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梅花不同外植体离体培养及体细胞胚诱导植株再生


园 艺 学 报 2010, 37 (1) Acta Horticulturae Sinica

梅花不同外植体离体培养及体细胞胚诱导植株 再生
宁国贵,吕海燕,张俊卫,包满珠
*

(华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉 430070)



要:以梅花

品种‘雪梅’和‘绿萼’的叶片、叶柄、茎段及未成熟子叶为外植体进行离体

培养,探讨了梅花未成熟子叶的体胚发生途径与植株高效再生方法。结果表明,成熟组织再生能力 低,不定芽再生困难。在添加1.0 mg·L - 1 BA,1.0 mg·L -1 NAA,1.0 mg·L -1 IBA的1/2MS培养基中, ‘雪梅’和‘绿萼’未成熟子叶的体胚诱导率最高,分别为40.4%和25.3%;同时将初生胚转移至 新鲜培养基上可产生大量次生胚。在添加 0.5 mg·L - 1 BA,0.1 mg·L- 1 TDZ和1.0 mg·L- 1 IBA

的1/2MS基本培养基中,体细胞胚发育成完整植株的频率较高, ‘绿萼’达26.7%, ‘雪梅’达23.8%。 再生植株成功移栽至温室且生长良好。 关键词:梅花;离体培养;胚胎发生;再生 中图分类号:S 685.17 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2009)

In Vitro Culture of Different Explants and Plant Regeneration via Embryogenesis from Immature Cotyledons of Prunus mume
NING Guo-gui,Lü Hai-yan, ZHANG Jun-wei, and BAO Man-zhu* (College of Horticulture and Forestry Sciences, Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, huazhong Agricultural University, Wuhan 430070 , China) Abstract:A comprehensive in vitro culture of different explants of Prunus mume, including leaves, petioles, stems and immature cotyledons, was investigated and the regeneration protocol for P. mume was developed via somatic embryogenesis in the culture of immature cotyledons. Mature tissues displayed strong recalcitrance to plant regeneration. Whereas 40.4% and 25.3% of immature cotyledons developed into somatic embryo with intervening callus phase in the media containing 1.0 mg·L-1 BA, 1.0 mg·L-1 NAA and 1.0 mg·L-1 IBA in cultivars of ‘Xuemei’ and ‘Lv’ e’ respectively, which were higher than other media in which somatic embryo could be induced. Simultaneously, there was also other undesired morphogenic reaction occurring in the various media used. The secondary somatic

收稿日期:2008-10-06;修回日期:2008-12-15 基金项目:国际自然科学基金项目(D/4349-1) ;国家自然科学资金资助项目(30800761) *通讯作者Author for correspondence (E-mail:mzbao@mail.hzau.edu.cn)









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embryos were proliferated from the primary ones with high yield when they were transferred to fresh media. The somatic embryos (26.7% in ‘Lu’e’ and 23.8% in ‘Xuemei’) could convert into plantlets at a higher frequency in our study when cultured on 1/2MS media supplemented with 0.5 mg·L-1 BA,0.1 mg·L-1 TDZ and 1.0 mg·L-1 IBA. Regenerated plantlets were successfully established in soil and grew well in the greenhouse. Key words: Prunus mume; in vitro culture; embryogenesis; regeneration 过去 10 年中, 已有很多关于李属物种的成熟组织及未成熟组织离体培养并成功诱导植株再生 及体胚发生的报道(Gentile et al.,2002;Cheong et al., 2004)。但对梅花成熟组织离体培养和植株 再生的研究报道相对较少 ( Lv et al.,2006),且其再生的报道多集中在未成熟组织(Tsukamoto et al., 2007; Ning et al., 2007)。对梅花成熟组织离体培养的探究,可以为进一步实现与完善梅花各器官和 组织的高频再生体系建立提供平台,另外利用梅花体胚再生可加快其无性繁殖速度,而体胚作为 遗传转化良好受体将为梅花改良进程提供巨大的潜力。 作者研究了梅花叶片、茎段、叶柄、未成熟子叶的离体培养反应,探究不同外植体的再生能 力,成功利用子叶诱导体胚的方法实现了梅花植株再生,并对成熟及未成熟组织再生能力进行了 分析评价,并描述了梅花未成熟子叶在培养过程中的各种形态发生。

1 材料与方法
1.1 试验材料 本研究于 2004—2008 年在华中农业大学进行。选取梅花‘雪梅’和‘绿萼’的幼嫩叶片、茎 段、叶柄及自由授粉的未成熟种子(花后 40~60 d 采收) ,流水冲洗 30 min,在无菌工作台上用 70%酒精浸泡 30~60 s,0.1%升汞消毒 10~15 min,再用无菌水冲洗 3 次。将叶片切成 0.5 cm ×0.5 cm 大小,茎段长 0.5 cm,叶柄长 0.5 cm,从未成熟种子中切下子叶,接种于 MS 和 WPM 基 本培养基上培养。 1.2 初代培养 基本培养为 1/2MS、1/4MS 和 WPM3 种,根据所添加的不同植物生长调节剂分为 7 组: (1)不 添加任何植物生长调节剂; (2)BA 0.5 mg·L ,NAA (0.5、1.0 mg·L ),IBA(0、0.5、1.0 mg·L ) 的随机组合; (3)BA 0.5 mg·L ,2,4-D(1.0、2.0 mg·L ) ,IBA(0.5、1.0 mg·L )的随机 组合; 4) ( 0、 ( BA 1.0、 3.0、 5.0、 和 9.0 mg· ) IBA 7.0 L ,
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0.2 mg· 组合; 5) 0.5 mg· ,IBA0.2 L ( BA L
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mg·L ,TDZ(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mg·L )组合; (6)BA 0.5 mg·L ,TDZ 1.5 mg·L , NAA(0.01、0.05、0.1 和 0.25 mg·L )组合; (7)BA 0.5 mg·L ,NAA 0.01 mg·L ,TDZ(0.3、 0.5、0.8 和 1.0 mg·L )组合。 培养基 pH 5.8, 121℃高压灭菌 20~25 min。培养室温度(25±2)℃,先暗培养 4 周,再 移至光下,光强为 50μmol·m
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·s

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, 光周期为 16 h 光/8 h 暗。

1.3 叶片、茎段、叶柄的愈伤组织诱导、维持及再生 一方面, 将初代培养过程中愈伤组织再生率高的培养基继续用于继代培养, 另一方面, (2) 将 , (3)类型培养基上培养的外植体转移至(1),(4),(5),(6),(7)类型培养基上;将 (1),(4),(5),(6),(7)类型培养基上培养的外植体转移至(2),(3)类型培养基 上。将含 1.0 mg·L IBA 和 1.0 mg·L 2,4-D 的 WPM 培养基用于研究不同基因型、基本培养基、
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宁国贵等:梅花不同外植体离体培养及体细胞胚诱导植株再生

外植体及其相互作用对愈伤组织形成的影响。 1.4 未成熟子叶体胚诱导及植株再生 未成熟子叶在(2)、 (3)类的培养基上形成胚性愈伤及体细胞胚,3 次重复。将初生胚一部分 转移至新鲜培养基上进行次生胚诱导;另一部分转移 BA(0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0 mg·L ) , NAA 0.5 mg·L 组合和 BA 0.5 ㎎·L ,IBA 0.3 mg·L ,TDZ(0.1,0.5, 1.0mg·L )组合的
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培养基上促进体胚成熟、萌发直至植株完全形成(表 4)。 1.5 体胚成苗植株的移栽 当幼苗长到 1 cm 高并且具有 3 条以上的根(根长至少 1 cm)时,将其从培养瓶移出,流水 冲洗根部,将培养基洗净,移栽入塑料钵培养 (Ning et al., 2007a) 。 1.6 数据分析 试验采用完全随机区组设计,重复两次,每个重复至少含 6 个外植体。所得数据采用 LSD 新 复极差法进行 0.05 水平上的差异显著性分析。

2 结果与分析
2.1 基因型、外植体类型及培养基对愈伤组织形成的影响 除未添加任何植物生长调节剂的基本培养基及添加 0.5 mg·L IBA 与 2 种 BA 浓度(0,1.0 mg·L )组合的培养基外,所用的其它培养基均能不同程度地诱导外植体(叶片、叶柄、茎段)在 切口部位形成愈伤组织 (图 1, A~C) 诱导率均达 80%以上。 ‘雪梅’ , 如 品种茎段在 1/4MS+0.5mg· L BA+1.0 mg·L (表 1) 。
表 1 梅花不同外植体的愈伤组织诱导反应 Table 1 Inducing effect of callus from various explants 品种 Cultivars 绿萼 Lu’e 外植体 Explants 叶片 Leaf 茎段 Stem 叶柄 Petiole 雪梅 Xuemei 叶片 Leaf 茎段 Stem 叶柄 Petiole 最优愈伤组织诱导培养基/(mg·L ) Media obtained the highest callus induction frequency 1/2MS+0.5 BA+1.0 TDZ+0.2IBA WPM+0.5 BA+1.5TDZ+0.2IBA 1/2MS+0.5BA+1.02,4-D+ 1.0 IBA WPM+0.5BA+1.0NAA+1.0 IBA 1/4MS+0.5BA+1.0 TDZ+0.2 IBA WPM+0.5 BA+1.0NAA+ 1.0 IBA
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TDZ+0.2 mg·L

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IBA 培养基中愈伤诱导率高达 92.8%±3.8%。愈伤诱导率相对低
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的 ‘绿萼’ 品种的叶片在 1/2MS+0.5mg· BA+ 1.0mg· TDZ+0.2mg· IBA 培养基上也达到 86.3% L L L

诱 导 率 /%

Percentage

of explants forming callus 86.3±3.9 90.0±6.0 91.9±2.0 86.5±1.4 92.8±3.8 91.7±7.0

注:所有结果是暗培养 4 周后进行统计,数值代表平均值±标准差。 Note: Results refer to the percentage of mature explants forming callus 4 weeks after initial induction in the dark, Values represent the mean ±standard error.

在生长素与细胞分裂素比例高的(2) (3)类培养基中,愈伤颗粒疏松、脆弱,而在生长素 、 与细胞分裂素比例低的(4) (5) (6) (7)类培养基上形成的愈伤密集,呈节球状。方差分析 、 、 、 ( P <0.05)表明,仅培养基间愈伤诱导率具有显著性差异(F 值为 5.26) ,而基因型、外植体类型及 三者之间的相互作用差异均不显著。









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2.2 愈伤组织继代及不定芽诱导 愈伤组织形成后,一方面将初代培养过程中愈伤组织再生率高的培养基继续用于继代培养。 另一方面将(2) (3)类培养基与(4)、(5)、(6)、(7)类培养基进行互换使用。培养 2 、 周后,将(4)、(5)、(6)、(7)类培养基上的产物转移至(2) (3)类培养基中,大多数 、 愈伤组织继续增值而没有根或芽的再生。 愈伤组织经过 3~5 次的继代培养之后, 次生愈伤组织大 致可分为 3 类:类型 I,密集,不易破碎,浅黄色,呈颗粒状(图 1,D) ;类型 II,松散,易碎, 亮黄色,呈球形(图 1,E) ;类型 III,松散,易碎,浅黄白色,且高度水渍化(图 1,F) 。 各类型的愈伤组织均可在原来的诱导培养基继代培养上增殖,在继代培养过程中还出现了一 些中间形态的愈伤组织(数据没有显示) 。在暗培养时,愈伤组织转变为亮黄色;将其移至光下, 在培养基中添加不同浓度比的生长素与细胞分裂素时,不能诱导出不定芽,所产生的愈伤更易破 碎,愈伤组织转变为绿色。

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图1 梅花叶、叶柄和茎段的离体培养 A:叶诱导的愈伤组织;B:叶柄诱导的愈伤组织;C:茎段诱导的愈伤组织;D:紧实块状的愈伤组织; E:疏散的块状愈伤组织;F:疏散的水渍化愈伤组织。 Fig.1 In vitro culture response of leaves, stems and petioles derived from Prunus mume. A: Calli forming in the cut area of leaf. B: Calli initiated from the cut area of petioles. C: Calli initiated from the cut area of stem. D: Compacted and globular calli. E: Incompact and globular calli. F: Incompact, non-granule and watered calli.

2.3 体胚诱导及其它不定结构形成 未成熟胚子叶接种至(4)、(5)、(6)、(7)类培养基上均能直接诱导芽的再生(表 2)。 在(2) (3)类的培养基中,除在 NAA 和 IBA 的组合中未得到体胚外,其它的培养基均得到一定 、 数量的体细胞胚(表 2) 。方差分析(P<0.05)表明,在得到体细胞胚的培养基上,其体细胞胚诱导 率在不同培养基之间存在显著差异。体细胞胚的形成通常在近切口部位,同时伴随着中间愈伤组 织的过渡(图 2,B,C) 。将初生胚转移至含 1.0 mg·L-1 BA,1.0mg·L-1 NAA,1.0 mg·L-1 IBA

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宁国贵等:梅花不同外植体离体培养及体细胞胚诱导植株再生

表 2 梅花未成熟子叶体胚诱导反应 Table 2 Inducing effect of somatic embryo from P.mume immature cotyledons 植物生长调节剂/(mg·L -1 ) Plant growth regulators 2,4-D 0 0 0 0 0 0 0 1.0 2.0 1.0 2.0 NAA 0 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 0 0 0 0 IBA 0 0 2.5 5.0 0 0.5 1.0 0.5 0.5 1.0 1.0 绿萼 Lv’e 外植体体胚诱导率/% Percentage of explants forming embryos 0 0 0 0 0 25.5±6.3ab 40.0±4.1a 0 11.0±2.8b 23.8±5.3ab 13.3±4.6b
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雪梅 Xuemei 单 个 外 植 体 胚 数 Embryo number per cotyledon explants 0 0 0 0 0 2.8±0.42ab 3.8±0.65a 0 3.6±0.45ab 3.4±0.45ab 2.4±0.27b 外 植 体 体 胚 诱 导 率 /% Percentage of explants forming embryos 0 0 0 0 12.0±1.4b 24.3±3.1a 25.3±1.8a 0 14.0±4.2b 15.8±0.5b 10.5±1.4b 单个外植体胚数 Embryo number per cotyledon explants 0 0 0 0 2.2±0.58b 3.0±0.41ab 3.4±0.61ab 0 4.2±0.49a 3.2±0.68ab 2.6±0.20b

注:基本培养为 1/2 MS+0.5 mg.L BA,植物生长调节剂于暗培 4 周后添加。数值代表平均值±标准差。相同小写字母表示在 0.05 水平上差异不显著。 Note: P.mume immature cotyledons (‘Xuemei’ and ‘Lu’e’ cultivars) were inloculated on 1/2 MS+1.0 mg.L the same letter within a column are not significantly different at P=0.05(Duncan’s Multiple Rang Test).
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BA basal medium

supplemented with different growth regulators after four weeks of culture in darkness. Values represent the mean ±standard error. Means with

的培养基上,暗培养 4 周后,次生体胚大量形成。每个外植体所产生的次生胚数量多于初生胚,且 大部分次生胚都产生于子叶间的连接部位(图 2,D) 。未成熟胚子叶愈伤组织及体细胞胚诱导过 程中还伴随着其它一些分别类似于子叶、叶、茎等结构的分化。 2.4 体胚诱导植株再生 将 诱 导 的 体 胚 置 于 1/2 MS + 0.5 mg·L NAA + 2.0 ~ 5.0 mg·L BA 或 1/2 MS + 0.2 mg·L IBA+0.2~1.0 mg·L TDZ 上培养 6 周后,成功诱导植株再生(表 3) 。方差分析表明 ( P <0.05),不同的 BA 和 TDZ 对‘雪梅’与‘绿萼’两品种体细胞胚萌发成苗率有显著影响。本试 验中体胚转变成完整植株的概率很低,最高接近 30%(表 3) 。
表 3 植物生长调节剂对两个梅花品种体胚萌发成苗的影响 Table 3 植物生长调节剂/(mg·L -1 ) Plant growth regulators BA 1.0 2.0 3.0 4. 5.0 0.5 0.5 0.5 TDZ 0 0 0 0 0 0.1 0.5 1.0 NAA 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0 0 IBA 0 0 0 0 0 0.2 0.2 0.2 Percentage of embryo forming plantlets of two P. mume cultivars 初生胚萌发成苗率/% Percentage of primary embryo forming normal plantlet 绿萼 Lu’e 0 10.0±0ab 17.5±10.6ab 18.7±5.3ab 0 26.7±9.4a 5.6±7.8b 0 雪梅 Xuemei 0 8.0±4.2b 13.1±2.7b 21.2±1.8a 0 23.8±1.8a 8.1±0.7b 7.5±3.5b
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注:数据是将体胚转移至添加不同植物生长调节剂的 1/2MS 6 周后的统计值,其中先进行了 2 周的暗培养再转至光下培养。所得 数据(平均值±标准差)在 0.05 水平上差异显著。 Note: Data are collected 6 weeks after transferring embryo to 1/2MS basal media supplemented with different growth regulators, in which they were cultured during the first two weeks in the dark and then transferred to light conditions. Values (represent the mean ±standard error) within a column followed by the different letters are significantly different at 0.05 levels.









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另外,大部分再生植株的子叶在体胚萌发过程中都转变成愈伤组织(图 2,E) 。在高浓度的 BA 或 TDZ 培养基中,正常植株可逐渐被愈伤组织或变异植株取代。 2.5 再生植株移栽 依照 Ning 等(2007a) 报道的梅花移栽方法,体胚成苗移栽至土壤 2 周后,成活率达 80%,8 周后于温室条件下旺盛生长(图 2,F) 。

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图2 梅花未成熟胚的不同形态发生 A:成熟胚接种;B:体细胞胚的发生; C:球状时期胚;D:次生胚的形成;E:植株再生;F:组培苗练苗。 Fig.2 Different morphogenic responses of the immature embryo cotyledons of P. mume

A: Cotyledons from P.mume immature embryo were inoculated to different media. B: Somatic embryo (arrow) formation from the callus forming at the edge of cutting area of the cotyledon explants. C: Globular-stage somatic embryos (arrow) derived from calli. D: Secondary embryos (arrow) forming near the linkage region of the cotyledons. E: Plant formation from the embryo in which the cotyledons formed calli. F: Plants established after hardening.

3 讨论
据报道,李属大部分物种的成熟组织可通过离体培养再生,如用 Prunus incisa 根做外植体, 能通过体胚发生途径诱导植株再生(Cheong et al.,2004);以杏和 Prunus avium 的叶为外植体 , 可 通过器官发生途径诱导植株再生(Gentile et al.,2002; Matt & Johannes,2005)。但目前为止,少见梅 花通过叶、叶柄、茎等成熟组织离体培养再生的报道。以上结果表明,与李属其它物种相比,梅 花的成熟组织具有很强的再生顽拗性,故选择合适的外植体是成功建立梅花再生及农杆菌介导法 转基因体系的关键。 本研究发现,不同基因型,外植体类型及培养基之间交互作用对梅花愈伤组织形成不具有显 著 影 响 , 该 结 果 与 已 报 道 的 其 他 木 本 植 物 成 熟 组 织 再 生 情 况 (Hernndea et al.,2003; Condeet

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宁国贵等:梅花不同外植体离体培养及体细胞胚诱导植株再生

al.,2004) 不一致。 在进行不同植物生长调节剂组合配比对愈伤组织的不定芽诱导中,只有极少数的 外植体发生少量的不定根,同样也说明了梅花成熟组织再生困难。 梅花未成熟子叶在未添加植物生长调节剂的培养基中未能诱导出体细胞胚,与 Panax ginseng 子叶在不添加任何激素的 MS 基本培养基上即能高频诱导体胚 (Choi et al.,1998)表现了相反的结 果。在 0.5 mg·L BA 与 NAA,2,4-D 和 IBA 任意组合的 1/2 MS 培养基中,部分能诱导体胚低频再 生,而且高浓度的植物生长调节剂有利于梅花未成熟子叶体细胞胚形成,之前也有类似的报道 (Haoru et al.,2000)。试验发现,BA 与生长素组合对体胚诱导的效果优于只添加生长素的培养基配 方,这与细胞分裂素有利于诱导体胚形成的结论 (Nanda et al.,2003; Gairi et al.,2004) 是一致的。 当将得到的体胚及其附带的愈伤转移至新鲜培养基上时,能在初生胚上形成次生胚,而大部分愈 伤组织却不能分化成胚,该现象与以往的报道 (Cheong et al.,2004) 一致,其原因可能是在最初诱 导的愈伤组织中有胚性和非胚性之分。 体细胞胚成熟及萌发结果显示,一定浓度的生长素与细胞分裂素有利于体胚转化成苗,这与 细胞分裂素能束缚体胚的生长发育相悖(Choi et al.,1998) 。其原因是否在体胚形成过程中积累了 大量抑制体胚萌发的物质,需要细胞分裂素来缓解或打破抑制物质的特性,还有待进一步研究证 实。 梅花的不同外植体在同一培养基上能产生不同的组织及结构。叶、叶柄、茎段培养后仅形成 愈伤组织,但在相同条件下,未成熟子叶能诱导形成体胚及类似于子叶和茎等结构,主要因素在 于外植体的发育阶段不一,添加外源植物生长激素后影响内源生长激素的不平衡所致。基因型差 异也是形态发生途径中的一个关键因子, Prunus cerasus 和 Prunus avium 离体培养(Haoru et al., 如 2000; Demarch et al., 1993)也有类似报道。
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References
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