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电镜样品制作(完全版)


相关仪器的信息: 透射电镜:JEOL(公司) JEM-1230(型号) TEM,产地:日本 超薄切片机:Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome,产地:奥地利 扫描电镜:Philips XL30 ESEM,产地:捷克 临界点干燥仪:Hitachi HCP-2 Critical point dryer,产地:日本 真空喷镀仪:Eiko IB5

ion coater,产地:日本 包埋剂:SPI-CHEM Spurr resin,产地:USA

TEM 样品包埋块制作有关注意事项 样品包埋块制作有关注意事项
取材: 一 、 取材 : 1、 动作迅速 : 组织离体后 , 应将其快速放入固定液中 , 使组织 、 动作迅速: 组织离体后, 应将其快速放入固定液中, 细胞尽可能保持原来的生活状态; 细胞尽可能保持原来的生活状态 ; 2、 减少损伤 : 选择锋利切割器械 , 减少牵拉或挤压组织 ; 、 减少损伤: 选择锋利切割器械, 减少牵拉或挤压组织; 3、 组织块大小 : 一般要小于 1mm3 。 、 组织块大小: 固定: 二 、 固定 : 固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞 的过程,目的是尽可能保持细胞的原有生活状态, 的过程 , 目的是尽可能保持细胞的原有生活状态 , 不发生位 减少组织结构变化。 固定剂的主要作用是使蛋白质、 移 , 减少组织结构变化 。 固定剂的主要作用是使蛋白质 、 脂 质等生物大分子发生某种交联。 质等生物大分子发生某种交联 。 1、 用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面 , 应通过抽真空的方 、 用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面, 法让样品沉入溶液中 2、使用锇酸的注意事项 、 I 通风橱中的锇酸溶液为 2%的储备液,使用之前需用 0.2MPBS 或 的储备液, 的储备液


的锇酸溶液。 二甲砷酸盐缓冲液稀释成 1%的锇酸溶液。 的锇酸溶液 II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂,必须在通风橱中操作,废液必须 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂,必须在通风橱中操作, 收集在密闭容器中。 第一次使用锇酸的同学, 请务必获得老师或其 收集在密闭容器中。 第一次使用锇酸的同学, 它熟悉操作人员的指导。 它熟悉操作人员的指导。 三、漂洗:应彻底漂洗干净,减少固定液与固定液或与脱水剂之间的 漂洗:应彻底漂洗干净, 反应。 反应。 四、脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包 脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。 埋剂大都是非水溶性树脂, 埋剂大都是非水溶性树脂,只有将生物组织中的游离水清除干 净,包埋剂才能浸入组织。 包埋剂才能浸入组织。 脱水过程中应注意: 脱水过程中应注意: I 逐级脱水而不能急剧脱水; 逐级脱水而不能急剧脱水; II 更换溶液时动作要快, 更换溶液时动作要快, 特别是不要让组织离开溶液, 特别是不要让组织离开溶液, 否则会在组织 内外产生气泡; 内外产生气泡; III 脱水过程中若要长时间停留或过夜,应放在 70%脱水剂中,并在 脱水过程中若要长时间停留或过夜, 脱水剂中, 脱水剂中 4℃保存。 ℃保存。 五、渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂,使细胞内外 渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂, 空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催 空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、 种试剂按一定比例配制而成。 化剂 4 种试剂按一定比例配制而成。 包埋剂配制及使用过程中的注意事项: 包埋剂配制及使用过程中的注意事项: I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的; 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的; II 配制过程中应搅拌均匀, 配制过程中应搅拌均匀, 使用过程中应避免异物, 特别是水、 乙醇、 使用过程中应避免异物, 特别是水、 乙醇、 丙酮等混入包埋剂; 丙酮等混入包埋剂;


III 配制好的包埋剂应密封保存,避免受潮。剩余包埋剂可密封并储 配制好的包埋剂应密封保存,避免受潮。 存在-10—-20℃冰箱中,延长其使用期。 存在 — ℃冰箱中,延长其使用期。



表1

戊二醛溶液的配制
1.0 50 4 100 1.5 50 6 100 2.0 50 8 100 2.5 50 10 100 3.0 50 12 100 4.0 50 16 100 5.0 50 20 100

终浓度 0.2M PBS/ml 25%戊二醛水溶液 戊二醛水溶液/ml 戊二醛水溶液 重蒸水加至/ml 重蒸水加至

磷酸缓冲液( 表 2 0.2M 磷酸缓冲液(PBS)的配制 )
A 液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 Na2HPO4 或 Na2HPO4.H2O 或 Na2HPO4.2H2O 或 Na2HPO4.7H2O 或 Na2HPO4.12H2O 加双蒸水至 1000mL 28.4g 31.61g 35.6g 53.63g 71.64g 加双蒸水至 1000mL B 液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 NaH2PO4 或 NaH2PO4.H2O 或 NaH2PO4.2H2O 24.0g 27.6g 31.21g

按下表比例混合 A、B 液后,配成 0.2mol/L 的母液,其中 pH7.0 为常用配方 其中 pH 值 A液 B液 5.8 8.0 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 81.0 19.0 7.6 87.0 13.0 7.8 8.0

12.3 18.5

26.5 37.5 73.5 62.5

49.0 61.0 72.0 51.0 39.0 28.0

91.5 94.7 8.50 5.30

92.0 87.7 81.6

在缓冲液中加入葡萄糖,蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。

多聚甲醛-戊二醛固定液的配制 表 3 多聚甲醛 戊二醛固定液的配制
溶液名称 10%多聚甲醛溶液 多聚甲醛溶液 0.2MPBS 或二砷酸盐缓冲液 25%戊二醛水溶液 戊二醛水溶液 重蒸水 剂量 20ml 50ml 10ml 20ml

表 4 2%锇酸溶液的配制 锇酸溶液的配制
试剂 锇酸/g 锇酸 重蒸水/ml 重蒸水 用量 1 50



表 5 Spurr 包埋剂配方
药品名称 VCD 树脂 DER736 NSA DMAE 硬配方 10g 6g 26g 0.4g 软配方 10g 7g 26g 0.4g 我们现用的配方 10g 8g 26g 0.4g

的用量可以调节包埋剂的硬度。 注:通过改变 DER736 的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE 的用量则调节聚 合反应的速度。 合反应的速度。



透射电镜样品制备程序: 透射电镜样品制备程序:
No.1 包埋切片样品的制作过程
然后按下列步骤处理样品: 样品在 2.5%的戊二醛溶液中 4℃固定过夜 , 的戊二醛溶液中 ℃ 固定过夜, 然后按下列步骤处理样品 : 倒掉固定液, pH7.0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 , 的磷酸缓冲液漂洗样品三次, 倒掉固定液 , 0.1M, 用 , 每次 15min; ; 用 1%的锇酸溶液固定样品 1-2h; 的锇酸溶液固定样品 ; 倒掉固定液, pH7.0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 , 的磷酸缓冲液漂洗样品三次, 倒掉固定液 , 0.1M, 用 , 每次 15min; ; 用梯度浓度( 五种浓度) 用梯度浓度 ( 包括 50%, 70%, 80%, 90%和 95%五种浓度 ) 的乙醇 , , , 和 五种浓度 溶液对样品进行脱水处理, 溶液对样品进行脱水处理 , 每种浓度处理 15min, 再用 100%的乙醇处 , 的乙醇处 理一次, 理一次 , 每次 20min; 最后过度到纯丙酮处理 20min。 ; 。 用包埋剂与丙酮的混合液( 用包埋剂与丙酮的混合液 ( V/V=1/1) 处理样品 1h; ) ; 用包埋剂与丙酮的混合液( 用包埋剂与丙酮的混合液 ( V/V=3/1) 处理样品 3h; ) ; 纯包埋剂处理样品过夜; 纯包埋剂处理样品过夜 ; 将经过渗透处理的样品包埋起来 , 70℃ 加热过夜 , 即得到包埋好的样品 。 ℃ 超薄切片机中切片, 的切片, 样品在 Reichert 超薄切片机中切片 , 获得 70-90nm 的切片 , 该切片经柠檬 酸铅溶液和醋酸双氧铀 50%乙醇饱和溶液各染色 15min, 乙醇饱和溶液各染色 , 即可在日本 JEOL 型透射电镜中观察。 公司的 JEM-1230 型透射电镜中观察 。 1).Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO 4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer. 2).Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to absolute acetone for 20 minutes. 3). Infiltration: The specimen was placed in 1:1 mixture of absolute acetone and the final Spurr resin mixture for 1hour at room temperature, then transferred to 1:3 mixture of absolute acetone and the final resin mixture for 3hours and to final Spurr resin mixture for overnight. 4).Embedding and ultrathin sectioning: Specimen was placed in capsules contained embedding medium and heated at 70℃ for about 9hours. The ℃ specimen sections were stained by uranyl acetate and alkaline lead citrate for 15 minutes respectively and observed in TEM of Model JEM-1230.

No.2 负染样品的制作(以细菌为例) Negative staining of bacterium
The bacterium suspension was stained by 1 to 2%solution of phosphotungstic acid (PTA,磷钨酸) in a pH range of 6.5 to 7.0 for 15 to 30 seconds. Then, the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230.




SEM 需前处理样品制备过程中的注意事项 需前处理样品制备过程中的注意事项
I 取材:1cm3 左右即可,不需要象 TEM 样品那么小; 取材: 左右即可, 样品那么小; II 脱水:样品较大,脱水时间可适当延长; 脱水:样品较大,脱水时间可适当延长; III 临界点干燥:一般采用液体二氧化碳为置换液,二氧化碳与乙醇 临界点干燥:一般采用液体二氧化碳为置换液, 或丙酮互溶性较差,而与醋酸异戊酯互溶液性较好。因此, 或丙酮互溶性较差,而与醋酸异戊酯互溶液性较好。因此,样品脱 水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡, 以便置换存留于组织中 水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡, 的脱水剂。 的脱水剂。 注意:醋酸异戊酯挥发性较强,应在通风橱中操作, 注意:醋酸异戊酯挥发性较强,应在通风橱中操作,废液用密闭容器 装好后丢弃。 装好后丢弃。 IV 金属喷镀:新鲜样品自身就可导电,而经过干燥的生物样品不能 属喷镀:新鲜样品自身就可导电, 导电。 中观察时, 导电。这种不导电的样品在 SEM 中观察时,会产生电荷积累而影 响观察稳定性。 使样品导电的方法通常是在样品表面喷一层厚度约 响观察稳定性。 100 埃的金膜。 埃的金膜。



No.1 直接观察的扫描电镜样品 I 样品粘附在样品台上 , 在 Eiko IB5 型离子溅射仪中喷镀 4-5min。 样品粘附在样品台上, 。 II 样品在荷兰 Philips 公司的 XL30 型 ESEM( 环境扫描电镜 ) 中观察 。 ( 环境扫描电镜) 中观察。
The specimen was coated with gold-palladium in Eiko Model IB5 ion coater for 4-5min and then observed in Philips Model XL30 ESEM.

No.2 需前处理的 SEM 样品制备程序
然后按下列步骤处理样品: 样品在 2.5%的戊二醛溶液中 4℃固定过夜 , 的戊二醛溶液中 ℃ 固定过夜, 然后按下列步骤处理样品 : 倒掉固定液, pH7.0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 , 的磷酸缓冲液漂洗样品三次, 倒掉固定液 , 0.1M, 用 , 每次 15min; ; 用 1%的锇酸溶液固定样品 1-2h; 的锇酸溶液固定样品 ; 倒掉固定液, 用 pH7.0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 , 的磷酸缓冲液漂洗样品三次, 倒掉固定液 , 0.1M, , 每次 15min; ; 用梯度浓度( 五种浓度) 用梯度浓度 ( 包括 50%, 70%, 80%, 90%和 95%五种浓度 ) 的乙醇 , , , 和 五种浓度 溶液对样品进行脱水处理 脱水处理, 溶液对样品进行 脱水处理 , 每种浓度处理 15min, 再用 100%的乙醇处 , 的乙醇处 理两次, 理两次 , 每次 20 min。 。 , 用乙醇与醋酸异戊酯的混合液 ( V/V=1/1) 处理样品 30min, 再用纯醋 ) 酸异戊酯处理样品 1-2h。 。 临界点干燥。 临界点干燥 。 镀膜, 观察。 镀膜 , 观察 。 型环境扫描电镜中观察。 处理好的样品在荷兰 Philips 公司的 XL30 型环境扫描电镜中观察 。 Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO 4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer. II Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to the mixture of alcohol and iso-amyl acetate (v:v=1:1) for about 30 minutes, then transferred to pure iso-amyl acetate for about 1hour. In the end, the specimen was dehydrated in Hitachi Model HCP-2 critical point dryer with liquid CO 2 . III Coating and observation: The dehydrated specimen was coated with gold-palladium and observed in Philips Model XL30 ESEM. I




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