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碱裂解法抽提质粒的原理


碱裂解法抽提质粒的原理
SDS 碱裂解法制备质粒 DNA 的原理:细菌悬浮液暴露于高 pH 的强阴离子洗涤剂中,会 使细胞壁破裂, 染色体 DNA 和蛋白质变性, 相互缠绕成大型复合物, 被十二烷基硫酸盐包盖, 当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效沉淀下来,离心去除后,就可从上清液中 回收质粒 DNA。 1.试剂 (1)溶液Ⅰ:Tris-HCL(pH8.0)25

mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖 50mmol/L,溶菌 酶(临用时加)5mg/ml (2)溶液Ⅱ(新鲜配制) :NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V) (3)溶液Ⅲ(100ml) :5mol/L 乙酸钾 60ml,冰乙酸 11.5ml(pH4.8),水 28.5ml (4)酚-氯仿-异戊醇(25:24:1) (5)无水乙醇和 70﹪乙醇 (6)无 DNA 酶的胰 RNA 酶 (7)TE 2.实验流程 (1)挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养,用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于 20ml 含有相应抗生素的 LB 液体培养基中,于 37℃剧烈震摇下培养过夜。 (2)将 1.2ml 培养物倒入微量离心管中,于 4℃以 5000g 离心 5 分钟(两次) ,将剩余的培 养物贮存于 4℃。 (3)吸取并弃去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。 (4)将细菌沉淀重悬于 100μ l 溶液Ⅰ中,剧烈振荡。 注:溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的 pH 有很大的依赖关 系,当其低于 8.0 时,细胞裂解的效果就大为逊色。因此,溶液Ⅰ不仅使用了 Tris-HCL 缓 冲体系,同时好加入了适量的葡萄糖而有利于 pH 的调节。乙二胺四乙酸(EDTA)因其是二 价金属离子(如 Mg2 等)的螯合剂,故少量地存在便可抑制核酸酶的活性,从而保护质粒 DNA 免被降解。 (5)加 200μ l 溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒离心管 5 次,以混合内容物。确保离心管的整 个表面均与溶液Ⅱ接触。注意不要振荡。将离心管放置于冰上 5 分钟。 注:SDS 的作用在于使细胞裂解,以释放出质粒及染色体的 DNA。在高 pH(12.0-12.5)的


反应体系中, 则会使线性缺口的质粒 DNA 以及线性的染色体 DNA 片段被选择性地变性, 而共 价闭合环状的质粒 DNA 则不会受影响(注意:如果 pH 超过了 12.5 时,朝螺旋闭合环状 DNA 亦会发生不可逆的变性效应) 。但在此种条件下,蛋白质同样也会发生变性,从而减轻了核 酸酶对质粒 DNA 的降解作用的可能性。若把反应管在 65℃水浴中保温一段时间,会进一步 加强染色体 DNA 的变性作用,得到清亮的裂解液。 (6)加 150μ l 溶液Ⅲ,盖紧管口,将管倒置,温和振荡 20 秒,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂 解物中分散均匀,之后将管置于冰上 5 分钟。 注:pH4.8 的醋酸钾溶液降低了反应混合物中的 pH,起到中和作用,从而使线形的质粒及染 色体 DNA 复性, 并聚集成不可溶的网络状聚合物。 同时高浓度的醋酸钾亦会引起蛋白质-SDS 复合物和高分子质量的 RNA 分子发生沉淀, 而共价闭合环状的质粒 DNA 分子则仍然以天然的 状态保存在溶液中。这样通过离心处理,便可把网络状的 DNA 聚合物同变性的蛋白质-DNA 等以复合物形式沉淀出来,从而使质粒 DNA 得到纯化。 (7)4℃,12000g 离心 5 分钟,将上清液转移另一离心管中。 (8)加等体积酚-氯仿-异戊醇,振荡混匀。 (9)4℃,12000g 离心 5 分钟,将上清液转移到另一离心管中。 (10)用两倍体积的无水乙醇于室温沉淀质粒 DNA,振荡混匀,于室温放置两分钟。 (11)4℃,12000g 离心 5 分钟。小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有 液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 (12)用 1ml70﹪乙醇溶液洗涤沉淀,4℃,12000g 离心 5 分钟,弃去上清液,在空气中使 核酸沉淀干燥。 (13) 50μ l 含无 DNA 酶的胰 RNA 酶 用 (20μ g/ml) TE 重新溶解核酸, 的 振荡, 贮存于-20℃。


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