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磁珠分选步骤


磁性标记和分选步骤: 1. 制备无菌 Buffers,冰上放置。 细胞染色缓冲液(cell-staining buffer) :含 3%热灭活胎牛血清和 0.1%叠氮化钠的 PBS。 1× BD IMag? buffer: 按 1:10 稀释(10X)BD IMag? Buffer ,用无菌蒸馏水或加有 0.5% BSA,2 mM EDTA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 稀释。 2. 无菌操作,从外周淋巴组织内制备单细胞悬浮液。然后用 70?m 的尼龙细胞过滤器滤除 细胞簇和组织碎片。用 cell-staining buffer 制备细胞悬浮液。 3. 细胞计数:如果细胞浓度在 10 x 106 和 20 x 106/ml 之间进行第 3 步,如果浓度低于 10 x 106 如,离心细胞,并用 cell-staining buffer 重悬细胞至终浓度 20 x 106/ml。 4. 可选:在细胞悬液内添加 BD Mouse Fc Block 纯化的抗小鼠 CD16/CD32 单克隆抗体 2.4G2(BD Mouse Fc Block? purified anti-mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2) ,每 1 x 106 个细胞 添加 0.25μg,然后冰浴 15min. 5. 添加生物素标记的小鼠树突状细胞富集混合物(Bioinylated Mouse Dendritic Cell Enrichment
Cocktail) ,每 1 x 10 个细胞添加 5μl ,冰浴 15min.
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6. 用 10x 过量体积的 1X BD IMag? buffer 洗涤标记细胞,300 ? g 离心 7 分钟 并小心吸去 所有上清液。 彻底涡旋 BD IMag? Streptavidin Particles Plus – DM 后,每 1 x 106 个细胞添加 5μl。 混匀,然后 6?C - 12?C 冷藏 30min. 用 1X BD IMag? buffer 将标签量提高到 20 到 80 x 106/ml。 把标记细胞转移到 12 x 75 mm 的圆底试管,添加的最大体积不超过 1.0ml。把这个 positive-fraction 管放到 BD IMagnet?(水平位置)8min。 对于较大体积,可把细胞转移到 17 x 100 mm 圆底试管,添加的最大的体积不超过 3.0ml。把这个 positive-fraction 管放到 BD IMagnet?(垂直位置)8min。 当管在 BD IMagnet?上时,用无菌巴斯德吸管轻轻的吸取上清至一个新的无菌管内。 从 BD IMagnet?取出 positive-fraction 管, 添加 1X BD IMag? buffer 到与步骤 8 相同的 体积。 上下吹打 10-15 次,重悬 positive fraction well,并重置于 BD IMagnet?上 6-8min. 对 17 x 100 mm 管,重置于 BD IMagnet?上 8min。 用一个新的巴斯德吸管轻轻吸上清和步骤 10 中的 enriched fraction。混合。 把含有结合 enriched fraction 的管再置于 BD IMagnet?6-8min。 对 17 x 100 mm 管,重置于 BD IMagnet?上 8min。 轻轻吸出上清并置于一个新的无菌管内。两次 enriched fraction 不含有 bound antibodies 和磁性粒子。细胞可用后续应用。 留在原管内的正选细胞可用适当的缓冲液或培养基重悬以备后续应用,包括流式细胞系 检测。 未分离的细胞悬浮液样品和正选富集 positive and enriched fractions 的样品,应用流式细 胞仪评估细胞分离效率。

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