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肝素钠测定数据以及标准曲线


肝素钠的提取与检测
摘要
本实验主要是对肝素钠提取工艺的研究。 对国内外肝素钠的提取 和纯化方法进行研究和分析,建立以牛内脏(肝、肺、心)为原料, 采用盐解、离子交换的方式与乙醇沉淀相结合提取肝素钠。利用天青 A 染色法检测肝素钠的效价,测定波长是 505nm,与标准曲线对比可 得到样品中肝素钠的效价。利用浓硫酸氧化法,在波长为 298nm 处 的吸光度来确定

肝素钠的浓度。利用双缩脲法,在波长为 540nm 处 的吸光度来确定蛋白质的含量。试验测得肝素钠的效价平均值为 139.483U/mg, 肝素钠的浓度平均值为 200.8752mg/kg, 去除蛋白质效 果良好,均在 99%以上。

关键词:肝素钠,盐解,树脂,天青 A,纯化,蛋白质 1.1 研究背景和意义
1.1.1 研究背景 肝素钠又称肝素,是重要的生物药品,作为天然的抗凝血物质而 受到世界各国的重视。我国是世界上肝素钠主要出口国之一,但是出 口产品以低效价的粗品肝素为主。肝素广泛分布在哺乳动物的组织 中,如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都 有存在。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在
[1]

。这种复合物没有抗凝血活性,但在去除蛋白质后,这种活性逐渐 表现出来。肝素具有强抗凝作用,是防治深层静脉血栓形成等血栓栓 塞性疾病的首选药物,随着研究的深入,人们发现肝素不但有抗凝、

抗血栓形成和调整血脂的作用,还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等 多种生物学功能。中国具有丰富的畜产品副产物资源,但我国生产的 肝素产品效价低,提取率低的问题很突出,这种情况下,只有提出肝 素提取纯化新工艺,才能提高畜产品加工副产物的附加值,拓宽利用 领域,增加国民收入,提高中国在国际上的地位。 1.1.2 研究意义 肝素主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠粘膜细胞内。目前,国 内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主,在提取工艺 中都必须经过肝素蛋白质复合物的提取、 肝素蛋白质复合物的分解和 粗品肝素的精制三个过程。 国内每年猪牛屠宰量极大,副产物产量极高,但是目前利用率却 很低。其主要原因是加工技术和装备水平落后,产品提纯方面的产业 化技术还没有真正突破。 1.1.3 肝素效价显色原理 肝素是一种粘多糖, 在多糖链上带有很多阴离子基团, 如磺酸基、 羧基等。因而肝素具有很强的负电性,能与阳离子或带正电荷的分子 结合,生成复合物。天青 A 染料是一种碱性染料,即正电荷部分能 与肝素的阴离子结合, 生成肝素天青复合物, 并能表现因光异色现象, 即产生一种较原来染料颜色不同的反应, 这一反应程度与肝素结合量 有一定关系。1976 年,杰奎斯等在贝克曼 DK-2 分光光度计上利用天 青 A 作肝素定量测定,发现低浓度肝素在波长 505nm,pH=8.6 的条 件下,肝素浓度与吸光值之间符合朗白---比尔定律。该法可用于测定

肝素效价和生产过程的控制。

2 实验材料与方法
2.1 实验材料 2.1.1 试剂和材料 牛内脏 肝素标准品 氯化钠 乙醇(95%) 巴比妥 分析纯 秦宝 中国药物生物检定所(北京) 上海恒远生物科技有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 西安化学试剂厂

分析纯

天青 A 染料

生物染色剂 天津市天新精细化工开发中心 天津市大茂化学试剂厂 白银化学试剂厂 上海易利生物科技有限公司

氢氧化钠 分析纯 硫酸 硼砂 分析纯 分析纯

陶氏 AMBERLITETMFPA98CL 食品级特种聚合物(树脂) 上海 唯高实业有限公司 2.1.2 实验设备 JJ—2B 组织捣碎匀浆机 PH-3C 计 金坛市医疗仪器厂

上海佑科仪器仪表有限公司 常州国华电器有限公司

85-2 恒温磁力搅拌器 电热恒温热水槽

HH-S8 型北京科伟永兴仪器有限公司

旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂

100 目筛 电磁炉

浙江上虞市水仙纱筛厂 广东美的生活用品制造厂 上海一恒科学仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司

真空干燥箱 真空抽滤机

756P 紫外—可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司 电子天平 填充柱 2.2 实验方法 原料——提取——吸附——洗涤——洗脱——沉淀——脱水干 燥——肝素钠粗品——提纯——肝素钠。 2.2.1 具体操作控制 (1)提取[2,3] 取牛肺样品 100g,加入 5 倍量的蒸馏水,在组织捣碎机中充分 破碎至肉糜状,用 NaOH 溶液调 ph 至 8.5,加入 5%NaCL 在 60℃下 不时搅拌 2h,立即升温至 100℃10min 沉淀蛋白质,用 100 目的筛过 滤,滤液备用。 (2)吸附 滤液冷却至 50℃左右,用氢氧化钠调节 ph 至 8.5,加入 8%的已 处理好的树脂,在恒温磁力搅拌器上维持温度在 50℃左右,连续吸 附 8h,过滤,树脂备用。 (3)洗涤 将树脂装入填充柱,先用蒸馏水冲至无色,虑干。用 1.2mol/L 慈溪市天东衡器厂

的氯化钠浸泡洗涤 30min。滤液弃掉。 (4)洗脱 在树脂填充柱中加入 5mol/L 的 NaCL 浸泡 3h,再用 3.5mol/L 的 NaCL 浸泡 2h,将两次的滤液收集在一起备用。 (5)沉淀蛋白质 将滤液调 pH 至 3.5 处理 30min,沉淀酸蛋白,过滤;将滤液调 pH 至 10,处理 3h 沉淀碱蛋白,过滤。 (6)乙醇沉淀 取滤液用 1.5 倍 95%酒精处理 2h,真空抽滤,保留固体,滤液收 集进行乙醇回收。 (7)干燥 把抽滤固体在 60℃下真空干燥。得到肝素粗品。 2.2.2 肝素效价检测 采用天青 A 染色法检测肝素效价[4,5],即先用肝素标准品作光密 度标准曲线,然后测定样品的光密度值,对照标准曲线查出样品的效 价。 具体的检测方法如下: 1.0 gNaOH 用蒸馏水定容于 50 mL 容 将 量瓶中,即得到 0.5 mol/L 的 NaOH 溶液。称取巴比妥 5.52 g,溶 于上述 NaOH 溶液中,待完全溶解后,冷却,用蒸馏水稀释至 500 mL, pH 计校正。 用 称取天青 0.5 g, 先用少量蒸馏水将其完全溶解, 再稀释至 500 mL,过滤,将滤液(储存液)冰箱保存。临用时,吸 取储存液 5mL,加蒸馏水 25 mL,混合均匀即得。 精确称取 10~15 mg 的待测样品, 先用蒸馏水溶解成 1 mg/mL,

再取 250 mL 容量瓶 2 个, 各吸取上述溶液 2.5 mL。 加水稀释至刻度, 即配成 0.01 mg/mL 的测定液。吸取测定液 1~5 mL 加蒸馏水补足 到 5 mL,充分摇匀后在 505 nm 下测定吸光值,测 3 个平行样,取 其平均值[6]。 2.2.3 肝素浓度的测定 采用浓硫酸氧化法来检测溶液中肝素的含量, 使用猪小肠肝素标 准品来制作标准曲线,准确称取肝素标准品,配成 482?g/mL 肝素水 溶液,再按 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL 的浓度梯度,分别吸取 不同体积的肝素水溶液, 用蒸馏水定容到 1mL, 向每份溶液中分别加 入 3mL 含 0. 025M 硼砂的 90 %(v/v)的硫酸溶液,充分摇匀,置于 90℃水浴中,经常搅动,10min 后取出,冷至室温,半小时后采用紫 外-可见分光光度计测定 298nm 光密度(另做不加肝素,以水代之的 空白试验作对照) ,重复 3 次(n=3) ,取平均值。按照各组试验数据 可绘制出标准曲线,根据标准曲线方程计算溶液中的肝素含量[7]。 2.2.4 蛋白质的测定 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应, 生成 紫红色化合物,称为双缩脲反应。 具有两个或两个以上肽键的化合 物皆有双缩脲反应, 蛋白质在碱性溶液中, 能与 Cu2+形成紫红色络合 物,颜色深浅与蛋白质浓度成正比,故可以用来测定蛋白质的浓度。 在一定的浓度范围内,颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可 用比色法测定蛋白质浓度。

3 结果分析

3.1 标准曲线的绘制 3.1.1 肝素效价标准曲线的绘制 用肝素标准品绘制肝素效价标准曲线, 其测定方法和检测结果如 表 3.1 所示。根据检测结果绘制出的肝素效价标准曲线如图 3.1 所 示。
表 3.1 肝素效价标准曲线测定数据 Table 3.1 Dctection data of heparin potency standard curve 试管号 肝素标准溶液(ml) 蒸馏水(ml) 巴比妥缓冲液(ml) 天青 A 染料(ml) OD505(nm) 肝素效价(U/mg) 0 0 5 1 1 0 0 1 1 4 1 1 0.056 1.003 2 2 3 1 1 0.104 2.006 3 3 2 1 1 0148 3.01 4 4 1 1 1 0.230 4.01 5 5 0 1 1 0.248 5.017

图 3.1 肝素效价标准曲线 Fig.3.1 Standard curve of heparin potency

以肝素效价为横坐标 X,肝素在 505nm 的吸光度为纵坐标 Y, 根据测定结果绘制标准工作曲线,试验结果表明其线性回归方程为: Y=0.0421X+0.001,回归方程的决定系数 R2=0.9982,说明方程拟合 较好。 3.1.2 肝素浓度标准曲线

用肝素标准品进行浓度测定,其测定数据结果如表 2.2 所示, 根据测定数据做出肝素浓度标准曲线如图 2.2 所示。
表 3.2 肝素浓度标准曲线测定数据 Table 3.2 Data of heparin concentration standard curve 肝素浓度(ug/ml) 14.46 28.92 57.84 86.76 115.68 OD298(nm) 0.106 0.223 0.481 0.717 0.930 图 3.2 肝素浓度标准曲线 Fig.3.2 Standard curve of heparin concentration

以肝素浓度为横坐标 X, 肝素在 298 nm 的吸光度为纵坐标 Y, 根据测定结果绘制标准工作曲线,试验结果表明其线性回归方程为: Y=0.0039X+0.052,回归方程的决定系数 R2=0.9994,说明方程拟合 较好。 3.1.3 蛋白质浓度标准曲线 由血浆蛋白质标品得到蛋白质含量的标准曲线如图 3.3 所示。
图 3.3 蛋白质含量标准曲线 Fig.3.3 Standard curve of protein contents

蛋白质含量的线性回归方程为:Y=0.0414X+0.0026,方程中 Y 为吸光度,X 为测定液中蛋白质含量(mg/mL) ,线性回归方程的决 定系数 R2=0.9993。说明标准曲线相关性好,可用该标准曲线计算肝 素提取液中的蛋白质含量。 3.1.4 牛内脏肝素钠效价测定 牛内脏(肝脏、肺脏、心脏)肝素钠效价测定,其测定数据如表 3.3 所示。 肝脏 普通育肥牛 秦宝雪花牛 27.91 33.05 肺脏 197.15 254.16 心脏 169.83 154.39

由表可知,各个部位肝素钠的含量差别巨大,表明肝素的含量与 脏器的部位以及功能有一定的关系。 秦宝雪花牛的肝素的效价除心脏 外均超过普通育肥牛。 宋大巍的肝素的高效提取和分离纯化技术研究 中测得肝素粗品的效价为 115U/mg,任红媛,何泼,李红心的猪小肠粘 膜中肝素钠提取与精制工艺研究中以猪小肠为原料测得粗品肝素钠 的效价为 73.19U/mg。周先琬[8]研究采用酶水解法精制肝素,其得到 的粗肝素效价为 50~120 U/mg。

差异源 组间 组内 总计

SS 148.9871 259.2992 408.2863

df

MS F P-value F crit 1 148.9871 12.64067 0.001772 4.300949 22 11.78633 23

由上表可知普通育肥牛和秦宝雪花牛肝素钠效价差异显著。 和培 育方式有密切的关系, 不同牛之间由于生理等因素的影响才导致了差 异的显著性。 3.1.5 牛内脏肝素钠浓度测定 牛内脏(肝脏、肺脏、心脏)肝素钠含量(mg/kg)测定,其测 定数据如表 3.4 所示。 肝脏 普通育肥牛 秦宝雪花牛 63.8615 139.6723 肺脏 357.2889 580.5217 心脏 39.3296 49.9720

由表可知肝素钠的含量每个部位各不相同,肺脏含量最高。同一 个部位不同牛种的肝素钠的含量也不相同。 秦宝雪花牛的含量均高于 普通育肥牛。 宋大巍的肝素的高效提取和分离纯化技术研究中测得猪 小肠中肝素的提取率为 189.19mg/kg,蛋白酶和超声波辅助提取率为 230.81mg/kg。根据阅读的文献中提取率达到最高的为 780mg/kg。 3.1.6 牛内脏提取物粗品中蛋白质测定 牛内脏(肝脏、肺脏、心脏)提取物粗品中蛋白质除去率(%) 测定,其测定数据如表 3.5 所示。 肝脏 肺脏 心脏

普通育肥牛 秦宝雪花牛

99.95 99.95

99.54 99.64

99.83 99.46

由表可知,蛋白质的除去效果很好,可见经过碱沉淀和酸沉淀之 后蛋白质的含量已经达到很低的水平,对实验结果的影响较小,得出 的数据是可靠的。

4 讨论
本实验是采用成熟的盐解法测定肝素钠的含量。本方法操作简 单,节约成本,重复性好。此方法与酶解盐解结合相比较略现落后, 提取率、效价和浓度差别较大,可能由于细胞破碎的不够充分,肝素 没有完全转化成肝素钠。 下一步要做的就是怎么用盐解法提高肝素钠 的提取率,在提取时间、吸附时间和洗脱时间,以及洗脱所用盐的浓 度上做进一步的研究,确定最佳提取和洗脱条件,得出更加有说服力 的数据。 N-硫酸化程度高和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖。是由 D-β-葡糖醛酸(或 L-α-艾杜糖醛酸)和 N-乙酰氨基葡糖形成重复二 糖单位组成的黏多糖。由紧靠血管的肥大细胞产生,并贮存于肥大细 胞的颗粒中,应一定的刺激而释放,具有抗凝血作用。临床上主要用 于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循 环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展,肝素的应用不断扩 大。肝素对医学的作用巨大,同时也会有负面的影响肌注可引起局部

血肿,静注后可产生可逆性血小板减少症。偶有过敏反应如哮喘、荨 麻疹、鼻炎、结膜炎和发热等,长期使用可产生暂时性秃发症、骨质 疏松和自发性骨折。用量过大,主要产生自发性出血,如有严重的出 血现象, 可静注硫酸鱼精蛋白急救(1?g 硫酸鱼精蛋白可中和 100 单位 肝素)。

5 参考文献
[1] Nader HB, Lopes C, Rocha Hao, Santos EA, Dietrich CP. Heparins and heparinoids:occurrence, structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activitie[J].Curr. Pharm. Des.2004,10:951~966. [2]张丽萍,肝素提取纯化新工艺及降解后的生物活性研究[D]2010,6,5-6 [3]宋大魏,肝素的高效提取和分离纯化技术研究[D]2008,4,12-14. [4] Characterization and comparison of structural and compositional features of planetary quadrilateral pyroxenes by Raman spectroscopy Alian Wang, Brad L. Jolliff, Larry A. Haskin, Karla E.Kuebler, and Karen M. Viskupic American Mineralogist, Jul 2001,86:790~806 [5]陈钧辉,陶力,李俊等.生物化学试验(第三版)[M].北京:科学出版社,2003:27-29. [6] 张丽萍,肝素提取纯化新工艺及降解后的生物活性研究[D]2010,6,24-25. [7]Ji ZH,Jiang CK. A Simple Chemical Determination of Heparin[J]. ActaBiochimica et Biophysica Sinica,1980,5:61-63. [8] 周先琬,何伟.酶降解法精制肝素钠[J].中国生物化学与分子生物学报,1999,6(18):488-490.


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