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弓形虫抗原成分的分析


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梅蛱 预防医学杂志 19 年 97 第 3卷 第 3 期 

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论著  
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tf    善
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严延生

何 似 翁育伟  杨婷婷  于恩庶 

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弓形 虫抗原成分的分析 

E  

福建省卫生防瘦站(50 1  3 00 )

摘要 本研  … 宿  …   进  证 实这 些虫株具有 免疫反 应性 的蛋 白抗厚至少有 ¨ 乖, 中分子量为 300 }其 20 道尔顿 的 P 2 白具有很 强的免疫  3蛋 犀性 , 弓形虫早 晚期免疫血 清 中也均能检 出 P 2抗体 , 在 3 确认 P 2蛋 白的生曲学琦 能高度保 守, 3 与其 它研 究报道 


缀妄  

,  

致 , 以利用 P 2蛋 白进 行 弓形虫病特异谤 断试剂 盘的研制 。 可 3  
关量词 弓形 虫 抗 原分析 P 2蛋 白 3 免疫即迹 
An l s   n A t e i C mp n n so   o o ls   o d ' n Y nh n  ta .F  。 C ne s o   i ae a yi o   n i n c o o e t fT x p a ma g n H( a   a s e g e 1 ‘   e t   r D s s  s g     F   rf e

C nr l Fu h u F  ̄ n 3 0 0 ) o to , z o , u a   5 0 1  
Ab ta t sr c  An i e s p e a e   r m  h e   t an   f t x p a ma t a   r   e a a l  s l t d fo h m a   t n   r p r d f o t r e s r i s o  o o l s   h twe e s p r ty io a e   r m  u n, g

r b i a d s n   e a a e y we e a a y e . Ra b t a t e a a an t t e h e   ta n   r  e e o e   o   h   a b t n   wi e s p r t l   r   n l z d   b i n i r   g is   h  t r e s r i s we e d v l p d f r t e   s

p roe u p s .Atla t1  id   fp o en   r o n  o h v  mmu d gc ra tvte  y i  e s  1kn so  r tis wee fu d t  a ei n o i e ciiisb  mmu o ltig Amo g n bo tn . n 
t e e p o n ,P3   t     l c lr weg t f3 0 0 d lo s wa   h wn t   a e a sr n  mm u o e i i   i e h s   r  ̄i s 2 wih a mo e u a   i h     2 0   a t n   ss o   o h v     t o g i o n g n et s y nc   t e r s o s   fP3   o l  e o s r e  n b t   a l  n  a e c le t d a t e a n c mp rs n o   h   e u t t   h   e p n e o   2 c u d b   b e v d i  o h e ry a l t   o lc e   n l r .I   o a i o   ft e r s l wih d s   d t  u l h d e s wh r ,t e s r is o   o o ls   s d i  h   t d   a e n   i n f a t d fe e c   t   h   a a p b i e   le e e h   t an   f t x p a ma u e   n t e s u y h v   o sg ii n   i r n e wih t e s c f r p e e ts r i   e r s n   t an RH ts g e tn  h t P 2 ma   e u e   n t e s e i cs r d a n s so  o o ls ss   u g si g t a   3   y b   s i   h   p cf   e o ig o i  ft x p a mo i  d i Ke   o d   To o l s   o d i yW r s x p a ma g n i   a tg n a a y i n e   n l ss i   P3   r t i   i 2p oen mmu o l ti g n bo t   n

弓形虫 是一种细胞 内寄生 的原虫 。孕期感染 弓  形虫可 引起流产、 死胎和 畸胎 , 天感染常表现为亚 临  后 床 状态 , 重者可 有全 身多 器官受累 , 但 发生 失 明、 精神  障碍等 症. 此外 , 弓形虫 感染也是 艾滋病病人致死的一 
个 主要 原 因  ] 。  

保存 液 (6 0培养 液、O 小牛 血清 、  D O) 14 2  5 MS 在涟  氮 中保存 1年以上仍具有很强生物学活性 。   2 .滋 养体的制备及 纯化 : 取液氮保存 株经腹 腔注  射 清洁 级 昆 明 鼠,2 9 7 ~ 6小时 小 鼠额 死 时用 氯仿麻 

醉, 以无菌 P S ml 舍 0 0  E TA 2 ) B 2 ( . 2 D -Na 冲洗 腹 腔 
收集虫体 , 重复洗涤腹腔 1次 , 台并收集 液作 为扩 大传 

弓形虫 的生 活史包括 了无性 和有性生 殖的过 程,   滋 养体 、 囊和卵囊是 弓形 虫发 育史 中的 3种 主要生  包 物形态 , 但急性期发病主要为滋养体所致  养体抗 原  滋 l 成分 复 杂. 0年代起 国外对其 进行 了大量研 究 , 8 发现  其 中一个称作 P 0的骥蛋 白具有 很强 的免疫原性 , 3 是  弓形虫 最主要 的抗原成分 , 经纯 化后 可 以作 为 弓形 虫  病的特异诊断试剂 , 也可能用于亚单位 疫苗的研制。 基  于这些 目的 , 我们使用免疫 印迹技 术对 车室保 存 的 弓  
形虫株进行分析 , 确定这些地方分 离株 的抗 原成分 , 评 

代 的母 种 , 0 1 用 肉汤培养 液过 夜培养 检测母种  取 . ml 无菌状 态 , 之后 , 5 0 虫体 接种每 其小 鼠扩大传  以 ×1  代直至 获得研究 所需足量 滋养体 , 体 中混 杂的少数  虫 鼠腹畦细胞用 Fel iol 一幻影葡胺分 层液去除啪。  
3 .免疫血 清制备 ; 上述 弓形虫株各用一只 体重约 

3 g雄性普通级新 西兰家兔制备多克 隆免 疫血清。纯  k 化的 弓形虫滋养体 甩无 菌水悬 浮, l 悬液舍 虫体  使 ml 25 0个, . ×1  在一2 " 0C冻融 3次进 一步使虫 体裂解 , 取  o 8 裂 解液 加 0 2 8 5 N C 调 节后再 加 1 完  .ml . m1.  a 1 m1
全 佐荆 (ima 经乳钵研 磨均匀 , Sg ) 在动物前后 腿 内侧、  

价其 应用价值 , 现将 结果报告 如下。  




材 料和方法 

1 .弓形 虫株及 有关特 征 : 研究 用 3 虫株 , 本 个 分  别从人 、 猪和兔标 车 中分 离, 中 2株为 本省分 离株 , 其  

脊 椎及 腹腔皮 内多点 注射 .0天后采 血检测 , 后再  1 此
用等量 虫体 和不完全佐剂( im ) Sg a 重复 免疫 2次 , 中问  间隔 7天. 最后一 次免疫后 1 0天 放血分 离血清 , 加叠 

人源分 离株命 名为 T H1兔 源分 离 株为 T R2 另 一  g 。 g ,
株广东 猪源分离株 T P 0 虽 然过 3株 弓形虫 分离 的  g 1, 宿 主、 年代和地点 差异很大 , 但对 小鼠均 有致 死作 用 ,   长期 经动物 传代 , 其毒力特征未见改变 , 滋养体 以细胞 

? 本 研究为福 建省科委及卫 生厅科技 项 目( 目编号为  项
9 5一 Z一 1 4  8)

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2  

海峡预防医学杂志

19 9 7年

第 3卷

第 3期 

钠。 分装 , 一2 " 置 0 C保存备用 。  
4 .间接免疫 荧光检测 ( A)制 备 弓形虫免 疫荧  I F :

主要 作用 。  

光抗原 片厦检测操 作过 程同常规 , 第二 抗体结台 物 为 
羊抗兔 IG 荧光抗体  g
,4 0   )oo
60   7 00

5 .全虫 体可溶性抗原 的制备 : 化的 弓形虫 虫体  纯
用 01 B . MP S悬 浮, 浮液 置于冰浴 上 , 超声波 破碎  悬 用

5分 钟 。 2 0r m 离心 5分钟后 取上清 用福林 酚蛋  在 0 0p
白定量法定量, 加叠氮钠 。 装 。 0 分 一2 ℃保 存备用。  

^c   ,∞

6 .十二烷 基磺酸钠 一聚丙烯 酰胺凝胶 电泳 (DS S  


P GE) 参 照文献“ 方法 制备 垂直 板凝 胶 。 离胶  A :   分

 ̄0 0 0 0 

及 浓缩胶 的浓 度分别 为 l  和 5 , 2   载样 缓冲 液含 巯 
基 乙醇, 一槽孔抗 原 上样量 为 1 1 , 每 0 g 电泳 后用考 马   ̄
1 OO 75  

斯亮蓝 -R 5 2 0染色分析 使 用的蛋白分子量 ( ) Mw 标  准为 : 酸 化 酶 9 0 0道 尔 顿 ( ) 牛 血 清 白蛋 白  磷 40 Da 。
60 0 a 肌 动 蛋 白 4 00 a 碳 酸 酐 酶 3 0 0 a  7 0D , 3 0D , 00 D 。 T MV外壳蛋 白 1 5 0   7 01  ̄。 7 .免 疫 印 迹 试 验 (mmu o lti I : 照  I n bot g。B) 参 n

图 1 免疫 1   0天后 3株 弓形 虫兔 免疫 血清 的免疫 印  迹 图谱 1T R2 2 T P 0 3T HI . g ;. g 1 ‘. g   全程 免疫血 清检出 的抗原条 带较免疫 l 0天时有  很大 增加 。 结台 I A 检测结 果 。 F 可见 弓形虫 感染 引起  的机体免疫反应 随着抗原 剂量的增 加和感染时问 的延  长, 其抗 体产生 的水平 也随着提 高。m 可 区分 的免疫  反应 带 至 少有 n 种 , 主要 共 有 反应 带 为 : 1 , 2 , P 4 P 2 
P 8P 2P 6 3 ,4 ~ 4 2 , 3 。 3 ~ 7P 1 2和 P 0 Tg 1 5 。 P 0和 T Hl g  

B ret (9 1 方法。用孔径 为 o  ̄ ̄n硝酸 纤维  un te等 1 8 ) .5r 索 微 孔滤 膜为 圃相 介 质 . 5 V 电压 电泳 过 夜或 以  以 0
1 0 电泳 2小时 , 移膜用 5 脱 脂奶粉配制的 T S 0V 转   B 

液封 闭 1小时 . lt10稀释 的 免疫血 清结台 2小  与  0
时 , 含 0 0  Tw e 一2 T S洗 3欢后 , 1,1 0 用 .5 en 0 B 与 0 

稀 释 的 S A— P结台 1小 时。 洗 涤 3次 . D   P HR 再 用 AB 钠 盐为底物 显色 1  ̄1 0 5分钟 。 自来水洗膜后晾 干分析 
结果 。  

的图谱没 有 明显区别 . T R2的反应 条带 比 T P1  而 g g 0 及 Tg 步 约 3 H1 ~5个 ( 图 2 。 无论是 同褥 或是异  见 )但 源 抗体反 应 . 所有 图谱 的 P 2反应 条带均 显 色很 探 . 3  

二、 结果 

1 .不 同虫 株 免 疫 效 果 分 析: g2 T P 0和  Tg 、 g 1 T H 虫体抗 原免疫家兔 1 后 . gl 0天 抗体产生 即 已达到  可检 出水平 。I A 检测效价均 为 1, 6 ; F 1 0 继续加 强免  疫 2次 , IG 抗体效价分别达到 l一 5 0 1t 2 0  其 g 2 6   1 8 , E  1— 5 0 用不 同虫体制备 抗原片进 行交叉 测定 , 2 6 ̄ 其抗  体敢价均在 1t18  ̄1t 5 0水平上 .   20   26     差异不超过 一 
个 漓度 。 表明该 3株弓形虫株的 免疫原 性和抗 原性 没 

进一 步表 明 P 2 白是弓 形虫的主要抗原 成分 。 3蛋 具有  很强的免疫原性 
H  

94 o   Oo 酊 oo   O ^, 。0 。  

有 明显区别, 以任用一种虫株 为抗 原进行血清检 渊。 可   2 抗 原成分分析 : T P 0株为抗原进行免 疫印  . 以 g1 迹试 验, 分别检测备虫株免疫 l 0天以及全程 免疫 后备  种蛋白抗原成分 及对应抗 体产生的情况。免疫 前血清  为对照,B试验 均束 见阳性反 应条 带 。 免疫 1 后  I 而 0天 各血清 I B检 测 已能 见 阳性 反应 带 。 亦 2血 清 中有  T
10 0 3 00 3 0 0道 尔 顿 ( 4 0 , 2 0 , 70 分别 以 P 4 P 2和 P 7 1.3 3 
1 0  75 0
,∞ O c  

表示 ) 蛋 白反 应 条 带 出 现, g 1 的 T P 0中 有 PI , 2 , 4 P 8 
P 2 P 7和 P 0条带 出现 , HI中有 P 4 P 2 P 7 3,3 S Tg I , 3 , 3 

囤 2 全程免 疫后 3株 弓形 虫兔 免疫 血清 的免 疫印迹  图谱 A. g I T P O为抗原 } . H1为抗原 。 B Tg  
1 Tg 2 2 Tg O 3 Tg   ? R ‘ ? Pl ; - H1

和 P 0条带 。 3 血清共有的反应 带为 P 4 P 2和  5 建 种 1 。3
P 7 其 中以 P 2为典 型, 色带 深( 图 1 E 3。 3 显 见 ) 此外 .   以

TR   2和 T HI g 为抗原 的 I B试验 , 也都 检 出 P 2反 应  3 带, 明弓形虫 P 2蛋 白在弓形虫体 液免疫反应 中起  表 3

三、 讨论  国 外广泛 使 用 R 株 进行 弓形 虫研 究 及制 备 抗  H

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悔蛱预 防医学杂志

I9 年 97

第3 卷

第3 斯 

3  

原 , 株系 S bn 1 4 ) RH a i(9 ] 等从一 例罹 患急 性脑炎 的儿  童脊 渡 中分 离获 得 . 主要 膜抗 原 成分 为 P 3 P 5  其 4. 3,

P 2蛋 白即 为国外文献 中所 称谓 的 P 0蛋 白, 3 3 可使 用 

本室保存 株研制弓形虫病特异性诊 断试 剂盒 :   参 考 文 献 
1 .M c b Ca e.RE. e  a . T  t 1 da no i a d te t n   0   ig s s n   r a me t f  

P 0 P 8和 P 2 多 数 弓形 虫分 离株都 有这 些抗 原成  3,2 2, 分. 研究所 使用的虫株 基本上 也包括 了这些 抗原成  本
分, 对 应 区带 P 1 4 . 3~ 3 ,3 , 3 如 4 ~ 2 P 6 7 P 0 P 8和 P 2  2,

因此 , 以认 为本 研究 的 弓形虫株 起码在 免疫 学特 性  可 上 与 R 代表株投 有差异。在这些主要膜抗原 中, 3  H P0

t x pa mo i. rJCl 1 8 ,   29   o o ls ss Eu    i 9 3 2I 5. n,   2 .M is,. tu Pn u e tsc rm i md To o ls   o di H J ef . e mo ysl a i     a   x p a mag n i  
i/ c i n   n p t n s wi   DS Re   n c   s, 9 , ‘ n e to s l   a i t   t AI . v I   tDi 1 86 8   e h
l O1 O  

是 一种糖基 化的膜蛋 白, 白含量 仅 占虫体蛋 白总 量  蛋 的 3 ~5 . 却具 有很 强的免疫原性 ,     但 在急 、 慢性 弓 
形虫病 患者 血清 中均能 检 出抗 P 0抗体 . 3 而且 具有 免  疫保 护性  。P 0蛋 白在 还原 条件下测定 的分子量 为  3 3 0 0 3 0 0 而 在 非 还 原 条 件 下 则 为 2 0 0~  20 ~ 5 0 . 70

3 .严 廷 生 , . 量 P A E IA 用 于^ 兽 弓形 体 病 血清 学 诊  等 授 P - LS

断的 比较研究. 福建医药 杂志 ,9 8 8 3   4 1 8 ,( )c . 8  4 金冬雁 , . 荨最 分子克隆 ( 2 科学出版社 ,9 3 第 版) 19.  
5 a tr .S n o o,F e a  S r da o i f o o a ma ne to   t l e 。 ign ss  t x p[s  i fcin  o u ig  p rfe   p r st p oen (P3 . Clt , Ex   sn  a u i d aa ie r ti i 0) i t pt
I mmu o , 9 8, 2 I2 2  n l 1 8 8    6 .

2 0 0 本 研究 使用 的 3株弓形虫株均能 弓起 机体免  80  。 【
疫应答 . 体产生的水平差别不大 } 抗 免疫印迹分析表 明 

各 株均 具 有 P 2蛋 白 , 免 疫早 期 就 能产 生 P 2抗  3 在 3
体, 在所 有反 应 区带 中其 显 色也最 深 . 明 P Z具 有  说 3 很强的 免疫原性 , 由于 我们使用 含巯基 乙醇还原 剂 的  载 样缓 冲液 进行 蛋 白 电泳 , 因此 我们 认 为本研 究 中 

9 a p r L e   1P r i t n o   jrme rn | r t i  .K s e ,   t . u i c i   f8ma   mb a e p o en a fa o o
o Tox lB   onⅡ  g n i h   i mun  ̄h o p in wih a o di y m   c s r to   t   

mon l n a   a i o i 日 J I mu l 1 8 1 2 I 4 3  oco n la tb d e .  m no , 9 4, 3    4 .

( 稿 日期 :9 7 7 2 ) 收 1 9 —0 — 8 

福建省首次检出雷丁沙门氏菌 
福建省卫生防疫站(50 1  3 00 )
在福州 市公 共场 所从业人员 健康带 菌者调查 中,  
19   4年 5月藐们从 一名 服务员 粪便 中检 出一株 雷 丁  9 沙 门氏菌 . 该菌为福建省首次检 出. 现将分离及鉴定结  果报告如下 。  


陈建辉 谢一俊 

解乳 糖、 蔗糖、 水杨素、 侧金 盏花 醇和肌醇。 快速 利用醋  酸钠  丙二酸钠 、 尿素酶 阴性 , 液化明胶 . 不 苯丙氮 酸脱 
氨酵 阴性 , 产生硫化氢 , 豌氨酸脱羧酶及精氨酸双 水解 

酶阳性 。其生 化反 应符 台典型的抄门 氏菌 。  
四、 血清学试验  该菌株 。抗 原为 14 5 l } 抗原第 1相为 ehI , . ,zH ,  第 z相为 1 5其 抗原式为 1 4 5 1 e h一 ,。 ., ., .2一 , 1 5 



分离培养 

新鲜粪便 标本经 s c肉汤增菌 , 分离于 S S琼 脂平 
板. 执其可疑 抄 门氏菌苗落移种 于克 氏双 糖及豌 氨酸 


动力琼脂培养基上 , 其反 应似抄 门氏菌 . 而进行 培  继
养性状和系统生化及血清 学等试验 

五 、  i 敏试验  按 WHO 推荐 的 K—B法 。敏感药物有 氮苄青毒  素、 羧苄青毒 素 , 毒素 、 链 庆大毒 素、 卡那番 素、 丁胺 卡  郄番 素、 新毒 素 、 氯毒素 、 痢特灵  呋喃妥 因、 复方 新诺 
明、 氟哌酸、 嘛酸 、 氟 环丙氟哌酸 、 头孢唑啉、 头孢 噻肟、   头孢三嘛 、 而对四环素 、 强力毒素耐药 

二、 培养性状 
本菌 为革 兰 氏阴性 无芽胞具 动 力短杆菌 . 营养  在

肉汤中呈均匀混浊生长 . 普通营养琼脂上生长 良好 , 在  
菌落圊整 . 光滑湿 润.~ 3 m大 小 , 2 r a 微隆起 。在 s s琼 

脂 平扳 上呈中心黑色的无 色菌落 。  
三、 生化反应 

综上 所述试验 结果 , 本菌符台肠 杆菌科 沙门 氏菌  属定 义. 沙门 氏蔷 DN 同源群 1其抗 原式 为 14  属 A . ,,
5 1 e h 1 5 按 K uf n — i .2| , : , , af ma nWht 门氏菌属 抗原  e抄

该 菌分解 葡萄糖产 醴产气 . 还原 硝酸盐 成亚硝 酸 
盐, 氧化酵 阴性 , 触酶 阳性 。 靛基质 阴性 . MR 阳性 ,   VP 阴性 . 西蒙 氏枸橼酸盐 阳性 。 快速分解麦 芽糖 、 甘露醇 、  

表. 本菌 为雷 丁沙 门氏苗 ( .edn ) 为 福建 省首次    ra ig .
检出的沙 门氏菌血 清型 
( 稿 日期 : 9 7 0 —2 ) 收 19— 5 1 

阿拉伯糖 、 卫矛醇 、 鼠李糖 、 糖、 簟 术糖和 山梨醇 。不分 


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