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农杆菌介导的水稻高效遗传转化体系的建立


第 25 卷第 5 期 1999 年 10 月

湖 南 农 业 大 学 学 报 Journal of Hunan A g ricultural U niv ersity

 V ol. 25 N o . 5 O ct. 1999

农杆菌介 导的水 稻高效 遗传转化体系的建立*
曹 孟 良
( 华中

农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 武汉, 430070) 【 摘 要】  选用 5 个水稻品 种( 02428, 武 育粳 2 号, 台北 309, M illin 和明恢 63) , 通过农 杆菌介导 的转化方法, 从前 4 个水稻品种中获得了来自 309 个独立抗性愈伤 的 634 棵再生植株, 包括 422 株 PSAG12 IPT 转基 因植株和 212 株 P SAG12 - S 转基因植 株. 经组织 化学法检测 和 PCR 分析, 获得的 GU 422 株 PSAG12 IPT 转 基因植株 中, 有 233 株 为阳性转 基因植株. Souther n 分析结 果表明, 转基因在 水稻基因组中进行了随机整合, 其拷贝数为 1~3 个, 单拷贝的频率为 42. 29% . 【 关键词】  水稻 农杆菌 遗传转化 【 中图分类号】 511 S 336  S

Est ablishment of Ef f icient A gr obacter iumm ediat ed T ransfor m at ion of Rice
Cao Mengliang
( T he State K ey L abor ato ry of Cr ops Genetic Impr ov em ent , Huazhong A g ricultura l U niv ersity, Wuhan , 430070)

ABSTRACT  5 rice varieties ( 02428, Wuy ug en 2, T aibei 309, M illin and M inghui 63) w er e select ed f or t ransfo rmat ion via A gr obact eri um . Fr om 4 of t hem ( 02428, Wuyugen 2, T aibei 309 and M illin) , 634 r eg enerated plants w hich w ere derived fr om 309 independent callus w er e obt ained, including 422 P SAG 12-IPT t ransgenic plant s and 212 PS AG12 - S tr ansg enic plant s. T hrough hist ochemical assay and P CR GU analy sis on 422 P SAG 12-IPT t ransgenic plant s, 233 of t hem w ere f ound t o be posit ive. Southern analy sis result s show ed that t ransgene w ere r ando mly int egrat ed into rice genome w it h 1~3 copies . T he f requency of sing le copy w as 42. 29% . KEY WORDS paddy Agro bacterium g enet ic t ransf orm at ion

  根癌农杆菌和 T i 质粒是一种天然的载体- 宿主系统, 可构建植物基因工程载体而用于植 物遗传转化 . 科学工作者探明了根癌农杆菌 T -DNA 转移及致瘤的原理后, 构建了适合于植
  收稿 日期 199904-23  第一作者 曹 孟良, 男, 35 岁, 博士. 现工 作地址: 湖南杂交水 稻研究中 心, 长 沙, 邮编, 410125   * 引进国际先进农业科学技术项目 ( 961032) 和中华农业科教基金资助项 目( 9701-04)
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物转化的 T i 质粒载体系统和农杆菌介导的遗传转化系统, 并把农杆菌宿主范围扩展到了许多 单子叶植物, 包括几种重要的禾本科作物 [ 2~5] . 水稻 3 个亚种粳稻、 籼稻和爪哇稻先后建立了 农杆菌介导的遗传转化体系 [ 3, 6, 7] . 但是这并不意味着所建立的转化体系能沿用于水稻亚种内 的各品种, 因为所建立的转化体系多是针对某些模式品种, 并且农杆菌的侵染和水稻组织培养 都高度依赖于水稻基因型. 本研究选用澳大利亚曾大面积推广的水稻品种 M ill in , 模式品种台 北 309 以及中国近年新育成的 3 个品种, 建立了这些品种的农杆菌介导的高效遗传转化体系, 并对所获得的转基因植株进行了鉴定分析.

1 材料与方法
1. 1 水稻材料、 质粒、 菌株和培养基 供 试水稻品种包括台北 309, 02428, 明恢 63, 武育粳 2 号( 江苏省农业科 学院提供) 和 M il lin ( 澳 大 利 亚 CAM BIA 实 验 室 提 供) . 质 粒 pCML A 35-1, pCM L A 35-2, pCML A 35-3, pCM L A35-4 为自行构建的质粒, 采用亚克隆技术和反筛选策略, 更换载体上的卡那霉素抗性 标记为潮霉素抗性标记, 质粒的特征如图 1 所示, 其中嵌合基因 PSA G12-IPT 为延缓叶片衰老基 因, 嵌合基因 P SAG12 -GU S 用于研究克隆自拟南芥的启动子 PSA G12的功能, 考察其衰老叶片特异 表达的特性. 农杆菌菌株 EHA 105 和 A GL -1 由 CAM BIA 实验室提供, 两种农杆菌的 Vir 辅 助质粒都衍生自 pT iBo 542, 皆为农杆碱型菌系.

    L B , R B —— T - A 区 左 右 边 界; 35 S —— CaM V 35 S 启 动 子; Hyg —— 潮 霉 素 抗 性 基 因; DN T 35S —— CaM V 35S polyA ; N OS —— NO S 终止子; PSAG12 —— 基因 SA G 12 启 动子; IPT —— 异 戊烯 基转移酶基因; L A C Z ——半乳糖苷合 成酶 图 1 双元载体 TDNA 区结构 Fi g. 1 Schemati c drawing of TDNA of binary vector

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  所 构 建质 粒 转化 农杆 菌 后 的菌 株 编 号为: A 1. EHA 105( pCM L A 35-1) ; A 2. EHA 105 ( pCM L A35-2 ) ; A3. EHA105 ( pCM L A35-3 ) ; A4. EHA105 ( pCM L A35-4 ) ; A 7. AGL -1 ( pCM L A35-1) ; A8. AGL -1( pCM L A35-3) . 水稻组织培养所使用的培养基如下. 2N6 培养基: N 6 盐和维生素, 1 g 酪蛋白, 30 g 蔗糖, 2 mg 2, 4- 2. 5 g phyt agel, pH 5. 8; AAM 培养基: AA 盐和氨基酸, M S 维生素, 500 mg 酪蛋 D, 白, 68. 5 g 蔗糖, 36 g 葡萄糖, 100 mol/ L 乙酰丁番酮, pH 5. 2; RGH6 培养基: N6 盐和维生 素, 300 m g 酪蛋白, 500 m g 脯氨酸, 500 mg 谷酰氨, 30 g 蔗糖, 0. 5 m g NAA , 3 mg BAP, 6 g phyt ag el , pH 5. 8; 1/ 2 M S 培养基: 1/ 2 M S 盐, N 6 维生素, 10 g 蔗糖, 2. 5 g phyt agel, pH 5. 8. 1. 2 农杆菌介导的水稻遗传转化 去壳后的种子消毒后, 置于2 N 6培养基上, 于25℃暗 培养, 进 行愈伤诱导. 选取直 径为 2~3 mm 的愈伤颗粒, 在2N 6上25 ℃黑暗预培养. 农杆菌于28 ℃在L B固体培养基上培养 2 d 后用于愈伤的转化. 用接种环刮取农杆菌, 悬浮于 AAM 培养基中, 并调整浓度至 1~1. 5 OD 600 . 经预培养的愈伤浸于菌液约 30 min 后, 晾干置于 2N6-AS 培养基上, 25 ℃暗培养 3 d. 待农杆菌生长至可见愈伤下的菌斑但未长满愈伤时, 挑取愈伤, 用无菌水冲洗 3~5 次, 最后一 次冲洗 时用含 250 m g / L 头孢霉素的无 菌水, 置于 无菌滤纸上晾干 后, 转移 至筛选培 养基 2N 6- 上进行暗培养. 并取晾干后的少量愈伤作瞬时表达检测. 每两周将愈伤转移至新鲜筛 CH 选培养基上继代, 继代筛选 2~3 次后, 转移至再生培养基 RGN 6 上. 幼芽长出后再移至 1/ 2 M S 培养基上. 待幼苗长成, 即可移至温室盆栽. 1. 3 组织化学法检测报道基因 GUS 的表达 共培养后愈伤的瞬时表达、 抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用 GU S 组织化学法 测定. 将待测定的材料, 如愈伤或叶片, 浸入适量 X -Gluc 溶液, 于 37 ℃保温过夜后, 在体视显 微镜下观察, 拍照记录. 若将加有 X-Gluc 溶液的材料抽真空, 染色效果将更好. 如材料存在色 素 干扰问题 , 染色后用 酒精脱色 , 使色 素的颜 色褪掉 而使染 成的 蓝色保 存. X -Gluc 染色 液: 0. 2 mo l/ L Na 3 PO 4缓冲液( 62 mL 0. 2 mol / L Na 2HP O 4; 38 mL 0. 2 mol / L NaH 2P O 4) , pH 7. 0; 0. 1 mol / L K 3 [ Fe( CN ) 6 ] ; 0. 1 mo l/ L K 4 [ Fe ( CN ) 6] ?3H 2 O; 1. 0 mol / L Na 2EPT A; 0. 1% XGluc. 1. 4 PCR 分析 水 稻 DNA 抽 提 采用 CT AB 法 . 合 成 的引 物 用于 检 测 启动 子 P SAG 12, 其序 列 如 下. Fo rw ord: 5'-GCAAA GAGACGAGGAAGAAA; Revise: 5'L, 1 T GGCT GAAGT GAT A ACCGT C. PCR 反 应 体 系: DNA 30 ~90 ng , 10x Buf fer 2. 0
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mm ol/ L dNT P 1. 8 L , 25 mm ol/ L Mg Cl 2 1. 5 L , 10 mol/ L pr im er 两种各 0. 5 L , T ag 酶 1. 5 U , 然后加 dd H 2 O 至 20 L 反应体积. P CR 循环条件: 94 ℃, 变性 3 min; 94 ℃, 1 m in, 55 ℃, 1. 5 min, 72 ℃, 1. 5 min, 40 个循环; 72 ℃, 延伸 5 min. 用 1. 4% 琼脂糖凝胶电泳后, 照相记 录电泳结果. 1. 5 Southern 分析   2. 5~5 g 水稻总 DNA 酶切后在 0. 8% 的琼脂糖凝胶上电泳, 采用上述 P CR 扩增产物作 探针, 因而检测的是转基因的启动子 PS AG12 部分. Sout hern 杂交按本实验室手册进行.

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2 结果与分析
2. 1 农杆菌介导的水稻遗传转化系统的建立 成熟胚在 2N 6 培养基上约经 1 周后即可见从盾片处诱导出愈伤, 3 周左右的愈伤即可用 于转化. 共培养后的愈伤在筛选培养基上约需 3 周即可见瘤状抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中 长 出. 抗性愈伤继代筛选2~3次后, 即可转移至再生培养基RGH 6上, 2 周后愈伤开始转绿, 3 周后即可长出幼芽, 随后根也长出, 这时可移至 1/ 2 M S 培养基上, 随后长成幼苗. 2. 2 不同菌株和品种的瞬时表达效率 共培养后取部分愈伤进行组织化学 GUS 酶活性检测. 从表 1 可以看出, 不同品种之间和 不同农杆菌菌株之间, 瞬时表达效率显著不同. 5 个品种中, 以 M illin 的转化效率最高, 平均达 到 52. 0% . 另外 3 个粳稻品种台北 309, 武育粳 2 号和 02428 具有相似的瞬时表达效 率, 为 20% ~30% , 籼稻品种明恢 63 的瞬时表达效率很低, 仅有 3. 4% . 不同农杆菌的瞬时表达效率 也有明显差异. 总的来看, EHA105 的瞬时表达效率高于 AGL -1, 特别是 EHA105 转化 M il lin 时, 平均达 61. 98% , 最高可达 90. 5% .
表 1 农杆菌介导的水 稻遗传转化的瞬时表达效率 Tabl e 1 Transi ent expression effi ciency of rice transformati on via A gr obacter ium 水稻品种  M illin 试验 1 2 3 4 共计 1 2 共计 1 2 3 4 共计 1 2 共计 1 2 共计 G U S + 愈伤数/ 愈伤总数 A 1  A 2  A 7  7/ 18( 38. 0) 13/ 21( 61. 9) 12/ 29( 41. 4) 23/ 42( 54. 8) 13/ 30( 43. 3) 5/ 35( 14. 3) 8/ 10( 80. 0) 10/ 15( 66. 6) 15/ 26( 57. 7) 26/ 35( 74. 3) 19/ 21( 90. 5) 6/ 20( 30. 0) 64/ 105( 61. 0) 55/ 87( 63. 2) 38/ 110( 34. 5) 0/ 24( 0) 4/ 15( 26. 7) 4/ 39( 10. 3) 5/ 24( 20. 8) 1/ 14( 7. 1) 未测 未测 6/ 38( 15. 8) 未测 0/ 7( 0) 0/ 7( 0) 3/ 30( 10/ 0) 0/ 22( 0) 3/ 52( 5. 8) 5/ 8( 62. 5) 0/ 6( 0) 5/ 14( 35. 7) 5/ 12( 41. 7) 5/ 14( 35. 7) 未测 未测 10/ 26( 38. 5) 未测 0/ 20( 0) 0/ 20( 0) 1/ 14( 7. 1) 0/ 20( 0) 1/ 34( 2. 9) 10/ 16( 62. 5) 6/ 27( 22. 2) 16/ 43( 37. 2) 2/ 10( 20. 0) 2/ 8( 25. 0) 0/ 24( 0) 1/ 16( 6. 25) 5/ 58( 8. 6) 8/ 14( 57. 1) 0/ 10( 0) 8/ 24( 33. 3) 未测 0/ 30( 0) 0/ 30( 0) 共 计 32/ 68( 47. 1) 41/ 107( 38. 8) 33/ 51( 64. 7) 51/ 76( 67. 1) 157/ 302( 52. 0) 15/ 48( 31. 3) 10/ 48( 20. 8) 25/ 96( 26. 0) 12/ 46( 26. 1) 8/ 36( 22. 2) 0/ 24( 0) 1/ 16( 6. 25) 21/ 122( 17. 2) 8/ 14( 57. 1) 0/ 37( 0) 8/ 51( 15. 7) 4/ 44( 9. 1) 0/ 72( 0) 4/ 116( 3. 4)

台北 309

武育粳 2 号

02428

明恢 63

  GU S + 愈伤数为 GU S 检测阳性的愈伤数, 括号内为两者比值的百分 数.

  总之, 菌株/ 品种的组合对瞬吮表达效率的影响很大, 某一品种用一特定农杆菌转化时, 可 获得较高的瞬时表达效率. 从表 1 显示的趋势来看, EHA105 适合于转化 M ill in, 武育粳 2 号 和明恢 63, 而 AGL-1 适合于转化台北 309 和 02428.

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2. 3 水稻转化效率 4 种质粒构建物导入 2 种农杆菌 EH A 105( 转化了全部 4 种构建物) 和 A GL -1( 转化了 2 种类型的构建物, 各代表每种构建物的嵌合基因的一种插入方向) 后, 分别转化 5 个水稻品种, 都获得了抗性愈伤, 但只有 M illin, 台北 309, 武育粳 2 号和 02428 转化后获得了再生植株( 表 2) . 从表 2 可以看出不同试验的转化效率差异较大. 如 AGL-1 转化 M illin 的最高转化效率可 达 30. 5% , 但多数试验的转化效率只有 5% 左右, 有的试验中, 只获得极少数抗性愈伤, 最终也 未获得再生植株.
表 2 农杆菌介导的水稻遗传转化效率 Tabl e 2 Efficiency of rice transformation via Ag ro bac te r ium
水稻品种 试验 M il lin   1 2 3 4 1 2 1 2 3 4 1 2 1 2 再生植株数/ 愈伤总数 A 1  3/ 55( 5. 5) 6/ 159( 3. 8) 1/ 156( 0. 6) 1/ 105( 0. 9) 3/ 88( 3. 4) 3/ 38( 7. 9) 0/ 79( 0) 0/ 100( 0) 未测 未测 未测 0/ 82( 0) 0/ 66( 0) 0/ 92( 0) A 2  6/ 74( 8. 1) 4/ 104( 3. 8) 3/ 123( 2. 4) 3/ 125( 2. 4) 5/ 37( 13. 5) 0/ 45( 0) 3/ 74( 4. 1) 1/ 63( 1. 6) 未测 未测 未测 0/ 100( 0) 0/ 70( 0) 0/ 87( 0) A 3  8/ 94( 8. 5) 5/ 105( 4. 8) 0/ 116( 0) 1/ 55( 1. 8) 1/ 57( 1. 8) 0/ 33( 0) 1/ 47( 2. 1) 2/ 33( 6. 1) 未测 未测 未测 0/ 96( 0) 0/ 43( 0) 0/ 80( 0) A 4   20/ 102( 19. 6) 4/ 98( 4. 1) 1/ 134( 0. 7) 0/ 71( 0) 2/ 30( 6. 7) 0/ 25( 0) 0/ 51( 0) 0/ 25( 0) 未测 未测 未测 0/ 96( 0) 0/ 27( 0) 0/ 95( 0) A 7  61/ 321( 19) 6/ 163( 3. 7) 0/ 275( 0) 11/ 202( 5. 4) 8/ 46( 17. 4) 5/ 127( 3. 9) 6/ 37( 16. 2) 12/ 84( 14. 3) 0/ 83( 0) 未测 1/ 114( 0. 9) 0/ 185( 0) 未测 0/ 91( 0) A 8  76/ 249( 30. 5) 2/ 38( 5. 3) 2/ 142( 1. 4) 5/ 66( 7. 5) 1/ 31( 3. 2) 3/ 41( 7. 3) 4/ 50( 8) 19/ 80( 23. 8) 0/ 75( 0) 0/ 42( 0) 0/ 52( 0) 0/ 68( 0) 未测 0/ 88( 0)

台北 309  武育粳 2 号

02428   明恢 63 

  括号内为两者比值的百分数.

  参试的 5 个品种中, M il lin, 台北 309, 武育粳 2 号和 02428 的再生出植株的抗性愈伤数分 别为 239, 31, 38 和 1 个. 从这 309 个独立抗性愈伤中共获得了 634 株再生植株, M il lin, 台北 309, 武育粳 2 号和 02428 的再生植株总数分别为 354, 131, 144 和 5 株. 转化效率以 Millin 最 高, 达到 7. 86% , 其他 3 个品种分别为 5. 18% , 5. 29% 和 0. 13% . 而明恢 63 的 70 个抗性愈伤 中未能再生出植株. 某些抗性愈伤再生出数个植株, 对这些抗性愈伤选择了超过 1 株的再生植 株, 参加随后的分子鉴定和田间考察.   选用的 2 种农杆菌 EHA 105 和 AGL -1 的转化效率有一定差异. 如转化 Millin 时, AGL -1 的转化效率为 11. 20% , 而 EHA 105 只有 4. 16% . 但从农杆菌/ 品种组合对转化效率的影响来 看, 主要影响转化效率的不是菌株而是品种基因型. 明恢 63 的转化最终未获得再生植株. 虽在转化过程中于 50 mg / L 潮霉素抗性培养基上 获得一些抗性愈伤, 但经组织化学 GUS 酶活性检测, 这些抗性愈伤多为假阳性, 因而在有选 择压力的再生培养基上未能再生成植株. 2. 4 组织化学法鉴定 PSAG12-IPT 转基因植株 对所获得的 422 株 P SAG 12-IPT 转基因水稻采用组织化学法检测了 GUS 酶活性. 不同品种 之 间, 阳 性 植株 的频 率略 有差 异, 台北 309 的频 率较 高, 为 65. 42% , 而 武 育粳 2 号仅 为 42. 99% , 统计的平均频率为 55. 21% .

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2. 5 转基因植株的 PCR 分析 利用合成的引物 P rimer SAG 12 扩增启动子 PSA G12 上一段 560 bp 的片段, 对部分转基因 植株进行了检测( 图2) . P CR检测结果与GUS 酶活性检测结果基本一致, 但发现有个别植株 2 种检测方法的结果互相矛盾, 表现为一种检测方法的结果为阳性, 而另一种检测方法的结果 为阴性, 这可能是由于转基因整合入植物基因组后发生重排所致.

图 2 转基因水稻 PCR 分析 Fig. 2 PCR analysis of transgenic rice

2. 6 转基因植株的 Southern 分析 选取部分上述分析结果均为阳性的植株进行 Sout hern 分析( 图 3) . 探针为启动子 PSA G12 片段的部分片断, 所用内切酶为 XbaⅠ. 因为转基因中无 XbaⅠ的酶切位点, 杂交带的数量应 能反映植物基因组中整合的转基因的拷贝数, 除非 T DNA 以串连重复进行整合或在两个邻 近的转基因之间无 Xba Ⅰ的酶切位点. 从图 3 可看出, 转基因的拷贝数为 1~3 个, 出现单拷贝 的频率为 42. 29% .

1~14. 转基因水稻; CK . 对照 图 3 转基因水稻 Southern 分析 Fig. 3 Southern analysis of tr ansgenic rice

3 讨 论
3. 1 影响农杆菌介导的水稻遗传转化效率的因素 农杆菌介导的方法以其特定的整合边界、 适中的转基因拷贝数、 方法简便、 耗费低廉等优

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点在水稻的遗传转化中得到广泛应用. 但是水稻各亚种遗传转化的突破并不意味着各亚种的 转化方法能沿用于亚种内的各品种. 事实上, 基因型间转化效率的差别极大[ 7] . 本研究中也发 现同样的问题, 虽从 4 个粳稻品种中获得了数百株转基因植株, 但某些品种的转化效率很低, 如 02428 的转化效率仅为 0. 13% , 籼稻品种明恢 63 甚至未获得转基因植株. 推测其原因主要 是: 1) 所建立的转化体系仅仅是针对某些品种, 且多为模式品种, 更换材料后, 所建立的体系不 一定有效; 2) 农杆菌的侵染存在基因型差异. 这不仅在单子叶植物中存在, 而且在双子叶植物 中存在. 表现为瞬时表达效率极低, 或不能观察到报道基因的瞬时表达; 3) 所使用的筛选标记 都不同程度地存在内源抗性, 即使使用在水稻中筛选效果较好的潮霉素选择标记同样存在非 转化细胞逃逸现象, 因此对不同基因型应调节选择压力; 4) 组织培养方法存在基因型依赖性. 由于以上原因, 在转基因研究中, 如需要改良特定水稻品种, 还有待建立其高效转化体系. 3. 2 愈伤组织的状况对农杆菌侵染的影响 瞬时表达检测时, 观察到愈伤块上蓝色的着色形态在愈伤之间存在差异. 有的愈伤为斑点 状, 而有的愈伤上出现较大的蓝色斑块. 经仔细观察和比较分析, 发现蓝色斑块多出现在生长 旺盛、 颜色鲜黄的愈伤上, 并多分布在预培养中刚长出的愈伤部位, 因此推测农杆菌的侵染与 愈伤组织的状况有关. 还发现再生培养基上未分化、 仍在旺盛增殖的愈伤经共培养后, 其瞬时 表达效率有明显改善, 并多表现为斑块状着色. 上述观察为进一步试验所证实. 这一结果显示, 对于农杆菌不易侵染的基因型, 除根据农杆菌- 植物的互作原理, 通过改变共培养条件等来提 高农杆菌的侵染外, 还可通过培养手段来调节愈伤状况, 提高瞬时表达效率和转化效率. 3. 3 水稻的抗生素内源抗性 水稻遗传转化中, 转化细胞的有效筛选除利用除草剂 P PT 外, 还多利用抗生素进行筛选, 如卡那霉素, G418, 潮霉素等. 水稻中卡那霉素的内源抗性很高, 即使含量达 500 mg/ L 时还不 能完全抑止某些愈伤的生长 [ 9] . 一个替代方法是利用 G418 进行筛选. G418 像卡那霉素一样, 可由 NPT Ⅱ编码的新霉素磷酸转移酶所失活. 利用 G418 进行筛选不但提高转化细胞筛选效 果, 而且不影响抗性细胞的再生
[ 10]

. 但本研究中发现水稻中 G418 的内源抗性差异很大, 如台

北 309 可达 140 mg / L , 并且经筛选后, 还有许多非转化细胞逃逸出来. 潮霉素抗性基因 HP T 是从大肠杆菌克隆和改造而成, 在水稻遗传转化中应用很广的筛 选标记 [ 11, 12] . 这一筛选标记能较好区分转化细胞和非转化细胞, 并且不会造成再生植株的白 化和不育 . 但是笔者发现, 品种之间潮霉素内源抗性存在差异, 如明恢 63 在 50 m g/ L 的筛 选压力下仍出现大量非转化细胞的逃逸. 因此, 在用潮霉素抗性标记进行筛选之前, 仍需对特 定的品种进行梯度试验, 以确定合适的选择压力, 既可有效区分转化细胞和非转化细胞, 又可 避免影响转化细胞的再生.
  本研究在张启发教授指导下完成, 特此致谢.
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参 考 文 献
1 Chilto n M D, Dr umm ond M H, M erlo D J, et al. Sta ble inco rpo ration of plasmid D NA into hig her plant cells: the molecular basis o f cro wn g all tumo rig enesis. Cell, 1977 ( 11) : 263~271 2 R aineri P, Bo ttino P, Gor don M P , et al. A gr obacter ium - ediat ed T ransfor mation of r ice# ( Or y z a sativ a M

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湖 南 农 业 大 学 学 报

1999 年 10 月 

L . ) . Bio / T echno lo gy , 1990 ( 8) : 33~38 3  Hiei Yuko h, Shozo O hta, T oshihiko Ko mar i, et al. Efficient tr ansfor matio m o f rice ( Or y z a sativ a L . ) mediat ed by A gr obacter ium and sequence analysis of the bo undar ies o f the T - A . T he Plant Jo urnal, DN 1994, 6( 2) : 271~282 4 G ould J, Dev ery M , Haseg aw a O , et al. T r ansfor matio n o f Zea may s L . using A gr obacter ium tumef aciens and the sho ot apex . Plant Physio l, 1991, 95: 426~434 5  M oo ney P A , Go odw in P B, D ennis E S, et al. A gr obacter ium tumef aciens tr ansfer into w heat tissues. P lant Cell T issues O r gan Cult , 1991, 25: 209~218 6   Do ng J, T eng W , Buchho ltz W G , et al. A gr obacter ium mediated tr ansfo rmat ion of Jav anic r ice. M ol Breeding , 1996 ( 2) : 267~276 7. R ashid L , Yo koi S, T or iya ma K , et al. T r ansgenic plant pr oduct ion mediated by A gr obacter ium in indica r ice. Plant Cell Rep , 1996, 15: 727~730 8. M ur ray M G, T hompson W F. Rapid iso lation of high molecular w eig ht plant DN A . N ucleic A cids Res, 1980 ( 8) : 4321~4325 9  Dekeyser R, Claes B , M ar ichal M , et al . Evaluatio n o f selectable mar kers for rice tr ansfor matio n . Plant P hysio l , 1999, 90: 217 10 Bat tra w M , Hall T C. Expr ession of a chimer ic neomy cin pho spho tra nsfer ase Ⅱ gene in first and seco nd gener atio n transg enic r ice plants. Plant Sci, 1992, 86: 191 11  Bloching er K , D ig gelmann H . Hy gr o mycin B phospho tr ansfer ase a s a selectable marker for DN A tr ansfer ex per iments w ith hig her eucary ot ic cells . M o l Cell Bio l, 1984 ( 4) : 2929 12   W aldro n C, M ur phy E B, Ro berts J L , et al. R esist ance to hyg r omy cin B: a new mar ker fo r plant tr ansfo rmat ion studies. P lant M o l Bio l, 1985 ( 5) : 103 13  Zheng Z, Hayashimo to A , L i Z, et al. Hy gr omy cin r esistance g ene casset tes fo r vecto r constructio n ane selection of tr ansfor med r ice pro toplasts. Plant P hy siol, 1991, 97: 832

简 讯

《 湖南农业大学学报》 荣获教育部优秀科技期刊一等奖
  《 湖南农业大学学报》 1999 年全国优秀高校自然科学学报及教育部优秀科技期刊评 在“ 比” 中荣获一等奖, 据教育部教技[ 1997] 1 号文件公布: “ 该项奖励可等同于教育部科技进步 奖. ” 此次共评出优秀期刊 200 种, 其中一等奖 50 种, 二等奖 80 种, 三等奖 70 种. 全国高等农 业院校学报荣获一等奖的还有《 南京农业大学学报》《 、 华中农业大学学报》《 、 西北农业大学学 报》《 、浙江农业大学学报》 《 、 河南农业大学学报》 吉林农业大学学报》 湖南省高校荣获一等 和《 . 奖的还有《 中南工业大学学报》 湖南师范大学自然科学学报》 和《 .


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