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突变体库反馈信息


关于突变体库的反馈信息

Shm 201109

1. 一元载体、二元载体构建的原理及适用范围? 2. DNA 四个碱基是怎么组合的? 3. 增强子捕获、启动子捕获可否再详细些? 4. 突变体库数量的计算方法?

1. 一元、二元载体构建的原理及适用范围?
? 一元载体构建的基本原理:
– 外源基

因首先克隆到一个克隆载体上,该载体含有一段与缺 失T-DNA的Ti质粒有同源序列,当该载体进入土壤农杆菌后, 与Ti质粒整合,然后由Ti质粒提供T-DNA向植物细胞转移的vir 基因产物。

? 二元载体构建的基本原理:
– vir区与T-DNA区具有不同的功能,它参与T-DNA的转移与整 合到植物细胞基因组的作用。利用这一特点,可将带有外源 目的基因的T-DNA和vir区安置在不同的质粒载体上进行操作。

同源重组

2. DNA 四个碱基是怎么组合的?

2.1 核酸的组成
核酸 核苷酸

磷酸

核苷

戊糖

碱基

碱基种类和结构

DNA与RNA

核苷(ribonucleoside)的形成

H

碱基和核糖(脱氧核糖)通过糖苷键 糖苷键连接形成核苷(脱氧核苷)。 糖苷键 核苷:AR, GR, UR, CR(2-脱氧核苷:dAR, dGR, dTR, dCR)

核苷酸(ribonucleotide)的结构
N (A, G, C, T)

H

核苷(脱氧核苷)和磷酸以磷酸酯键 磷酸酯键连接形成核苷酸(脱氧核苷酸)。 磷酸酯键 核苷酸:AMP,GMP,UMP,CMP(2-脱氧核苷酸:dAMP,dGMP, dTMP,dCMP)

核酸的结构

核苷酸之间以磷酸二酯键 (3′-5′)连接形成多核苷酸 链,即核酸(一级结构)。

核酸的一级结构

核酸的二级结构

B-DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 要 点 ( Watson, Crick, 1953)
两条反向平行的互补多核苷酸链围绕一个中心轴盘绕成右 手双螺旋结构; 右手螺旋结构,深浅沟各一; 螺旋直径2.0nm,每十个核苷酸转一周,螺距3.4nm; 磷酸脱氧核糖构成双螺旋骨架位于外侧,碱基位于内侧。 碱基平面垂直于螺旋轴; 双螺旋两条链间的碱基通过氢键相链,保持双螺旋稳定。 A-T间两条氢键、G-C间三条氢键。

B-DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 要 点 ( Watson, Crick, 1953)

A 外型 螺旋方向 螺旋直径 碱基轴升 碱基夹角 每圈碱基数 螺距 碱基倾角 活性 粗短 右手 2.55nm 0.23nm 32.7? 11 2.53nm 19? 次之

B 适中 右手 2.37nm 0.34nm 34.6? 10.4 3.54nm 1? 最高

Z 细长 左手 1.84nm 0.38nm 60? 12 4.56nm 9? 最低

3. 增强子捕获、启动子捕获和基因捕获

增强子捕获: 增强子捕获:报告基因与最小启动子融合,典型的最小启动子,含T A T A b o x 及转录起始位点,但不能单独驱动报告基因的表达,若 被插入位点附近的增强元件激活, 则可导致报告基因的表达。

启动子捕获: 启动子捕获:用不带启动子的报告基因, 随机插入染色体中, 由插入 位点附近基因的启动子启动报告基因表达, 通过检测报告基因是否表 达、 以及报告基因在生物体中的表达部位, 可以判断报告基因插入位 置附近是否有基因的启动子存在以及该基 因的表达是否有特异性。

基因捕获: 基因捕获:载体的报告基因之前含一个或多个剪切受体序列,报告 基因前也无启动子, 只有插在一个转录单位之内且方向正确时才能 表达。

? 增强子捕获不受插入位置的限制,可导致报告基因高频率地表达;启 动子捕获及基因捕获含有一个无启动子的报告基因,所 以只有当插入 发生在转录单位且方向正确时报告基因才能表达,相比增强子捕获更 可能导致基因失活。

突变体库数量的计算方法?
? P=1-(1-(L/C))nf
– – – – – P:发现任意一个基因插入突变的概率; L:基因的平均长度; C:单倍体基因组的大小; n:是插入突变的株系数; f:是每个株系平均插入位点数。

? 水稻中,C=4.3*108bp,L=3kb,f=1.4,理论上饱和突变体 库的P值为1,以95%的概率发现任意一个基因的突变,需 要一个包含306000个株系的突变体库。

水稻耐淹与深水稻基因的克隆和 遗传分析

一、研究背景与意义
? 亚洲(>30%)、非洲(>40%)的水稻种植为浅水稻 (15~50cm)或深水稻(>50cm); ? 在一些雨水充沛的国家和地区,在水稻的生长季节中,通 常水平面逐渐上升至几米或遇到洪水将水稻完全淹没的现 象,一般的高产水稻品种在完全淹没一星期基本都死亡; ? 克隆相关基因,进行分子聚合育种,培育既能耐淹避淹又 高产的水稻品种。

二、相关基因的克隆与功能分析

1. Sub1A(Submergence 1)

1.1 定位群体的构建与基因克隆
? 大部分的栽培稻(品种)在完全淹没一周后死亡; ? FR13A,籼稻品种,在完全淹没(水的浑浊度、温度及光照有关)两 周后仍能存活并继续生长发育; ? FR13A与不耐淹的粳稻M-202杂交,获得4022株定位单株,图位克隆, 将Sub1位点定在9号染色体着丝粒附近,该位点具有三个基因, Sub1A、 Sub1B与Sub1C。

1.2 Sub1位点的基因结构和相关基因淹没的诱导表达

Sub1基因在耐淹籼稻(IR40931-26)与不耐淹粳稻 (Nipponbare)的结构

在淹没十天和恢复三天的过程中对两个亲本基因 转录本进行半定量RT-PCR分析

1.3 Sub1A-1在转基因水稻中淹没诱导下的表达情况

株高的比较

Northern blot analysis,淹没恢复10天后检测

1.4 通过分子辅助选择将Sub1A-1导入到不耐淹的 水稻品种中

将生长14天的苗完全淹没14天,解除淹没后14天的照片

1.5 小结
? 通过QTL和Mapping克隆了水稻耐淹基因Sub1A-1,位于9号染色体; ? 该基因编码一类ERF蛋白,在淹没诱导下表达,基因功能缺失突变体 在淹水情况下通过调节SLR1、SLRL1的表达进而抑制植株生长; ? 是一类逆境适应基因,对水稻功能基因组学研究与分子育种意义重大。

2. SNORKEL1 与 SNORKEL2

2.1 深水稻
? 分布——主要在东南亚、孟加拉国、印度等国,中国暂时没大面积有 种植深水稻的报道 ; ? 生存条件——深水稻一般生长在1~6m深的水中,通常不会超过8m, 最浅的约为50cm,深水稻的茎可长达5~6m,主要条件取决于水位、 光照和土壤三大因素; ? 特征特性——具有强烈的光敏感,在一定的水深和光照条件下开花, 种子容易脱落,种子在光照和水深适宜的条件下发芽,其休眠期可长 达数周; ? 产量——平均产量为300~ 400斤/亩左右。

2.2 SNORKEL1 与 SNORKEL2的定位
? C9285一个典型的深水稻品种; ? 在T65与C9285杂交的后代检测到3个QTL,分别位于1、3与12号染色 体,其中位于12号染色体的效应最大; ? 发展一个以T65为背景的带有C9285的12号染色片段的近等基因系,以 此克隆到了SNORKEL1 与 SNORKEL2。

2.3 SNORKEL1 、SNORKEL2的克隆及表达

深水反应(b与c为十叶期的水稻浸没两周后)

d.SK1、SK2的基因结构; e.AP2/ERF;f.SK1、SK2基因的表达; g.SK1、 SK2器官的特异表达;h.SK基因的过表达实验。

2.4 SNORKEL1 、SNORKEL2的分子特性

a. SK1、SK2在洋葱表皮细胞的亚细胞定位 b. 酵母中的转录活性分析?

c.植物激素对SK基因表达的影响; d.凝胶迁移滞后实验; e.乙烯在深水稻中促进节间伸长 (非深水条件); f.有乙烯抑制剂的时节间的伸长; g.深水条件下乙烯含量的测定。

2.4 赤霉素对深水反应的效应与分子机制

a.深水条件下C9285中GA1的含量; b. GA在C9285中的应答反应。

2.5 SK基因的分布及其QTL加性效应

a.不同品系的深水反应;b.不同栽培稻与野生稻中的SK基因结构; c.近等基因系中深水反应与加性效应。

水稻育种中的QTL加性效应

2.6小结
? 通过QTL、Positional cloning和获得功能分析克隆到了适应深水环境 (避淹)基因SNORKEL1 与 SNORKEL2,位于12号染色体; ? 乙烯信号因子,该基因主要在茎杆和叶片中表达,突变体在淹水情况 下诱导表达,通过抑制ABA的合成增加GA的量而促进植株的伸长生 长; ? 为水稻适应逆境生理机制提供新的理论依据,对水稻功能基因组学研 究和分子育种意义巨大。

水稻中乙烯与植株耐淹作用机制


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