己知序列的上游和下 游 序 列, 而 实 现 向 己 知 序 列 上 从 游和下游的移动。 反向 P R 是使用最早的方法, 主要弊端是要求已 C 知D NA 序列和未 知 D NA 序 列 中 有 相 同 的 限 制 性 内 切酶识别位 点。 理 想 的 实 验 要 求 P R 扩 增 时 包 含 的 C 已知序列应尽量短, 知 序 列 尽 可 能 长 些。 但 是 在 一 未 个较短的已知区( 5k ) <0. b 和未知区存在相同的酶切 位点的机率较低, 具有一定的随机性; 另一个弊端是因 为基因组 D 目标 D NA 太复杂, NA 分子的环化困难。 3. 随机引物 P R 2  C 早期的随机引物就是用一个随机引物与已知基因 的特异引物对扩, 于 随 机 引 物 退 火 温 度 与 特 异 引 物 由 有一定差距, C 成 功 率 低。 当 退 火 温 度 高 时, 机 随 P R 引物很 难 与 模 板 结 合, P R 产 物 产 生; 当 退 火 温 无 C 而 度低时, 特异引物特 异 性 降 低, 配 率 极 高, 现 大 量 错 出

尹振君, 等:植物启动子克隆技术

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片段的两端, 样 的 一 组 两 端 带 有 接 头 的 D 这 NA 片 段 就称为无载 体 的 D 根 NA 文 库; 据 接 头 和 目 的 基 因 的 序列设计 2 组引物, 以上 述 的 D 先 NA 为 模 板, 以 外 侧 的一组引物进行第一轮 P R 扩增, 然后以内侧的一组 C 引物进行巢式 P R 扩增, 根据 2 次 P R 引物在 D C C NA 中的相差距离, 分析 P R 产物, 获得目的片段。 C 采用限制酶 消 化 基 因 组 D 加 NA 后, 上 己 知 接 头 序列构建 G n m   akr文库的方法来提供 P R 需 e o e W le C 使得实验路线简单, 便于操作。巢式 要的另一条引物, 但 P R 可提高 P R 的 特 异 性 和 灵 敏 度, 是 由 于 存 在 C C 干扰结果分析。为此, 人们设计一 接头引物自扩问题, 系列特殊接头, 防止接头引物自扩。 3. 1  盒式 P R (l ocset  C ) 3. C Oi - asteP R g 其原理是 在 设 计 上 要 求 接 头 的 5 末 端 没 有 磷 酸 ′ 这样可以 在 基 因 组 D 基, NA 限 制 性 内 切 酶 酶 切 产 物 的 3 末端和 接 头 的 5 末 端 的 连 接 部 位 形 成 缺 口。 在 ′ ′ 从接头引物开始的 第 1 次 P R 反应的第 1 个循环时, C 延伸反应可以在连接 部 位 终 止, 制 了 接 头 引 物 之 间 限 从而控制了非特异性 P R 扩增。只有从特异 的扩增, C 引物开始延 伸 合 成 的 D 才 NA 链, 能 成 为 接 头 引 物 的 模板, 行 D 进 NA 的 特 异 性 扩 增 反 应。 再 用 内 侧 第 2 对接头引物与特异引物进一步进行巢式 P R 反应, 可 C 以高效特异性扩增目的 D NA。 3. 2  衔接头 P R 3. C 衔接头 P R 原 理 是 基 因 组 D C NA 用 限 制 性 内 切 酶酶切后, 酶切产物连接衔接头, 衔接头由一长一短两 在 它 条链组成, 衔 接 头 短 链 的 3 末 端 有 一 个 氨 基, 能 ′ 够阻止聚合酶催化的衔接头短链的延伸。在首轮 P R C 中, 只在限定的远 端 基 因 特 异 引 物 有 结 合 位 点。 当 基 因特异引物 延 伸 产 生 的 D 才 NA 链 通 过 衔 接 头 时, 能 产生衔接头引物的结合位点, 这样 P R 才能以衔接头 C 引物和基因特异引 物 进 行 指 数 扩 增。 另 一 方 面, 果 如 由非特异合成产生了 D NA 两端 都 有 双 链 衔 接 头 序 列 的 P R 产物时, 这种 P R 产物在每次变性之后, 单链 C C D NA 末端的衔 接 头 反 向 重 复 序 列 将 形 成 锅 柄 ( a - pn [1] 1 由 h nl ) a de 结构 , 于 这 一 结 构 比 引 物 一 模 板 杂 交 更 稳定, 能 够 抑 制 非 特 异 序 列 的 指 数 扩 增。 在 正 常 它 这 P R 中, C 产物只 有 一 端 含 有 衔 接 头 序 列, 种 产 C P R 物不形成锅柄结构, 因而 P R 扩增能够正常进行。 C 3. 3 Y 形接头法 3. Y 形接头法的原理在于接头一端的几个碱基不是 接头引物处于 Y 形接头的 2 个 分 叉 单 链 互补配对的, 上, 序列与接头一样, 只有与特异引物引导合成了接头 的互补序列后, 头 引 物 才 能 退 火 参 与 扩 增。 与 衔 接 接 头方法比较只需合成 较 短 的 接 头 ( 接 头 长 链 一 般 大 衔 于 4 b ) 也不需要氨基化。 0p ,

3. 4 Tl krP R 3. n -i e  C 原理是将用于 Tl krP R 的基因组 D n NA 通过 -i e C 末端 转 移 酶 ( e x n c oiy  rnfrs , d ) D o y ul t l T a seae T T 加 e d 多聚胸腺 嘌 呤 核 苷 酸 P l  ( ) 尾 以 消 除 基 因 组 oy d T n D NA 分子的 3 凹端和平 端 形 成 全 部 末 端 为 3 凸 出 端 ′ ′ 的双链 D 然后再将以上 D NA 分子; NA 用产生 3 凸出 ′ 产 端的限制性内切酶 进 行 酶 切, 生 全 部 为 3 凸 出 端 的 ′ 再利用 T q 酶在 P R 产 物 3 末 端 和 平 端 D NA 片段, a C ′ 用 D NA 分子的 3 末 端 增 加 一 个 A 的 特 点, 特 异 引 物 ′ , 使 目 的 片 段 3 末 端 为 A, 以 和 T 进行单 轮 P R 仅 可 C ′ 特异配对结合。 于是, 带有 3 -A 尾的 D ′ NA 分子 就 可 以和 Tl kr C 技术中的 Tl kr接头特异接合。 n n -i e P R -i e 在得到目标 D NA 分子与 Tl kr C 接合 的 连 n -i e P R 接产 物 后, 目 标 分 子 中 的 特 异 引 物 和 Tl kr C 用 n -i e P R 中的引物做 P R 反应就可以扩增出特异性高、 片段长 C 度大的 P R 产物( C 1~2k ) b 。这些产物包含一小段 已 实 知D NA 和它下游的较长 一 段 未 知 D NA, 现 了 从 已 知的 目 标 D NA 区 域 步 查 进 入 它 侧 翼 的 未 知 区 域 的 目的。 Tl krP R 从接头和目标 D n NA 分 子 的 连 接 入 -i e  C 手以特异的 Tl krP R 取代了传统的接头(d po n a atr -i e C 或 cset 或 vcorte , 现 了 接 头 和 目 标 D aste etret ) 实 NA 分子的特异性连接。由于这种特异性连接极大地提高 了步查 P R 扩增的特异性和有效率。 C 3. 5  锚定 3. 人们根据同 聚 物 加 尾 原 理 设 计 了 一 种 锚 定 P R C (n h rdP R) 可 a c oe   C 技术, 用 于 从 复 杂 的 基 因 组 中 高 效 克隆已知 D 并 NA 片 段 的 侧 翼 序 列, 且 无 需 进 行 限 制 性内切酶消化或连接 反 应, 一 技 术 在 操 作 上 与 传 统 这 的 5 R C 技术有部分相 似 之 处, 两 者 在 本 质 上 是 但 ′A E 不同 的。 锚 定 P R 方 法 主 要 由 以 下 3 个 步 骤 组 成: C ( )以基因组总 D 用一条基因特异性引物 1 NA 为模板, ( S 1 进行线性 P R 扩 增, 生 单 链 扩 增 产 物;2) ( 产 GP) C 在末端 转 移 酶 ( d ) 作 用 下, 单 链 D 在 TT 的 NA 分 子 的 ( 3 末端加上 多 聚 胞 嘧 啶;3)用 巢 式 基 因 特 异 性 引 物 ′ ( S 2 和与多聚胞 嘧 啶 配 对 的 锚 定 引 物 ( P) 加 GP) AA 对 尾的产物进 行 P R 扩 增, C 产 物 连 入 载 体 后 进 行 C P R 测序鉴定。 3. 6  生物素俘获 P R (it - atr  C ) 3. C Boi cpueP R n 首先根据已知序列 设 计 引 物, 在 引 物 的 5 端 添 并 ′ 加生物素, 然后 用 此 引 物 对 模 板 D NA 进 行 线 性 P R C 扩增, 扩增完成后加入亲和素包被的磁珠, 通过生物素 和亲和素之间的特殊 结 合 力, 珠 牢 固 连 接 引 物 形 成 磁 核酸 -生物素化探 针 杂 合 体, 磁 架 收 集 后, 低 盐 缓 用 经 冲液洗涤, 去除蛋白质、 NA 及非特异核酸, 即得所需 D 纯化的特异扩增产物。亲和素和生物素之间是非共价

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实 验 技 术 与 管 理
4 74 3. 5-6 [ ]R snhl A,M c in n R  ,Se h n D, ta .P R w lig 4 oeta  a Kn o   N tp e   e l C   akn fo mcoisc o   o e M 4ietis he x n  o  h  u r m ird et nc n   5 d nie  ree o s r mteh - s i l f t f m ng n o h  erl e  d ein m lcl 1 ( AM-L )J . a  e e r en ua cl a hs   oeueL C f t o 1 []   l N c i c sR s 1 9 , 9 1 ) 5 9 - 4 1. ul cAi  e , 9 1 1 (9 : 3 55 0 e d [ ] tr yF,H l br   , lx n eso   , t l Drc e u ni - 5 Sek   om egA Ae a drs nG e  . iet q e c a s n o atr lati a cr m s m s B C ) n   r kro c g - a ic l i gfbcei  r f i   ho oo e ( A s a d po ayt   e n m sb  it - atr  C [ ] J Boeh o , 9 8, 0( - ) o e ybo ncpue P R J .  itc nl 1 9 6 12 : i 1 91 9. 1-2 [ ]W rh w k   ,Ml rL.   pdg n mcw lig ehiu  ae 6 as a s yD ie  Ar i e o i akn   c nq ebsd l a t o  gt n eitdP R a d m g e csprt ntc nlg [ ] nl a o -m dae   C  n   a nt  e aa o  eh oo y J . i i i i Boehius 1 9 , 6 5 : 9 - 9 itc nq e , 9 4 1 ( ) 7 27 8. [ ]Y n Y X,A     , iL, ta .Tl krseic ia o   C ( - 7 a    n C C L  e l -i e- pci l t nP R T n f g i l krP R) A  d a cdP Rtc nq e o ho oo ew lig i e C : na v ne  C   hiu  r r m s m  akn n e f c o o  oa o  f a gdD  n sJ .N c i c sR s 2 0 , r r slt no  g e   NAe d [] ul cAi  e , 0 3 f i i t e d 3 (2 : 8. 11 ) 6 [ ] fi rG P,Rg s A  8 Pe e     f ig   D.G n mcsq e c gb  gt n eitd e o i e u ni  yl a o -m dae n i i P R[] o itc nl 1 9 , ( ) 2 12 8. C J .M lBoeh o , 9 6 5 3 : 8 - 8 [ ] i   G,Wh t rR F.T e m l s mm t c nelcdP R: u 9 Lu Y  ii     te hr a  y er   tr e   C a - a ii a t m tbea p f a o  n   q e c go isr n  a m ns r m o aal m li t na ds u ni     et d rg et  o ic i e n fn e f f l f c P n   Cco e  r ho oo ew lig J . e o is 1 9 , 1a dYA   ns o  r m s m  akn [] G n mc , 9 5 2 ( ) 6 46 1. 53 : 7 - 8 [0 T ru h  ,K h  1 ] ea ciR al G.R pdioa o  fpo oe e u ne  y ai slt n o r m trsq e csb i TA L P R:h - lnig ein   a n  g e e  o  a s I - C te f kn   go s fPl dPi ns r my m 5 a r o a f g (isoe )J .M lG n G nt 2 0 , 6 ( ) 5 45 0. Docra [] o e  e e , 0 0 2 3 3 : 5 - 6 [1] o e   H, W nsofrS C.S q e c pci e ea o  fa i 1 J ns D  ii re    t e u neseicg nrt n o  f s ic i a D  a h nl e mt  C   m lia o  fu k o nf nig NA p n a depr i P R a p f t n o  n n w  l kn D NA[] ul cAisR s 1 9 , 0 3 : 9 - 0 J .N c i c  e , 9 2 2 ( ) 5 56 0. e d

连接, 结合十分稳定, 耐 受 纯 化 过 程 中 所 涉 及 的 酸、 能 碱及高浓度盐等处 理, 温 度 也 有 一 定 的 耐 受 性。 磁 对 珠在磁架磁场中能很快沉淀, 再在产物末端加接头, 这 样利用接头引物与特异引物就可以扩增目的片段。

4  结束语
以上介绍 的 这 几 种 方 法 基 本 上 代 表 了 现 有 的 用 它 有 P R 技术进行 染 色 体 步 行 的 方 法, 们 不 尽 完 善, C 一定的适用 时 期 和 适 用 范 围。 在 利 用 反 向 P R 与 连 C 接介导 P R 技术中, 都需要酶切、 连接等复杂操作, 必 C 并 须产生一个包括部分 已 知 序 列 的 酶 切 产 物, 且 酶 切 片段不能太长, 则 不 能 有 效 扩 增。 再 加 上 酶 切 位 点 否 的不确定性, 更增加了实验难度。锚定 P R 技术步骤 C 简单, 虽然有时步移长度有限, 但是可以多次步移达到 理想长度。 参考文献( eee cs R frne )
[ ] u bo kJ Fi c    ,M na sT,t l oeua  oig A 1 S m ro   , r shEF ait   e  .M lclr lnn , t i a c lb rtr  a ul M] Bin : c nePes 1 9 a oaoy m n a [ . eig Si c  rs . 9 2. e j [ ]G o H,M oeSP.C nevdn noigsq e csa o gcl - 2 u  o s    o sre  o cdn  e u ne  m n  u i t vtdcra  e o e d ni   a ddt e uaoy sq e c l - ae eelg n m siet y cniae rgltr  e u ne e f e m nsa d pten f po oe  vlt n[ ] h   ln  e , et n   atrs o  r m tr e oui J .T e Pat Cl o l 2 0 , 5 5 : 1 31 5 0 3 1 ( ) 1 4 - 1 8. [ ] i   G,Mtu a a N,O s m   , ta .Ef in slt na d 3 Lu Y  i kw   s ou iT e l f c t oa o  n ie i i shi n   i bt m pigo  rbd pi  a a aT-D   srjnt n  y hr a a pn  fA aio s t l n   NAi et u c o s   e m l a 3 : ay er   tr cdP R[ ] te PatJ unl 1 9 ,8( ) s mm t c nel e   C J . h  ln o ra , 9 5 ii

櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍 ( 上接第 2 0 页) 4 并联系当地电视台进 行 播 出; 励 心 理 学 和 法 律 专 业 鼓 学生开设心理咨询室 和 法 律 咨 询 室; 励 档 案 实 验 室 鼓 对外进行旧档案修复和旧字画修裱等。 学有 所 用, 用 致 学, 实 的 环 境、 实 的 压 力 会 以 真 真 逼迫学生自主学习, 并将理论和实践相结合, 将知识内 化为能力, 为学生的就业和创业打下良好基础; 真实的 压力也会逼迫学生去 创 新, 知 识 的 综 合 运 用 中 去 寻 在 找新的创新点。 参考文献( eee cs R frne )
[ ]陈生萍, 李宗范 .加 强 实 验 教 学 中 心 建 设 推 进 实 验 教 学 改 革 [ ] 1 J. 实验室研究与探索,0 0,9 3 :1 - 1 2 1 2 ( )1 41 7. [ ]尤赤矶, 徐晓辉 .创建一流经济与管理实验教学基地[] 实验室研 2 J. 究与探索,0 0,9 1 :89 2 1 2 ( )8 - 1. [ ]刘勇, 郭科, 彭蓉 .把“ 市场” 在 实 验 室 把“ 业” 给 学 生[] 实 建 企 交 3 J. 验室研究与探索, 0 0,9 3 :7 - 7 2 1 2 ( )1 31 5. [ ]张潞英 .开发研究性实验 培 养 创 新 人 才 [ ] 实 验 室 研 究 与 探 索, 4 J. 2 0 ,5 9 :1 71 2 0 6 2 ( )1 2 - 1 9. [ ]朱科蓉 .文科实验室的建设意义 与 策 略 — —以 北 京 联 合 大 学 应 用 — 5 文科综合实验教学中心为例[] 现代教育管理,0 0 7 :76 J. 2 1 ( )6 - 9. [ ]张革华, — 彭娟 .试析文科实验室对大学生素质 教 育 的 作 用 — —深 圳 6 大学经济学 院 商 学 实 验 中 心 的 教 学 实 践 [ ] 实 验 技 术 与 管 理, J. 2 0 ,6 5 :4 - 4 0 9 2 ( )1 01 3. [ ]涂俊 .文 科 开 放 实 验 的 实 施 与 管 理 探 索 [ ] 实 验 技 术 与 管 理, 7 J. 2 1 ,7 1 :0 - 0 0 0 2 ( )1 61 7. [ ]林家莲 .文科综合实验教学示 范 中 心 建 设 途 径 的 研 究 与 探 索 [ ] 8 J. 实验技术与管理,0 1,8 4 :0 - 0 2 1 2 ( )1 41 9. [ ]舒慧东 . 知识管理视角下的文科实验教学模式创新研究[] 实 验 技 9 J. 术与管理,0 0,7 5 :5 - 6 2 1 2 ( )1 61 0. [0 文 1 ]涂 俊 . 科 开 放 实 验 的 实 施 与 管 理 探 索 [ ] 实 验 技 术 与 管 理, J. 2 1 ,7 1 :0 - 0 0 0 2 ( )1 61 7.

5  结束语
文科综合实验教学是对 传 统 文 科 实 验 教 学 的 发 展与创新, 随着高等教育教学改革不断深化, 提 是 而 出的新理念、 思 维, 处 于 探 索 阶 段, 有 现 成 的 新 尚 没 模式可供参考。我校文科综合实验教学以实验 教 学 中心为基地, 足于人才培养, 力提高学生的实践 立 着 能力和创新能力, 多个方面进行了探索, 建了自 从 创 己的特色。


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