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细胞凋亡检测蛋白Annexin V的制备纯化和初步评价


  38卷增刊 第   2004年7月

原 子 能 科 学 技 术 Atomic Energy Science and Technology

Vol. 38 ,Suppl. J uly 2004

细胞凋亡检测蛋白 Annexin V 的 制备纯化和初步评价
陈大明1 ,2 , 谢   3 , 祁本忠1 ,

张颖梅3 , 贾   2 , 杨红伟1 , 罗志福1 , 虹 兵 1 1 2 张锦荣 , 金小海 , 王   , 马大龙3 凡
(1. 中国原子能科学研究院 同位素研究所 ,北京   102413 ; 2. 北京大学 医学同位素研究中心 ,北京   100083 ; 3. 北京大学 人类疾病基因研究中心 ,北京   100083)

摘要 : 文章利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达了人重组 Annexin V ,建立了批量获得 Annexin V 工程菌诱导表达的最佳温度 、 时间和包涵体的操作程序 。通过 SDS2PA GE 分析和得到的 Annexin V 标 子层析纯化后得到了高纯度 、 有生物 活 性 的 人 重 组 Annexin V 纯 品 。细 胞 结 合 分 析 的 结 果 显 示 :
Annexin V 的 KD 值为 8. 53 nmol/ L ,R T 为 8. 79 nmol/ L 。

记上 FITC 后能对地塞米松引起 Balb/ c 小鼠胸腺单细胞产生的凋亡进行有效检测的实验表明 : 经过离

收稿日期 :2004204215 ; 修回日期 :2004205214

) 作者简介 : 陈大明 (1970 — ,男 ,重庆人 ,副研究员 ,博士研究生 ,核技术及应用专业

lished in order to obtain a large quantity of Annexin V . The result s of SDS2PA GE analysis purity chromatograp hy . The result s of cell binding assay show t hat it s KD is 8 . 5 3 nmol / mL and t he apoptosis detection of single cell of t hymocytes of Balb/ c mice using F ITC2Annexin V caused by dexamet hasone wit h availableness show t hat t he mat ure Annexin V wit h high and biologic activity is obtained by ion exchange
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efficiency t hrough genetic engineering. The technique procedure concerned in t he tempera2 t ure and time of vector expression , t he basic routine and purification of proteins was estab2

关键词 : 细胞凋亡 ;Annexin V ;诱导表达和纯化 ; FITC2Annexin V ;细胞结合分析

中图分类号 :R34    文献标识码 :A     文章编号 :100026931 ( 2004) S020182206

Preparation and in Vitro Evaluation of Human Recombinant Annexin V Using f or Apoptosis

Abstract : Human recombinant Annexin V was produced by expression in E coli wit h high

YAN G Hong2wei1 , L UO Zhi2f u1 , ZHAN G Jin2rong1 , J IN Xiao2hai1 , MA Da2long3
( 1 . Depart ment of Isotope , Chi na Instit ute of A tom ic Energy , Beiji ng 102413 , Chi na ;

CHEN Da2ming1 ,2 , XIE Hong3 , Q I Ben2zhong1 , ZHAN G Ying2mei3 , J IA Bing2 ,
2 . Medical Isotope Research Center , Peki ng U niversity , Beiji ng 100083 , Chi na ; 3 . Hum an Disease Genom ic Research Center , Peki ng U niversity , Beiji ng 100083 , Chi na)

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增刊    陈大明等 : 细胞凋亡检测蛋白 Annexin V 的制备纯化和初步评价

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and R T is 8. 79 nmol/ mL . assay Key words : apoptosis ; Annexin V ; expression and purity ; F ITV2Annexin V ; cell binding 1. 1. 2

   细胞凋亡 ( apoptosis) 又称细胞程序性死亡 ( programmed cell deat h ) , 最 早 由 Kerr [ 1 ] 在 1972 年进行了报道 ,在生命科学和病理学研究 中有重要作用 , 近年来成为生物学 、 医学 , 特别

是医药化学研究热点之一 [ 2 ,3 ] 。在细胞凋亡的 过程中 ,除形态学的特征外 ,凋亡细胞膜也会改 变 ,磷脂酰丝氨酸基团 ( p hosp hotidy lserine PS) 从细胞膜的脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡 级联反应的初始事件 , Annexin V 是 Ca2 + 依赖 的 36 KD 的蛋白 , 该蛋白与细胞膜上的 PS 有 很高的亲和力 ,因此 ,利用 Annexin V 高度亲和 PS 可以早期检测凋亡的发生 。这是目前公认 的灵 敏 、 效 和 特 异 的 凋 亡 细 胞 的 检 测 方 高 [4 ] 法 。用于体外细胞凋亡检测的有 F ITC 、 PI 标记的 Annexin V ; 用于体内生物活体的细胞 凋亡检测有放射性标记 Annexin V 的核医学显 像 ,放射性 Annexin V 的核医学显像剂主要包 括99 Tcm [ 5 ] 和碘 ( 123 ,124 ,125 ,131 I) [ 6~8 ] 以及18 F [ 9 ] 标记的 Annexin V 。
Annexin V 是一种钙离子依赖性并能与膜

磷脂结合的附加蛋白质 ,具有抗凝血作用 ,它的 分布广泛 , 在多种组织细胞 ( 如心肌细胞 、 血管 内皮 、 骨骼肌 、 肝细胞等 ) 中表达 。Annexin V 是人体内原本存在的一种蛋白质 , 分子量约为
36 KD ,最早由胎盘分离出来
[ 10 ]

。从上世纪 80 年代开始 ,已对 Annexin V 的功能和结构进行 了多 方 位 研 究 [ 11~14 ] 。Annexin V 蛋 白 共 由 319 个 氨 基 酸 残 基 组 成 , 并 确 定 了 相 应 的 cDNA [ 15 ] 。天然来源的 Annexin V 含量低 , 无 法批量提供 。本工作研究利用基因工程技术在 大肠杆菌中高效表达人重组 Annexin V , 并通 过纯化 ,批量获得高纯度 、 有生物活性的纯品 , 为放射性标记的 Annexin V 核医学凋亡显像剂 的研究提供基础 。

1
1. 1

实验材料与方法

试剂和仪器 1. 1. 1 试剂 Annexin V ( 通过基因工程制备

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(Memeert 公司 ) ; PD210 色谱柱 ( Amersham ) ; γ计数器 (Berkin Elmer 公司) ,离心机 ( U niver2 sal 32R Hettich ZEN TR IFU GEN D278532 , 英 国) ; 纯水系统 ( Millipore 公司 ,美国) 。

及纯化 ,北京大学人类疾病基因研究中心) ; 131 I ( 中国原子能科学研究院提供) ; 125 I ( 美国 PE α α 公司) ; Iodo2 Gen ( 1 ,3 ,4 ,62四氯23 ,6 2二苯基 乙二醇脲 , SI GMA ) ; F ITC ( 异硫氰酸荧光素 , SI GMA ) ; BCA 蛋 白 试 剂 盒 ( Pierce 公 司 ) ; SOU RCE 30Q ( Amersham ) ; CM Sep harose FF ( Amersham) ; 其它试剂均为分析纯 。 仪器 λ rius 电子天平 ( Germany) ; HE IOS 紫外分光光 度计 ( Thermo Spect ronic , 英国 ) ; 恒温水浴箱 实验方法 1. 2. 1 Annexin V cDNA 的 PCR 扩增和表达 质粒以及工程菌的构建  方法详情参见文献
1. 2 [ 16 ] 。 1. 2. 2   重组蛋白质的诱导表达 1) 工程菌的诱导表达  移取 工 程 菌 液

至 OD600 值达 0. 6 ~ 0. 8 之间时 ,将温度升高至
42 ℃,继续培养 4 h ,离心 ( 8 000 r? - 1 , 5 ~ min 10 min) 收集菌体 。用温育时间和溶液的 OD

值进行作图 , 得到 Annexin V 工程菌的生长曲 线 ,同时将 42 ℃ 继续培养 1 、 、 h 和离心收集 2 4 的菌体进行变性和凝血酶切 , 进行 SDS2PA GE 分析 。将未诱导 30 ℃ 培养 5 和 9 h 的蛋白也 进行变性和凝血酶切后的 SDS2PA GE分析 。 2) 包涵体提取  25 mL 超声缓冲液重悬 菌体进行离心 ( 8 000 r ? - 1 ,5 ~ 10 min) , 弃 min 上清液 ; 重复上述操作一次 ; 向沉淀中加入适量 超声缓冲液 ,充分溶解菌体 ,用超声破碎仪对菌
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体进行超声破碎 ,每次为 180 s ,共 3 次 ; 将超声 处理后 的 液 体 移 入 离 心 管 中 离 心 ( 8 000 r ? min - 1 , 5~ 10 min ) , 弃上清液 , 沉淀即为包涵

500 mL ,接种 LB2Amp 培养液 ,30 ℃ 振荡培养 ,

β CRC215 ETA 放 射 性 活 度 计 ( CAPIN TEC 公 司 , 美 国 ) ; FH2463A 定 标 器 、 F T2603 γ 井型电离室 ( 北京核仪器厂) ; Sarto2

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原子能科学技术    38卷 第

μ Annexin V ( 1. 5 mg/ mL ) 、 μ 125 I 依次加 L 10 L 入涂有 Iodo2 Gen 的 Eppendorf 管中 ,振荡混匀 , 室温静止反应 10 min ,取出标记后的溶液 ,加 1 mL 0. 01 mol/ L KH2 PO4 ( p H7. 4 ) 稀释 ; 展开剂 V ( 正 丁 醇 ) ∶V ( 乙醇) ∶V ( 氨水) = 5 ∶ ∶ , 1 2 ITL C2SG 色层纸 ,上行展开 10 cm , 用放射性薄 层扫描测定放化纯 ,125 I2Annexin V的 Rf 为 0. 0

的峰的收集液 ,上 CM Sep harose FF 阳离子柱 , 0~0. 5 mol/ L NaCl 梯度洗脱 ,蛋白在 0. 3 mol/ L 的 NaCl 附近 。用 SDS2PA GE 分析验证 。 2) 浓缩和透析 : 用相对分子质量 20 K 以 上的 PEG 胶粉浓缩 ,用 p H 7. 0 的 PBS 透析 。 3) 蛋白质的含量测定 : 用 BCA 蛋白测定试

体。 3) 包涵体洗涤   相继用包涵体洗液和超 纯水各洗涤 2 次 , 每次均离心分离 ( 8 000 ~ 10 000 r ? - 1 , 10 min ) , 最后用 50 mL 50 min mmol/ L Tris2HCl ( p H8. 0 ) 溶解沉淀 , 即得到纯 的包涵体 。 4) 变性及凝血酶切   加入 20 mL 变性液 混匀 ,于 37 ℃水浴保温 30 min , 离心 ( 12 000 r? - 1 , 10 min ) , 取 上 清 液 , 用 50 mmol/ L min Tris2HCl (p H8. 0 ) 补足至 200 mL , 加入凝血酶
0. 5 mL ,混合均匀 ,于 37 ℃ 水浴过夜 。 NaO H 洗 SouRce 30Q 阴离子柱后 ,用超纯水洗 柱至 p H 6. 0 ,用 50 mmol/ L Tris2HCl (p H8. 0)

1. 2. 3   重组蛋白质的层析纯化 1 ) 先 用 B 液 体 ( 0. 5 mol/ L NaCl , 50 mmol/ L Tris2HCl ( p H8. 0 ) ) 、 再用 1 mol/ L

调柱平衡后上柱 ,用 280 nm 紫外同步检测 , 分 别收集蛋白的流出峰 ,用 SDS2PA GE 分析确定 Annexin V 的峰 ( 在第 2 个 ) ; 取上步Annexin V 剂盒和经验公式测定蛋白含量 。 1. 2. 4   重组蛋白质的 F ITC 标记  将纯化后 的 Annexin V 蛋白装入透析袋 , 在 F ITC 终浓 度为 0. 2 mol/ L 的 p H 9. 5 的碳酸盐缓冲液中

析柱进行纯化 ,即得到 F ITC2Annexin V 。 1. 2. 5   重组蛋白质的125 I 标记 1) 125 I2Annexin V 的标记   取一定量 Iodo2 Gen 溶于 CHCl3 中 ,将此溶液制成每管含 50 μg Iodo2 Gen ,蒸 发 干 后 备 用 ; 取 25 μ 0. 2 mol/ L L μ 0. 1 mol/ L NaOH 、 μ H2 O 、 KH2 PO4 、 L 40 40 L 30

4 ℃ 透析过夜进行标记 ; 通过 Sep hadex G 25 层 2

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次加入标记物和 0. 01 mol/ L KH2 PO4 ( p H7. 4) ,总体体积为 2. 5 mL , 柱子淋干后 , 用 0. 01 mol/ L KH2 PO4 ( p H7. 4 ) 淋 洗 , 每 管 收 集 0. 5 mL 淋洗液 ,测定放射性和放化纯度 。 1. 2. 6   F ITC2Annexin V 检 测 胸 腺 凋 亡   Balb/ C 鼠 ,眼球放血处死 , 取出胸腺 , 用毛玻璃 棒压碎后 ,细胞筛过滤 ,用 1640 细胞培养基 ( 含 10 %的灭活胎牛血清) 清洗 2 次 , 每次离心 , 弃 上清夜 ,进行细胞计数 , 按 1. 5 × 6 mL - 1 进行 10 稀释 ,分于 24 孔板 , 每孔 1 mL , 加入不同量的 诱导剂 ( 地塞米松 ) , 配成诱导剂系列浓度为 0. 25 、 5 、 、 、 、 、 、 μg/ mL , 在培养箱中 0. 1 2 4 6 8 10 培养 5 h 。将培养液转移到 Eppdorf 管中 , 离 心 ,用 PBS ( 10 mmol/ L , p H7. 2 ) 洗二次 , 合并 后离心清洗 3 次 ( 1 500 g × min) ,去上清液 , 10 每孔加入 200 μ Binding Buffer ; 加入标记后的 L
DNA 的表达 ,这一点可从图 2 所示 SDS2PA GE

~0. 1 , 游离放射性碘的 Rf 为 0. 5 ~ 0. 7 , 放射 性碘酸的 Rf 为 0. 7 ~0. 9 。 2) 标记物的纯化   25 mL 0. 01 mol/ L 用 KH2 PO4 (p H7. 4 ,0. 5 %HSA) 平衡 PD210 柱 , 依

蛋白 , 摇匀后 , 室温放置 20 min 。用流式细胞 仪测定细胞的凋亡率 。 125 1. 2. 7   I2Annexin V 细胞结合分析实验   胸腺细胞的单细胞制备过程同上 。分析时分为 对照组和非对照组 , 对照组用 Annexin V 进行 饱和 。用 PBS ( 10 mmol/ L , p H7. 2 ) 和 0. 5 % HSA 清洗专用细胞结合分析仪 , 抽取反应后的 培养液 , 测定吸附在玻璃纤维膜上的放射性计 数 ,用受体结合方法得到 KD 和 R T 值 。

2  结果与讨论

2. 1   工程菌( 大肠杆菌 pop2136 , 含 CI857 基

因) 的诱导表达 工程菌的生长曲线示于图 1 。30 ℃培养 5 h ,OD600 有一定增长 ,由于在第 5 小时加入了 新的培养液 , 浓度变稀 ,OD600 突然下降 , 42 ℃ 继续培养 1 、、 h 后 ,Annexin V 含量增加 ,9 h 2 4 后 ,生长趋于稳定 。故表达时间选为 30 ℃ 培养 5 h 后加入培养液 ,42 ℃ 继续培养 4 h 。 ( 含 CI857 基因 ) 为温控 大肠杆菌 pop2136

表达菌 ,30 ℃ 侧重表达内 DNA ,42 ℃ 侧重外源 分析结果得以验证 。

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0. 76OD260 = 1. 45 ( g/ L ) 。 两种方法的测定结果

较好吻合 。初步估算蛋白浓度可用经验公式 , 欲得到精确数据时 ,则应采用 BCA 方法 。

图3  BCA 蛋白测定试剂盒的标准曲线
Fig. 3   Standard curve of BCA kit

用流式细胞仪测定的诱导剂的浓度对胸腺 单细胞的凋亡率的影响的实验结果列于表 1 。
表1  地塞米松的含量对 Balb/ c 小鼠胸腺 单细胞凋亡率的影响
Table 1  Influence of the dexamethasone

包涵体经提取洗涤以及凝血酶切后含有大 量 的 Annexin V ( 图 2 中 6 ) 。重 组 蛋 白 质
Annexin V 经层析纯化后得到约 40 mL 蛋白溶

液 。通过 SDS2PA GE 分析得到高纯度的重组 蛋白质 Annexin V ( 图 2 中 7 ) 。Annexin V 的 相对分子质量为 35 KD ,与文献值 [ 5 ] 一致 。
2. 3   蛋白质的含量测定

曲线 为 Y = 0. 064 76 + 0. 001 19 X ( r = 0. 997 14) 。 测得的 3 个平行样的 OD562 平均值 为 0. 178 。Annexin V 的浓度为 1. 44 g/ L 。用 同样的蛋白溶液测得 OD280 = 1. 800 , OD260 =
1. 760 。带入经验公式得蛋白浓度1. 55OD280 -

212   包涵体和蛋白质的纯化

BCA 的标准曲线示于图 3 。拟合后的标准

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的解离常数 KD 值与最大 PS 浓度 R T 值进行 测定 。取胸腺单细胞悬液为 1. 5 × 6 mL - 1 , 125 10 I2 Annexin V ( 放化纯度大于 95 % , 比活度为 3. 3 ×1012 Bq/ mol ) , 放 射 性 浓 度 为 8. 49 ×104 μ min - 1?L - 1 。测定采用非特异结合管 ( NSB ) , 每管含 Annexin V 45 μg ; 洗涤液为 0. 1 mol/ L PBS (p H = 7. 2 ) γ 计数器的测量效率为 70 % , , 反应体积为 350 μ 。实验结果列于表 2 。 L
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2. 4  FITC2Annexin V 检测胸腺凋亡
地塞米松含量/ ( mg? - 1) L
0. 25 0. 5 1. 0 2. 0 4. 0 6. 0 8. 0 10. 0

on cell apoptosis of Balb/ c mice adenosine
凋亡率/ %
19. 24 47. 54 51. 97 52. 76 54. 61 55. 38 53. 38 55. 60

125 2. 5   I2Annexin V 的细胞结合分析

对 Balb/ c 小鼠胸腺单细胞的 Annexin V

186

原子能科学技术    38卷 第

将结合分析数据用 Graphpad Prism 3. 0 软件 进行分析 ,结果示于图 4 , 并由此得到 KD = ( 8. 53 ± 30) nmol/ L , R T = ( 8. 79 ±2. 21 ) nmol/ 3.

L ,或 R T = 1. 23 × 6 结合位点数/ 细胞 。这一 10

结果与文献报道值7 nmol/ L [ 17 ] 相近 。

管号
1 2 3 4 5 6 7 8

图4  细胞结合分析的 Scatchard 作图
Fig. 4   Scatchard curves of apoptotic cell binding assay
a —— — 特异性结合2标记物浓度 ;

b —— — 结合体/ 游离配体浓度比2特异性结合

3  结论

1) 建立了 Annexin V 工程菌的诱导表达

Table 2  Results of binding assay of 125 I2Annexin V with apoptotic cell of Balb/ c mice adenosine
125

表 2  Balb/ c 小鼠胸腺单细胞经诱导( 地塞米松) 后125 I2Annexin V 的结合分析结果
1 4 8 16 32 64 80 108 I2Annexin 加入量/μ L

结合计数率/ min - 1 非特异结合

总结合

特异性结合

13 244 23 432 50 647 96 136

2 037 4 949 9 748

11 207 18 483 40 899 79 066

17 070 28 398 44 745 73 575

136 167 155 921 172 192 256 402

107 769 111 176 98 617

110 339

146 063

的最佳温度 、 时间和包涵体的操作程序 ,并通过

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离子层析纯化得到了高纯度 Annexin V 。 2) F ITC2Annexin V 对 由 地 塞 米 松 引 起 Balb/ c 小鼠胸腺单细胞产生的凋亡能进行有效 检测 ,Annexin V 保持了较高的生物活性 。 3) Annexin V 细 胞 结 合 KD 值 为 8. 53
nmol/ L ,R T 为 8. 79 nmol/ L 。

本研究结果表明 , 通过基因工程诱导表达 并经纯化可批量获得高纯度和高生物活性的 Annexin V ,为下一步研究生物活体内的核医学 凋亡显像剂 —— — 放射性标记 Annexin V 提供了 基础 。 参考文献 :

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