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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化


第一节 概 述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能 自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。 转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段

,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株, 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R?,M?),它可以容忍外源 DNA 分子进入 体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成 为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的 遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞 制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但 CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求, 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此 CaCl2 法为使用更广泛。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的 菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的 OD600 来控制。DH5α 菌株的 OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的 外源 DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng 的 cccDNA 即可使 50?l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过 感受态细胞体积的 5%。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如 CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或 AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂 都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质粒共保温,实现转化。 由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性 基因(Ampr ),可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS,则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞 (转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质粒共保温,实现转化。 由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性 基因(Ampr ),可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS,则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞 (转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。

第二节 材料、设备及试剂 一. 材料 E. coli DH5α 菌株: R?,M?,Amp?;pBS 质粒 DNA: 购买或实验室自制,eppendorf 管。 二. 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 三. 试剂 1.LB 固体和液体培养基:配方见第一章。 2.Amp 母液:配方见第一章。 3.含 Amp 的 LB 固体培养基:将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至 60℃左右,加入 Amp 储存液,使终浓度为 50ug/ml,摇匀后铺板。 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取 52g 麦康凯琼脂,加蒸馏水 1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至 60℃左右加入 Amp 储存液使终 浓度为 50ug/ml,然后摇匀后涂板。 5.0.05mol/L CaCl2 溶液:称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于 50ml 重蒸水中,定容至 100ml,高压灭菌。 6.含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl2: 称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于 50ml 重蒸水中,加入 15ml 甘油,定容至 100ml,高压灭菌。

第三节 操作步骤 一、 受体菌的培养

从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5α 单菌落,接种于 3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养 12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液 以 1:100-1:50 的比例接种于 100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 =0.5 左右。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置 10 分钟,然后于 4℃下 3000g 离心 10 分钟。 2、 弃去上清,用预冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30 分钟后,4℃下 3000g 离心 10 分钟。 3、弃去上清,加入 4ml 预冷含 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、 感受态细胞分装成 200?l 的小份,贮存于-70℃可保存半年。 三、 转化 1、从-70℃冰箱中取 200?l 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 2、 加入 pBS 质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10?l),轻轻摇匀,冰上放置 30 分钟后。 3、42℃水浴中热击 90 秒或 37℃水浴 5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。 4、向管中加入 1ml LB 液体培养基(不含 Amp),混匀后 37℃振荡培养 1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。 5、 将上述菌液摇匀后取 100?l 涂布于含 Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养 16-24 小时。 同时做两个对照: 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5?l 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。 四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下: 转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率(转化子数/每 mg 质粒 DNA)=转化子总数/质粒 DNA 加入量(mg) 感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数 [注意] 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液 进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

高效感受态细胞制作

方法一

A 液:1M,MnCl2: B 液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配,配后不需灭菌; C 液 称取 CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部转入细口试剂瓶,然后加入 46ml 三蒸水,轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线 包扎,然后放入灭菌锅 121℃高压灭菌备用。 取 1 管 B 液(0.6ml) ,全部加入 C 液(46ml)中,混匀后,再用 1ml 移液器加入 3.3ml A 液,混匀冰浴即可使用。 划线得到单菌落,37℃培养箱培养约 17 小时, 挑取 2-4 个形态饱满的单菌落接种于装有 100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡(300 rpms) 培养 3-4 小时, 将培养温度调至 18℃剧烈振荡(3280 rpms)培养,其余与普通感受态差不多,每管加入 4ml TB 缓冲液,轻轻振荡,使菌体重新 悬浮,加入 280ml DMSO(可用国产分析纯) ,混匀后分装入 1.5ml EP 管,冰上静置 15 分钟。用纱布将所有装有感受态的 EP 管包好,用棉线系好 后放入液氮中速冻,在液氮中静置 12 小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。 效率非常高,一般可到 10*8,好时可到 10*9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。无菌都无所谓,在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过 2500g,建议 1500-2000g 5min。涂板要注意,不要觉得不匀而多 次反复,轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可,特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴 2 小时以上的板。涂完后建议空气晾干(20-30

分钟)这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要,只要注意就行了,我在去残液时经常在室温倒置 1min,对感受态效率提高有帮助,第一次多加 一点缓冲液,我经常加至 20ml,效果不错。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将 LB 平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的 EP 管冰箱即开 始转化。对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。 现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化, 可达到 1010, 但是操作起来比较麻烦。 要想又简单, 又能有较高的转化效率, 最好的莫过于 1990 年 《gene》 上刊登的由 Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。 根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了 GLP 文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也 有一定的帮助。 1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑。 2、培养基的装量:培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效 率高的感受态的。建议装量不要高于此值为:培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。 3、培养基的 pH 值。这是讲的 pH 值并非单指配置或灭菌后的 pH 值,而且还包括整个摇瓶结束后的 pH 值。一般来说,接种前的 pH 值在 6.8-7.2, 等菌摇好后,可以测一下 pH 值,不要低于 6.0,最好在 6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低。 4、培养后的 OD 值。其实这并一个非常重要的参数,只是当 OD 值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强 调 OD 不得大于 0.6,0.8 等等。同时,OD 值大时菌体总量大,因而感受态绝对数量要大一点,因而需要在 OD 值的两方面影响中找一个平衡点。 5、 培养基中的各种离子。 经验证明, 当培养基中存在一定量的 Mg2+离子时, 该方法制得的感受态要相对较高。 在制备普通感受时, 使用 20mM MgCl2 做为培养基的添加物,在感受态收获之前 20-30 分钟加入,会收到很好的效果。 6、培养温度。文献及经验告诉我们,较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了 Inoue 的 高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。 7、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO 要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加。 8、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存 12 小时以后再转入超低温冰箱, 这点未做实验,只是一种感觉,第一次这样做了,没问题,以后就照此办理而已。

方法二

1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101 等,在 LB 平板上划线,37 度过夜至长出单菌落. 2.挑直径 1-3 毫米的单菌落*可多个, 接种到 250 毫升/3 升锥形瓶 或 80 毫升/1 升锥形瓶的 SOB 培养基. 培养基量不可再多,会影响效率. 3.在 18 度 150-250RPM 培养 19-50 小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于 37 度. 4.OD600 约 0.4-0.8 时停止培养, 放在冰水中冷却 10 分钟 5. 4 度, 300RPM 离心 15 分钟, 回收菌体 6.去掉上清后, 用 1/3 体积的冰冷 TB 溶液悬浮, 在冷 10 分钟 7.再次离心回收菌体 8.用 1/12.5 体积的 TB 悬浮, 添加最终浓度为 7%的 DMSO, 再冷却 10 分钟 9.0.1-1 毫升分装, 直接在液氮中冻上. 10.在液氮或-80 度保存.

【zihudie】

(1)将置于液氮保存的大肠杆菌划线在 LB 平板上,37℃培养活化。 (2)挑取经活化的大肠杆菌单菌落于 SOC 液体培养基,18℃,200-250rpm 培养。 (3)当 OD600=0.5-0.8 时,用预冷的 40mL 离心管于 4℃,8000rpm 离心 10min,收集菌体。 (4)用预冷的 TB Buffer 重悬菌体,4℃,8000rpm 离心 10min,收集菌体。 (5)重复第 4 步操作。 (6)用 8mL 预冷的 TB Buffer 重悬菌体,缓慢加入 DMSO 至终浓度 7% 。 (7)冰浴 10min 后,分装保存于液氮中。 本法效率极高,建议大家采纳

【yog】

1. 单菌落-------2ml LB 37 度 120RPM 过夜------1%转接-------37 度 200RPM2 小时(OD 到 0.4~0.5) 2. 2ml, 冰浴 15min, 4 度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于 1ml0.1MCaCl2 中, 冰浴 20min 3. 4 度, 6000RPM 10min, 重悬浮于 200ul 0.1MCaCl2 中, 冰浴 30min

建议用 TSS 法,简单方便,比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。 以下为转贴,具体方法请最好查阅文献。

E.coli 感受态细胞制备方法: 单菌落平板至 2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 转至 50 ml LB, 37oC 250 r/m 至 A600 =0.2-0.4 离心后用 10 毫升 TSS 重悬后,分装 -70oC 保存。尽量冰上操作. 转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上 30 分钟,42℃ 90 秒,冰上 2 分钟,加 LB 至 1ml , 37℃ 1 小时后铺抗生素平板。 TSS: 7.0ml pH6.1 LB 2.0ml 50% PEG6000 0.5ML dmso 0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 0.3ml ddH2O


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