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第10章 测序技术


第十章 测序技术 在分子生物学研究中,DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于 测序的技术主要有 Sanger 等 (1977) 发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam 和 Gilbert (1977) 发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始, 随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G 四组不同长度的一系列核

苷酸,然后在尿 素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测,从而获得 DNA 序列。目前 Sanger 测序法得到了广泛的应 用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。 直 到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有 所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由 于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团, 使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、 T 或 C 处终止。 A、 终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整,使反应得 到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸 上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显 影或非同位素标记进行检测。 第一节 非同位素银染测序系统操作技术 一、概述: Promega 公司的 SILVER SEQUENCETM DNA 测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它 通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速, 廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经 90 分钟就可读序,这是常规 的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM 系统用未修饰的 5'OH 寡聚核苷酸作 为引物, 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操 作,也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外,也不需要象大多数荧光法那样用仪 器来检测序列条带。 Taq DNA 聚合酶在 95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级 Taq DNA 聚合酶是一种 Taq DNA 聚合酶的修饰产品,对于双链 DNA 模板有非常好的效果,具有高度的准确性,能产 生均一的条带,且背景低。 SILVER SEQUENCETM 系统包含被修饰的核苷酸混合物, 7-去氮 dGTP(7-deaza dGTP, dITP) 如 或 替代 dGTP 可清除由 GC 丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结 合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断 PCR 产物(<500bp)得到清楚 的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时,聚合酶可能会遇 到坚固的二级结构区域,它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。 因为这些原因,应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用 95℃变 性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说,较长的引物及 GC 含量高的引物能得到较强的信 号。实验结果表明,>24mer 的 GC 含量约为 50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线 性扩增模板 DNA 产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带,测序反应需要 0.03--2pmol 模板 DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链 DNA(dsDNA) 模板的碱变性及乙醇沉淀过程, 变性循环也有助于消除由于线性 dsDNA 模板(如 PCR 反应产物) 快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了 DNA 模板的二级结构,允许聚合酶穿 过高度二级结构化的区域。 二、材料 待测已提纯的 DNA,可为单链,也可为双链。

三、设备 高压电泳仪,测序用电泳槽,制胶设备,PCR 仪。 四、试剂 (1)SILVER SEQUENCETM DNA 测序试剂盒。 (2)丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液(38%丙烯酰胺 W/V,2%甲叉双丙烯酰胺 W/V): 95g 丙烯酰胺,5g 甲叉双丙烯酰胺溶于 140ml 双蒸水中,定容至 250ml,0.45mm 过滤器过滤 后,贮于棕色瓶中,置于 4℃冰箱可保存 2 周。 (3)10%过硫酸铵,0.5g 过硫酸铵溶于 4ml 水中,定容至 5ml,应新配新用。 (4)10×TBE 缓冲液(1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸,10mmol/L EDTA): 121.1g Tris, 51.35g 硼酸,3.72g Na2 EDTA ·2H2O,溶于双蒸水中定容至 1 升,置于 4℃下可贮存 2 周, 其 pH 约为 8.3。 (5)TBE 电极缓冲液:10×TBE 缓冲液稀释至 1×TBE 备用。 (6)TEMED (7)固定/停止溶液:10%冰醋酸(V/V)配制 2 升备用。 (8)染色溶液:硝酸银 2 克,甲醛 3ml,溶于 2 升超纯水中备用。 (9) 显影溶液: 克碳酸钠 60 (Na2CO3)溶于 2 升超纯水中, 使用前加 3ml 37% 甲醛和 40ml 硫代硫酸钠溶液(10mg/ml)。 (10)95%乙醇。 (11)0.5%冰乙酸。 (12)Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。 五、操作步骤: 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法 灵敏,而需要更多的模板量,此外,也不可能通过延长 X-光胶片曝光时间的方法增加信号强 度。因此,请使用推荐的 DNA 模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性,并且注 意如下几点: (1) DNA 的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量 DNA 一起电泳。 (2) 分光光度法对于很多 DNA 提取物包括质粒小量制备来说,并不能给出一个可信的 DNA 浓度估计,混杂的染色体 DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有 260 nm 光吸收。 因此,分光光度法常常错误地高估 DNA 浓度。 (3) DNA 制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸,虽然它们在电泳后 DNA 样 品的前面,并不能观察到,但它们仍会有 260nm 光吸收。 (一)测序反应: 1. 对于每组测序反应,标记四个 0.5ml eppendorf 管(G、A、T、C)。每管加入 2ml 适当 的 d/ddNTP 混合物(d/ddNTP Mix)。各加入 1 滴(约 20ml)矿物油,盖上盖子保存于冰上或 4℃ 备用。 2. 对于每组四个测序反应,在一个 eppendorf 管中混合以下试剂: (1) 样品反应: 质粒模板 DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液 5ml 引物 4.5pmol 无菌 ddH2O 至终体积 16ml (2)对照反应 pGEM-3Zf(+)对照 DNA(4mg)

4.0ml

5×测序缓冲液 5ml pUC/M13 正向引物(4.5pmol) 3.6ml 无菌 ddH2 O 至终体积 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第 2 步)中加入 1.0ml 测序级 Taq DNA 聚合酶(5u/ml)。用吸 液器吸动几次混匀。 4. 从第 3 步的酶/引物/模板混合物中吸取 4ml 加入每一个 d/ddNTP 混合物的管内。 5. 在微量离心机中离心一下,使所有的溶液位于 eppendorf 管底部。 6. 把反应管放入预热至 95℃的热循环仪,以[注意]中循环模式为基准,开始循环程序。 对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。 下列程序一般能读出从引物开始 350 碱基 的长度。 7. 热循环程序完成后,在每个小管内加入 3μl DNA 测序终止溶液,在微量离心机中略 一旋转,终止反应。 [注意] 1、测序所用模板 DNA 的量一般按下面要求加入: 模板种类/长度模板量 200bp (PCR 产物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp(超螺旋质粒 DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒 DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链 DNA 弱,因此使用超螺旋质粒作为模板时 其用量要比其它模板大一些。 2、计算与 4.5pmol 相当的引物纳克数可用以下一般公式: 4.5pmol=1.5ng×n,其中 n 为引物碱基数 计算与 1pmol 相当的引物微克数可用以下一般公式: dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中 n 为模板碱基对数 ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中 n 为模板碱基数 3、为阻止 Taq DNA 聚合酶延伸非特异性退火引物, 热循环仪必须预热至 95℃。温度变 换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式,建议从模 式 1 开始。 模式 1:适用于引物<24 碱基或 GC 含量<50% 95℃ 2 分钟。然后: 95℃ 30 秒(变性), 42℃ 30 秒(退火), 70℃ 1 分钟(延伸)。 模式 2:适用于≥24 碱基或略短的 GC 含量≥50%的引物。 95℃ 2 分钟, 然后: 95℃ 30 秒(变性), 70℃ 30 秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液 之后样品可在 4℃保存过夜。 (二)、 测序凝胶板的制备 1、玻璃板的处理: 银染测序的玻璃板一定要非常清洁,一般先用温水和去污剂洗涤,再用去离子水冲洗玻 璃板,除去残留的去污剂,最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝 胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步 对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。 (1)短玻璃板的处理 A. 在 1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入 5ml 粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合 溶液。

B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。 C. 4-5 分钟后, 用 95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一 清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。 [注意] 1. 在 95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很 好地粘附。 2. 准备长玻璃板之前要更换手套,防止粘染粘合硅烷。 3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。 (2)、长玻璃板的处理 A. 用浸透 Sigmacote 溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。 B. 5-10 分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的 Sigmacote 溶液。 [注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清 洗。或者凝胶用 10% NaOH 浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清 洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。 2、凝胶的制备: (1)玻璃板经粘合硅胶和 Sigmacote 处理后,即可固定玻璃板。该方法是用 0.2mm 或 0.4mm 厚的边条置于玻璃板左右两侧,将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨 鱼齿梳平的一面边缘,用夹子固定住。 (2)根据所需要的凝胶浓度,按下表制备测序凝胶,一般 6%-8%的胶浓度可获得较好的 结果。配制过程中,先用适量双蒸水溶解尿素,再加入 Acr&Bis 和 10×TBE 缓冲液,再用双 蒸水调终体积至 99.2ml,并用 0.45mm 的滤膜过滤,然后加过硫酸铵和 TEMED。溶解尿素时不 必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后,方可加入 TEMED 和过硫酸铵。一般在胶灌制 后 4-6 分钟,即开始聚合,如果聚合不好,则应使用高浓度的 TEMED 和过硫酸铵。 凝胶终浓度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE 缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 (3)胶配制好后,即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中, 倒完后,静止放置使之聚合完全。 [注意] 1、使用夹子固定玻璃板时,最好夹子的力量稍大一些,防止因力量不足使灌胶 的过程中出现漏胶液现象。 2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡,否则影响测序的结果。 (三)电泳: 1、预电泳 (1)当凝胶聚合完全后,拨出鲨鱼齿梳,将该梳子反过来,把有齿的一头插入凝胶中, 形成加样孔。 (2)立即将胶板固定在测序凝胶槽中,一般测序凝胶槽的上下槽是分开的,因而只有在 固定好凝胶板后,方能加入 TBE 缓冲液。 (3)稀释 10×TBE 缓冲液至 1×TBE,将该缓冲液加入上下二个电泳槽中,去除产生的 气泡,接上电源准备预电泳。

(4)有些电泳槽,如 LKB 的 Macrophor 等是使用水浴加热的,则应先将水浴加热至 55℃ 后进行预电泳。有的不使用水浴加热,依靠电泳过程中自身产生的热进行保温,如上海求精 有机玻璃仪器生产的测序电泳槽,这种槽需夹上二块散热铝板,使整个凝胶板的温度一致。 (5)按 30V/cm 的电压预电泳 20-30 分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子,同时 使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止 GC 丰富区形成的发夹状结构,影响测序的结果。 [注意] (1). 用鲨鱼齿梳制作加样孔时,应注意将齿尖插入胶中 0.5mm 左右,千万注意不能使 加样孔渗漏,否则得不到正确的结果。 (2). 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏,否则极易造成短路而损坏电泳仪。 2、样品的制备: 当在预电泳时,即可进行样品的制备,将反应完毕的样品在沸水浴中加热 1-3 分钟,立 即置于冰上即可。如果样品长时间不用,则应重新处理。可使用 4-6%聚丙烯酰胺凝胶,胶厚 0.4mm。厚度小于 0.4mm 的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油,但要小 心地吸取矿物油下的蓝色样品。 3、上样及电泳 关闭电泳仪,用移液枪吸缓冲液清洗样品孔,去除在预电泳时扩散出来的尿素,然后立 即用毛细管进样器吸取样品,加入样品孔中。上样顺序一般为 G、A、T、C。加样完毕后,立 即电泳。开始可用 30V/cm 进行电泳,5 分钟后可提高至 40-60V/cm,并保持恒压状态。一般 来说,一个 55cm 长,0.2mm 厚的凝胶板,在 2500V 恒压状态下电泳 2 小时即可走到底部,同 时在电泳过程中,电流可稳定地从 28mA 降至 25mA。为了能读到更长的序列,可采用两轮或 多轮上样。 [注意] 1、上样电泳时,一定要注意凝胶板的温度是否达到 55℃左右,如果还没有达到,则应 等温度达到后才能上样电泳。 2、一般来说电泳时,不宜使用太高的电压,因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低,并 且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。 (四)、 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似。在盘中 加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡 20 分钟 或直至样品中染料完全消失,胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶 液,用于终止显影反应。 3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶 3 次,每次 2 分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着 胶板边沿静止 10-20 秒,使水流尽。 4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动 30 分钟。 5. 凝胶显影: (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。 (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗 5-10 秒。注意,把凝胶从超 纯水转移到显影溶液的总时间不能长于 5-10 秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。 若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。 (3). 立刻将凝胶转移至 1 升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显 现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的 1 升显影液中继续显影 2--3 分钟,或直至所有条 带出现。

6. 固定凝胶:在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次 2 分钟,注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在 胶上印上指纹。 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白,黄色背景(如纸) 上观察凝胶,若需永久保存的记录, 则可用 EDF 胶片保留实验结果。 [注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法,本系统的成败受几个因素的影 响。 1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或 Milli-QR 的水)或 双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。 2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的,美国化学学会级碳酸钠较好,如 Fisher 和 Kodak ACS 试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500 或 S262-3,或 Kodak Cat #109-1990),一 般可获得较好的结果。 3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长,银颗粒会脱离 DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长,染色步骤可以重新进行。 4. 如果凝胶厚度超过 0.4mm 或丙烯酰胺浓度高于 4-6%,则有必要延长固定和染色 的时间。如果凝胶比 0.4mm 薄,染色反应后的洗涤必须缩短至不超过 5 秒。 5. 在室温下进行所有步骤,显影反应除外。显影溶液必须预冷至 10-12℃以减小 背景杂色。注意:临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。 不要重复使用任何溶液。 (五)、EDF 胶片显影 使用 EDF 胶片可增强测序条带的对比度,如果测序胶上条带很淡,我们建议把数据转移 至 EDF 胶片,银染胶在其影像转移至 EDF 胶片之后可增强条带可读性。 1. 在暗室内,将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫 射板,亦可用白灯箱,为确保曝光时间, 用一小条 EDF 胶片曝光不同时间, 检查不同的曝光 强度, 一般曝光 20--40 秒可得较好结果。 2. 在红灯下找到 EDF 胶片有缺刻的一角, 然后把胶片置于凝胶上,使缺口位于左上角。 由于 EDF 胶片是单面的,因此必须确保缺口在左上角。 3. 在 EDF 胶片上放置一干净、干燥的玻璃板,开亮灯箱约 20 秒。 4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影 EDF 胶片,可使用下列操作过程: a. 在 Kodak GBX 显影液中显影 1-5 分钟; b. 水洗 1 分钟; c. 在 Kodak GBX 定影液中定影 3 分钟; d. 水洗 1 分钟. [注意] 1. 进行 EDF 胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作, 以免印上指纹。 同时注意 EDF 胶片不能用自动胶片处理器。 2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同, 通过对一小条 EDF 胶片曝光不同时间 以选择你所用光源的最佳曝光时间,参阅胶片说明书。 3. 曝光时间短则 EDF 胶片影像较深,曝光时间长则有助于减弱背景。 第二节 T7 DN A 聚合酶测序技术 一、概述 T7 DNA 聚合酶最初具有 5'→3'聚合酶活性以及单链和双链 3'→5'外切酶活性。 T7 DNA 当 聚合酶用适当方法处理后,可使 3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的 T7 DNA 聚合酶又称 T7 测序酶。

使用 T7 测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。 因此, 放射自 显影所得到的结果较为清晰易辩, 对于许多模板来说, 使用含有 dGTP 的混合物即可得到理 想的测序结果。然而, 如果出现了带压缩的问题,则用含 dITP 的混合物来取代常规的 dGTP。 dITP 的掺入,使在富含 GC 的模板中也能有效地消除带压缩现象。 T7 测序酶具有很高的聚合速度,并有高度的延续性,正因如此,该酶在使用中不同于 Klenow 片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止,整个反应在很短的时间内完成,并且不 需要进行追加反应(Chase step)。 然而对于有紧密二级结构的区域, 错误的终止反应会给阅 读序列带来困难。如果碰到这些情况,应使用一些高温 DNA 聚合酶,如 Promega 公司的测序 级 Taq DNA 酶。利用高温 DNA 聚合酶独有的耐热特性,测序反应可在不利于形成二级结构的 高温条件下进行。 T7 DNA 聚合酶测序的快速而简便的方法是从 Klenow 酶和 AMV 反转录酶测序的操作步骤 修改而来的, 它的最大优点是具有很高的 5'-3'的 DNA 合成活性和极低的 3'-5'端外切酶的活 性。在测序过程中,若以同位素标记则相对于大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的大片段 Klenow,或反 转录酶 AMV 而言,则可使条带非常的均一,并且它的放射性背景极低。 T7 DNA 聚合酶测序时 DNA 的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段,第二 步方为双脱氧链末端终止的 DNA 合成过程。在第一步过程中,引物的延伸是在较低浓度的脱 氧三磷酸核苷酸的存在下完成的,在此反应过程中,已含有经放射性标记的 dATP。第二步过 程中,脱氧三磷酸核苷酸浓度提高,并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸,DNA 在合成过程中, 因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止,形成长短不一的 DNA 片段。 二、材料 待测的 DNA 模板,可用双链或单链模板。 三、设备 高压电泳仪,测序用电泳槽,照相显影用大号塑料盆,制胶设备,吹风机,放 射自显影盒,X-光片。 四、试剂 1、5×T7 DNA 聚合酶缓冲液:200mmol/L Tris·Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。 2、引物:使用通用引物 pUC/M13 正向或逆向引物。 3、DTT : 0.1mol/L。 4、5×常规标记混合物:7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。 5、5×dITP 标记混合物:15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。 6、 dNTP A 溶液 (适用于 dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCL。 7、ddG 终止混合物 (适用于 dGTP):dNTP A 溶液再加 8mmol/L ddGTP。 8、ddA 终止混合物 (适用于 dGTP):dNTP A 溶液再加 8mmol/L ddATP。 9、ddT 终止混合物(适用于 dGTP):dNTP A 溶液再加 8mmol/L ddTTP。 10、ddC 终止混合物(适用于 dGTP):dNTP A 溶液再加 8mmol/L ddCTP。 11、dNTP B 溶液(适用于 dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCl。 12、ddG 终止混合物(适用于 dITP):dNTP B 溶液再加 1.6mmol/L ddGTP。 13、ddA 终止混合物(适用于 dITP):dNTP B 溶液再加 1.6mmol/L ddATP。 14、ddT 终止混合物(适用于 dITP):dNTP B 溶液再加 1.6mmol/L ddTTP。 15、dd C 终止混合物(适用于 dITP):dNTP B 溶液再加 1.6mmol/L ddCTP。 16、测序用 T7 DNA 测序酶。 17、酶稀释缓冲液:10mmol/L Tris·HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。 18、终止溶液: 95%甲酰胺,20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚兰,0.05%二甲苯兰 。

19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S 的优点是可使条带为窄而清晰,并且操作更为 安全。放射强度为:1000-1500Ci/mmol,10mCi/ml。 20、TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。 21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。 22、X 光显影液:H2O:50℃ 800ml,米吐尔 2.2g,无水 Na2SO3 72g,对苯二酚 8.8g, 无水 NaCO3 48g , KBr 4g, 定容至 1000ml 备用。 23、 坚膜定影液: 600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸 13.4ml; F-5 水 硼酸 7.5g , 粉状钾矾 15g ,定容至 1000ml 备用。 24、TYP 肉汁培养基:16g 蛋白胨,16g 酵母提取物,5g NaCl, 2.5g K2HPO4,加水溶解, 定容至 1000ml。 25、 20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液: PEG 40% (分子量 8000) 储备液和 7.5mol/L pH7.2 NH4Ac 储备液等体积混合。 五、操作步骤: (一)、模板制备 1、M13 单链模板制备:在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如 X-gal/IPTG 的培养基上铺板之后, 含有 M13 重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑",事实上受感染的细 胞并非被噬菌体溶菌或杀死,出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染 的细菌慢的缘故, 从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模 板。 (1)过夜培养的宿主细胞(如 NM522 或 JM101)用 3ml TYP 肉汁培养基以 1:100 稀释。 在 37℃强烈震荡 1 小时之后, 细胞进入对数早期。此时, 将一个合适的含有重组 M13 的噬菌 斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。 (2)37℃强烈震荡(300rpm) 培养 6 小时。 (3)把细胞培养液转入两只 1.5ml eppendorf 管, 12000g 离心 15 分钟。上清液转移 到新的 eppendorf 管再离心 15 分钟。 小心地取出 1-1.2ml 上清液(注意不能触及沉淀), 再转 到新的 eppendorf 管。 . (4)将 0.25 体积的含 20%PEG(-8000)的 3.75M 醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬 菌体。 混匀后置冰上 30 分钟, 再以 12000g 离心 15 分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一 次, 用吸液器尖头将残留的 PEG 充分吸干净。 此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。 (5)将沉淀物重溶于 400ml TE 缓冲液中。 (6)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈震荡 1 分钟,12000g 离心 5 分钟。 (7)将水相转入一新的 eppendorf 管, 注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯 酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡 1 分钟, 12000g 离心 5 分钟。 (8)将上层水相转入另一新的 eppendorf 管, 重复第 7 步的提取, 如有必要重复多次 直至二相之间无可见物质存在。 (9)将上层水相转入一新的 eppendorf 管, 加等体积氯仿, 强烈振荡 1 分钟后, 12000g 离心 5 分钟, 多次重复此步骤。 (10)将上层水相转入新的 eppendorf 管, 加 0.5 倍体积的 7.5 mol/L 醋酸铵, 2 倍 体积乙醇, 混匀后-20℃放置 30 分钟。 (11)12000g 离心 15 分钟, 去除上清液, 用 70%乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被 搅起, 重新离心, 倾去酒精, 真空干燥沉淀物。 (12) DNA 的沉淀物溶解于 20ml 去离子水中, 2ml 样品进行琼脂糖凝胶电泳定量, 将 取 如果 DNA 量充足, 则可进行退火测序。 2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备:

噬粒是指含有丝状单链 DNA 噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的 pBluescript 系列和 pGEM 系列的质粒均属噬粒。 含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感 染后就能产生测序反应所需的单链 DNA 模板。 (1) 从新鲜平板上挑得含 pGEM 质粒 DNA 的抗 Amp 单菌落, 并接种到 100ml 含有 50mg/ml 氨苄的 TYP 肉汤培养基中, 在 37℃振荡过夜。 (2)取 100ml 过夜培养物接种到另一新的装有 5ml 含 50mg/mlAmp 的 TYP 肉汁培养基 的试管中, 在 37℃强烈振荡 30 分钟。 (3)加 40μl 辅助噬菌体 R408 或 M13 K07, 继续剧烈搅拌振荡培养 6-8 小时,使辅 助噬菌体超感染。 (4)12000g 离心 15 分钟后,去除沉淀,取上清,转移到一新 eppendorf 管中再次离 心 15 分钟, 小心地取 1-1.2ml 上清液(注意不能触及沉淀)。 (5)将 0.25 体积的含 20% PEG-的 3.75M 醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混 匀后置冰上 30 分钟, 再以 12000g 离心 15 分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用移 液器尖头将残留的 PEG 溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。 (6)将沉淀物溶解于 400ml TE 缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0,1mmol/L EDTA)。 (7) 加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈振荡 1 分钟, 再以 12000g 离心 5 分钟。 (8)将水相转入一干净 eppendorf 管(不要触动原管中两相交界面), 加等体积酚/氯 仿(1:1)混合液, 强烈振荡 1 分钟, 12000g 离心 5 分钟。 (9)上层水相转入一干净 eppendorf 管重复第 8 步骤提取, 如有必要重复多次直至二 相之间无可见物质。 (10) 将上层水相转入一干净 eppendorf 管加等体积氯仿, 强烈振荡 1 分钟后离心, 多 次重复此步骤。 (11)将上层水相转入一干净 eppendorf 管加 0.5 倍体积 7.5mol/L pH7.5 醋酸铵, 再 加 2 倍体积乙醇, 混和后-20℃放置 30 分钟。 (12)12000g 离心 15 分钟, 去除上清液, 用 70%乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被搅 起,重新离心, 倾去乙醇, 真空干燥沉淀。 (13)将沉淀物溶解于 20ml 去离子水中, 取 2ml 样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量, 如果 DNA 量充足,则进行退火和测序。 3、质粒膜板制备:参照第一章所述的方法。 (二)超螺旋质粒 DNA 的碱变性: 1、取 4mg(约 2pmol)超螺旋质粒 DNA 至一 eppendorf 管中,加无离子水到终体积 18ml。 2、加 2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室温(25℃下)保温 5 分钟。 3、加 2ml 2mol/L NaAc 溶液(pH4.6)涡旋混匀,使之中和。 4、加 75ml 无水乙醇,充分混匀后,置于干冰或-70℃沉淀 10 分钟。 5、于 12000g 离心 10 分钟,弃去上清,用 200ml 预冷的 70%乙醇洗沉淀后,干燥沉淀, 溶于 20ml 无离子水中。 (三)、测序反应: 1、引物和模板的退火: (1)在一离心管中,混合如下几种试剂: 引物 约 1-2pmol 5×T7 DNA 聚合酶测序反应缓冲液 2ml DNA 约 1mg 加 ddH2O 终体积至 10ml 。 (2)将试管盖盖上后,65℃ 加热 2 分钟,然后在大约 30 分钟左右的时间内,使试管的 温度缓慢地降到室温。 降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪, 也可使用已调至 65℃

的水浴,使它们的温度在室温下缓慢地降至室温即可。当温度降至 30℃以下时,退火结束。 可将小试管置于冰上,退火完毕的模板须在 4 小时内使用。 2、标记反应 (1)在一个标准的反应过程中(从引物处开始,可读到 500 个碱基以上),首先需要按 1:5 稀释标记混合物。如 4ml 混合物则加双蒸无离子水 16ml。该稀释液储存在 -20℃可使用 数周。如果所要测定的序列小于 30 个碱基,可将标记缓冲液稀释 15 倍,同时,模板 DNA 要 高于 0.5pmol。由于 DNA 模板量的不足,会降低标记反应的程度,即只标记引物后的几个核 苷酸。 (2)用冰预冷的 TE 缓冲液按 1:8 稀释 T7 DNA 聚合酶。酶液稀释后应立即使用,置于冰 浴不宜超过 60 分钟。不得使用标记混合物、DTT 溶液或非缓冲液类溶液稀释酶液。 (3)在已退火的引物 -模板混合物中,依次加入: 0.1mol/L DTT 1.0ml 标记混合物 2.0ml [a-35P]dATP 或[a-35S]dATP 0.5ml 已稀释好的 T7 DNA 聚合酶 2.0ml 混合充分(注意不得产生气泡),置于室温 5-10 分钟。 如果在电泳时碰到带压缩问题,则 dITP 混合物的效果优于 dGTP 混合物,dITP 混合物的 使用方法与 dGTP 混合物的使用是相似的。 [注意] 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。 2、在第(3)步的过程中,如果反应中有几次冷却,保温的时间过长或温度太 高的话,则会使测序反应短于 100 个碱基。 3、链终止反应: (1)取 4 支 eppendorf 管分别标上 G,A,T,C。 (2)每个管分别加入 2.5ml G,A,T,C 链末端终止混合物,立即盖上盖子以 防液体蒸发(本反应最好在标记反应前做好)。dGTP 和 dITP 混合物依据各自需要选用。 (3)将 eppendorf 管预热至 37℃ 1 分钟。 (4)待标记反应完毕后,取 3.5ml 标记反应液至上述 4 支 eppendorf 管中,稍 微离心一下,并将上述四管置于 37℃保温。注意在每一次反应中,均应使用新的吸液头,以 免交叉污染。 (5)继续保温 3-5 分钟(若使用 dITP 时,保温时间可延长至 30 分钟,对反应 产物没有任何影响。 (6)在上述四管中各加入 4ml 终止缓冲液。混合均匀后,置于冰浴中。本样品 即可上样电泳。用 35S 标记反应的样品可置于-20℃保存一周,此时样品只有极少量的降解。 而 32P 标记的则需在当天电泳以免降解。 (四)测序凝胶板的制备及电泳 参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至 75-80℃ 2 分钟,立即上样,每个泳道的使用量为 2-3ml (五)测序凝胶板的干燥及放射自显影。 电泳完毕后,经 32P 或 35S 标记的产物可用对 b-射线敏感的 X-光胶片放射自显影检测。 1、取下电泳的玻璃板,去除两边的压条,用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅 烷处理过,凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上,则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果 玻璃板没有经过粘合硅烷的处理,则可用 3MM 大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上,小心地揭下凝 胶,准备下一步的处理。 2、去除尿素,将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有 2 升 10%冰醋酸的大号显液盆中,轻 轻振荡 15 分钟,去除尿素。

3、干胶:含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干,而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备 如真空加热干胶仪抽干。 4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上 X-光片后, 用另一块相似大小的玻璃板夹住,然后用夹子固定,置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则 可置于 X-光曝光盒中放射自显影。一般 32P 曝光过夜即可,而 35S 为 2-3 天。 5、曝光完毕后的 X-光片即可冲洗,获得序列信息。将 X 光片置于水中先湿润,然后置 于显影液中显影,直至条带清晰显示为止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影 15 分钟 以上。取出 X-光片干燥并读出序列。 [ 注意] 1、去除尿素是非常重要的,如果有残存的尿素,则在干胶过程中会使凝胶很粘, 而无法进行放射自显影。可以用 10%冰醋酸洗二次,第一次 15 分钟,第二次 10 分钟。如果 胶浓度高于 12%,则有可能在干胶过程中会产生皱纹,防止的方法有二种:(1)冰醋酸溶液 中加入 1%-2%的甘油;(2)不干燥胶,直接在冰箱中以冰冻状态曝光,应注意的是在使用这 个方法时,要在凝胶和 X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。 2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光,否则 X-光片会粘在胶的表面,致使以后 的操作困难。 3、曝光时间应根据所使用的同位素而定,如果同位素已过半衰期则应相应延长 曝光的时间。 思考题: 思考题: 1、影响银染测序结果的主要因素是什么?应如何消除? 2、使用 T7 DNA 聚合酶测序时,需要获得较长的序列信息,可使用哪些方法解决?


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