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孔雀石绿检测步骤


水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法 的改进与实践心得
1 范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿残留总量、 结晶紫及其代谢 产物隐性结晶紫残留量的高效液相色谱荧光测定方法。 2 规范性引用文件 本文主要参考了 GB20361-2006 水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色 谱荧光检测法以及 Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detedction 并结合实践进行报告。 3 原理 样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或 隐性结晶紫,乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取,二氯甲烷溶液液萃取,固相萃取柱净化,反 相色谱柱分离,荧光检测器检测,外标法定量。 4 试剂 除另有规定外,所有的试剂均为分析纯,实验用水应为二级水。 4.1 乙腈:色谱纯。 4.2 二氯甲烷:色谱纯。 4.3 酸性氧化铝:分析纯,粒度 0.071mm-0.150mm。 4.4 二甘醇。 4.5 硼氢化钾。 4.6 无水乙酸铵。 4.7 冰乙酸。 4.8 氨水。 4.10 硼氢化钾溶液(0.2mol/L) :称取 0.27g 硼氢化钾于烧杯中,加入 25mL 水溶解,现配 现用。 4.11 20%盐酸羟胺溶液:溶解 12.5 盐酸羟胺在 50ml 水中。 4.12 对甲苯磺酸(0.05mol/L) :称取 0.95g 对甲苯磺酸,用水稀释至 100mL 容量瓶中。 4.13 乙酸铵缓冲溶液(0.1mol/L) :称取 7.71g 无水乙酸铵溶于 1000mL 水中,氨水调 pH 到 10.0。 4.14 乙酸铵缓冲溶液(0.125mol/L) :称取 9.64g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中,用冰乙 酸调 pH 到 4.5。 4.15 酸性氧化铝固相萃取柱:500mg,3mL。使用前用约 9mL 已经活化。 4.16 Varian PRS 柱:500mg。3mL。使用前用约 9mL 乙腈活化。 (C 结晶紫分子式为 C25H29ClN3, 4.17 标准品: 孔雀石绿分子式未 23H25N2) 2HO4)C2H2O4、 (C 2 纯度大于 98%。 4.18 标准溶液:分别准确称取适量的隐形孔雀石绿、隐形结晶紫标准品约 1.50mg,用乙腈 稀释至 250ml 容量瓶,低温避光保存。 5 仪器设备 5.1 高效液相色谱

5.2 5.3 5.4 5.5 5.6

匀浆机 离心机:4000r/min 漩涡震荡机 固相萃取装置 旋转蒸发仪

6 样品制备 6.1 取样 鱼去鳞、 、去骨、去皮,沿背脊取肌肉部分;虾去头、壳、肠腺,取肌肉部分;蟹、甲 鱼等取可食用部分、样品切为不大于 0.5cm×0.5cm×0.5cm 的小块后混合。 6.2 提取 称取 5g 以上不超过 5.5g 的样品于 50ml 离心管内,加入 10ml 乙腈,先用小烧杯盛载乙 腈清洗匀浆机刀头,约 13000r/min 对试样进行匀浆提取直到把鱼样打碎,约 30 秒。 (若要进行加标测回收率,此时加入标准溶液 200μl)加入 5ml 乙酸铵溶液(3.14) , 加入 25μl 对甲苯磺酸(4.12) ,1ml 盐酸羟胺(4.11)再加入 100μl 的对甲苯磺酸(4.12) 。 盖上盖子,漩涡震荡 30s。加入 25ml 乙腈,盖上盖子,振摇 30s。加入 10g 或以上的氧化铝, 盖上盖子,振摇 15s。于 4000r/min 离心 5min。 放置 250ml 分液漏斗,于其中加入 50ml 蒸馏水、2ml 二甘醇。把离心管的上清液倾倒 于分液漏斗中。向含有残余物的离心管加入 25ml 乙腈, 盖上盖子,漩涡震荡 30s,振摇 30s, 然后于 4000r/min 离心 5min。 把离心管的上清液倾倒于含有第一次萃取液的分液漏斗中。 于 分液漏斗中加入 1ml 硼氢化钾。于分液漏斗中加入 35ml 二氯甲烷,盖上盖子,注意及时放 气,往返震荡约 10 次,打开盖子,静置分层。取下层溶液,收集于 150ml 茄形瓶中,需要 定量时, 最后几滴的下层有机溶液也要收集。 再往 250ml 的分液漏斗中加入 25ml 二氯甲烷, 重复一次上述的萃取步骤。静置后,继续收集下层溶液,于盛有第一次萃取液的茄形瓶中。 于 50℃旋转蒸发,直到把茄形瓶中的溶液蒸至近干。 用 2.5mL 乙腈溶解茄形瓶中的残渣。 6.3 净化 将 PRS 柱安装在固相萃取柱装置上,上端连接酸性氧化铝固相萃取柱,用乙腈活化, 一般需要活化 3 次以上,转移提取液到柱上,再用乙腈洗茄形瓶 2 次,每次 2.5mL,依次过 柱,弃去酸性氧化铝住,吹 PRS 柱近干,再不抽真空的情况下,加入等体积混合的乙腈和 乙酸铵溶液(4.13) ,收集洗脱液,再加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液(4.14) ,再次收 集洗脱液,收集洗脱液用玻璃瓶,乙腈定容至 3mL,供液相色谱测定。 注意事项 标准溶液配置时,隐形孔雀石绿及隐形结晶紫分别称量 1.50mg,需准确记下质量。标准样 品(固体)称量完毕,需马上将其低温避光保存。 进行取样步骤时,应尽量把鱼肉反复剁碎。 取鱼样前先要将样品解冻。每次称量样品,需要准确记录样品的质量。 匀浆操作注意尽量不要使匀浆机连续操作 1 分钟以上, 因其发热, 匀浆时间过长容易导致机

器的损坏。若鱼肉确实没有打碎,也应停顿后再继续匀浆。 每次使用匀浆机前,需要拆卸刀头,先用自来水清洗,再用蒸馏水清洗。处理鱼样前,先用 小杯乙腈清洗刀头数十秒,此时匀浆机应处于工作状态。每一次处理鱼样后,需要重复上述 步骤。 如果需要加标,应在匀浆之后加标。 第一次使用移液管时,应先用自来水洗,在用蒸馏水洗,最后用待移取的溶液润洗 3 次,再 贴好标签,每支移液管只取对应的一种溶液,不要混用,以后每次使用移液管时不必再进行 清洗。 在提取步骤中,加入了 2 次对甲苯磺酸,其中使用量程为 50μL 的移液枪来吸取 25μL 的 对甲苯磺酸,使用量程为 200μL 的移液枪来吸取 100μL 的对甲苯磺酸。其中,加入 25μl 的对甲苯磺酸,是根据 FDA 文献方法的要求,出于补偿酸性缓冲乙酸铵溶液的需要。 氧化铝可处理鱼肉中的脂肪等物质,应该根据鱼样的质量来决定氧化铝的用量,一般 5g 的 鱼样需要大约 10g 的氧化铝,若鱼样较多或较多脂肪,应适当增加氧化铝的用量,否则实验 会失败。 离心时,注意离心管的液体体积,尽量使其平衡。 使用分液漏斗前,一定要先验漏。往分液漏斗倾倒溶液前,一定要将分液漏斗的活塞关闭。 加入了二氯甲烷,进行液液萃取时,应上戴橡胶手套,一定要注意及时放气,应在通风处放 气,放气口不要对着人。 静置分层时,注意打开分液漏斗的盖子,务必确认活塞处于关闭状态。 分液萃取操作时,静置分层约 5 分钟,过快收集容易同时收集少量微粒的乙腈,使旋转蒸发 操作更困难,大大增加旋蒸时间。 第一次使用旋转蒸发仪时,需要把所有部件拆除,逐一清洗干净。以后不必再清洗。每次旋 蒸样品前, 应先旋蒸大约 15-20ml 的乙腈至近干, 然后再旋蒸萃取液。 旋蒸时需要及时加冰。 旋蒸时,先开自来水,打开真空泵,再打开旋蒸仪;关闭时,先关闭旋蒸仪,再关水泵,最 后关自来水。 过柱操作时,加入乙腈溶解茄形瓶中的残液时,应充分摇晃,使其溶液后再转移至固相萃取 柱上。 进行净化时,活化的次数可以适当增加,一般不能少于 3 次。如果发现液体停止滴下,可以 适当抽真空以提高速度(真空度低于 0.2) ,若发现其开始滴下,应尽快停止抽真空泵。但是 收集洗出液时不能抽真空。

净化操作应注意先移除氧化铝柱,再抽干 PRS 柱,避免氧化铝柱中有杂质抽进 PRS 柱中, 造成污染。 洗脱操作为先碱洗,再酸洗,洗脱液因收集于同一容器,容器避免使用塑料瓶。 收集的洗脱液若发现存在浑浊,可适当稀释后进行离心操作。避免使用滤膜,因其易使未知 物质混入洗脱液,导致污染。 白色的柱管和红色的小连接器每次使用后,用少量乙腈(或甲醇)浸泡超声 30 分钟,再用 自来水加洗洁精,超声清洗 30 分钟,然后再蒸馏水超声清洗 30 分钟,待其风干后使用。固 相萃取装置上的白色板有许多小孔, 每次使用后需要用需要针筒盛载乙腈清洗 3 次, 每次使 用前需要用针筒盛载乙腈清洗不少于 5 次。 注意确保固相萃取装置以及其各部分的干净, 是 实验成功的关键。 色谱上机测定及数据处理等操作参考 GB/T 20361-2006。


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