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组培设备与条件概述


组培设备与条件
开展植物组织培养工作需要一个比较合理实用的场所, 一套适宜的设备和提供必要的实验环 境条件,这是首先要考虑到的。根据科学、合理的原则,一个较为理想的配置应该包括: 1、化学药品室 2、配培养基室 3、灭菌室 4、接种室 5、无菌培养室 基本仪器设备与用品 1、仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅(手提式、立式或卧式) 、小推车(可选) 、精密电子天平(至少千

分之一) 、电子天平或托盘天平、酸度计、普通冰箱、烘箱、解剖镜、光照培养箱(选购) 、 电炉、微量可调移液器及配套吸嘴、移液管架、磁力搅拌器(可选) 、不锈钢托盘、灌装机 (可选) 、培养架、定时器(控制光照时间) 、紫外线杀菌灯、照度计(可选) 、温湿度计(可 选)蒸馏水器、摇床(可选) 、针头滤器及配套滤膜 2、小型用品 枪镊,弯剪、解剖刀、接种盘 3、玻璃器皿 组培瓶(玻璃或塑料) 、烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、移液管架、容量瓶、试管、酒精、 玻璃棒、滴瓶 4、组培药品 (详细药品请见常用配方) 5、其他 吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、卫生药棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸、 洗瓶 培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件,培养基组成、 PH 值、渗透压等 各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。 一、温度(temperature) 因为温度是植物组织培养中的重要因素, 所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化 才能表现良好,大多数植物组织培养都是在 23~27 ℃之间进行,一般采用 25±2℃。低于 15℃时培养,植物组织会表现生长停止,高于 35℃时对植物生长不利。但是,不同植物培 养的适温不同。白鹤非的最适温度是 20℃、月季是 25~27℃、番茄是 28℃。温度不仅影响 植物组织培养育苗的生长速度, 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。 如烟草芽的形 成以 28℃为最好,在 12℃以下,33℃以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同,百合鳞片在 30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度 和百分率比在 25%以下的高。桃胚在 2~5℃条件进行一定时间的低温处理,有利于提高胚 培养成活率。用 35℃处理草莓的茎尖分生组织 3~5d,可得到无病毒苗。 二、光照(light) 组织培养中光照也是重要的条件之一,主要表现在光强、光质、以及光照时间方面: 1、光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响, 从目前的研究情况看, 光照强度 对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说,光照强度较强,幼苗生长的粗壮, 而光照强度较弱幼苗容易徒长。

2、光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导, 培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在 红光下培养,8 周后,分化出愈伤组织。但在蓝光下培养,几周后才出现愈伤组织,而唐菖 蒲子球块接种 15 天后,在蓝光下培养首先出现芽,形成的幼苗生长旺盛,而白光下幼苗纤 细。 3、光周期(light period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养, 最常用的周期是 16h 的光照, 8h 的黑暗。研究表明,对短日照敏感的品种的器官组织,在短日照下易分化,而在长日照下产 生愈伤组织,有时需要暗培养,尤其是一些植物的愈伤组织在暗培养下比在光下更好。如红 花、乌饭树的愈伤组织。 三、湿度(humidity) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件, 容器内主要受培养基水分含量和封口 材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量,否则,将使培养基 干硬,以致不利于外植体接触或插进培养基,导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度 情况,但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻,也会导致植物生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发,一般要求 70%-80%的相对湿度,常用加湿 器或经常洒水的方法来调节湿度。 湿度过低会使培养基丧失大量水分, 导致培养基各种成分 浓度的改变和渗透压的升高, 进而影响组织培养的正常进行。 湿度过高时, 易引起棉塞长霉, 造成污染。 四、渗透压(penetrating pressure) 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物,因此,而影响到渗透压的变化。通常 1-2 个大气压对植物生长有促进作用,2 个大气压以上就对植物生长有阻碍作用,而 5-6 个大气 压植物生长就会完全停止,6 个大气压植物细胞就不能生存。 五、PH 值 不同的植物对培养基最适 PH 值的要求也是不同的(见表) ,大多在 5-6.5 左右,一般培 养基皆要求 5.8,这基本能适应大多数植物培养的需要。 不同植物的最适 PH 值 种类 最适 PH 值 种类 最适 PH 值 杜鹃 4.0 月季 5.8 越橘 4.5 胡萝卜、石刁柏 6.0 蚕豆 5.5 桃 7.0 番茄、葡萄 5.7 PH 值适度因材料而异,也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源 就不一样,后者较高一些。一般来说 PH 值高于 6.5 时,培养基全变硬;低于 5 时,琼脂不 能很好地凝固。因为高温灭菌会降低 PH 值(约 0.2-0.3 个 PH 值)因此在配制时常提高 PH 值 0.2-0.3 单位。PH 值大小调节可用 0.1M 的 NaOH 和 0.1M 的 HCl 来调整。1ml 的 NaOH 可使 PH 值升高 0.2 单位, 的 HCl 可使 PH 值降低 0.2 单位。 1ml 调节时一定要充分搅拌均匀。 六、气体(gas) 氧气是组织培养中必需的因素,瓶盖封闭时要考虑通气问题,可用附有滤气膜的封口材料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口,但棉塞易使培养基干燥,夏季易引起污染。固体培养基可加进 活性炭来增加通气度,以利于发根。培养室要经常换气,改善室内的通气状况。液体振荡培 养时,要考虑振荡的次数、振幅等,同时要考虑容器的类型、培养基等。

培养基的成分 培养基是植物组织培养中的“血液”,血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与 分化,因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自 身能进行光合作用, 并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分, 加上土壤中含有较 全面的无机和有机营养成分, 所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥 (复合成分) , 植物就可良好的生长。但是,在进行植物组织培养时,只是切取植物体的一小部分,它们无 法合成生长发育所需要的全部物质, 加上人们对植物体的各种组织和器官所需营养成分了解 甚少, 因此对培养基的组成成分的探索走过了一条十分艰苦而漫长的道路, 至今人们还不能 完全达到自主的阶段。 在所报道的培养基中, 没有任何一种培养基能够适合所有类型的植物 组织和器官, 也没有实现对所有的植物都能通过组织培养使其再生的目的。 由于植物的多样 性和生长环境的复杂性与多变性,也不可能有一种万能的培养基。目前所使用的培养基有 10 余种之多,大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如,White 培养基是 Uspenski 和 Uspenskaia(1925)的藻类培养基演化的结果,被广泛用于根的培养; Cautheret 培养基是建立在 Knop 营养液(1865)基础上的。以后的培养基大部分是在 White 和 Cautheret 培养基的基础上改进而成。 就目前所使用的各种培养基而言,可将它们的成分划分为几大类, 1、 水 水是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动 过程中不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水, 以保持母液及培养基成分的精确性, 防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水,以防成 分的变化引起不良效果。 2、 无机营养成分(包括大量元素,微量元素和铁盐) 3、有机营养成分(包括维生素,氨基酸及其微生物等) 4、碳水化合物 5、植物生长调节物质(常称为激素) 6、 琼脂或其他支持物 7、 其他添加剂 (含天然提取物、抗生素等) ·维生素 B1(盐酸硫胺素) ·维生素 B2(核黄素) ·维生素 B6(吡多辛) ·维生素 C(抗坏血酸) ·维生素 E(生育酚) ·维生素 A(维生素甲、视黄醇) ·维生素 AD(鱼肝;由丸) ·阿发骨化醇 ·芦丁 (维生素 P)芦丁(维生素 P) 维生素 B6,盐酸吡哆醇 用途: 主要用于防治皮肤粗糙、粉刺、日光晒伤、止痒。也 适用于防治脂溢性脱发、皮肤炎症、一般性痤疮,脂溢性湿疹和落屑性皮肤等化妆品制剂。 可制成膏霜、乳液和醇溶液。一般与其他维生素配合使用。 技术指标: 中文名称: 维生素 B6, 盐酸吡哆醇 英文名称: Vitamin B6, Pyridoxin 化 学名称: 6—甲基—5—羟基—3,4—吡啶二甲醇盐酸盐 质量指标:熔 点:205~209℃ 鉴 别:本品的红外吸收图谱应与对照的图谱一致。酸 度:PH 值应为 2.4—3.0 产品说 明: 性 状: 白色或类白色的结晶或结晶性粉末;无臭,味酸苦;遇光渐变质。在水中 易溶,在乙醇中微溶,在氯仿或乙醚中不溶。水溶液呈微酸性反应。吡哆醇是醇式维生素

B6,是较稳定的一种结构,在酸性或碱性溶液中可耐热 維生素 B1(鹽酸硫胺素) 作 用 主要用於防治缺乏維生素 B1 所致的腳氣病。也用於神經 炎、心肌炎、消化不良輔助治療。甲狀腺機能亢進患者,妊娠或高熱患者,可適當補充維生 素 B1,以改善症狀。 罗纳普朗克动物营养公司的盐酸硫胺素(维生素 B1)是盐酸铵素粉 状产品,符合美国药典标准。组成: 化学式 C12H17C1N4OL HCI 维生素 B4 Vitamin B4(腺嘌呤,氨基嘌呤,Adenine phosphate) 【性状】常用其磷酸盐, 为白色针状结晶或结晶性粉末。易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚或氯仿。其饱和水溶液 呈中性。 【药理及应用】本品是核酸的组成成分,在体内参与 RNA 和 DNA 合成。当白细胞 缺乏时,它能促进白细胞增生,一般用药 2~4 周左右,白细胞数目可增加。用于各种原因 如放射治疗、苯中毒、抗肿瘤药和抗甲状腺药等引起的白细胞减少症,也用于急性粒细胞减 少症。 叶酸(维生素 BC,维生素 M)水溶性;维生素 B 族中的一种,亦称为维生素 BC 或维生素 M; 计量单位是微克(mcg) 是制造红血球不可缺少的物质; 帮助蛋白质的代谢。 ; -生物素(d-biotin, 1)又名维生素 H,属水溶性维生素 B 族。 d-生物素是转化酶的辅酶 R, 也是蛋白质和脂肪中间代谢中的一个重要辅酶,在维持人和动物正常生长发育,保护皮肤, 羽毛和骨髓健康起着必不可少的作用。 因而为医疗, 多维制剂和饲料行业等方面得以广泛应 用。 生物素的补充物为右旋生物素( D-生物素)制剂,纯品一般含 D-生物素 98%以上,是一 种近白色结晶性粉末,在冷水中溶解度低,随水温升高其溶解度增加,但高温时稳定性受到 影响,配制生物素溶液时,最适温度为 50℃左右。生物素是稳定性较好的一种维生素,对 氧化、还原、微量元素都很稳定,强酸、强碱、紫外线对生物素稍有影响,生物素对热敏感。 D-生物素(维生素 H) 化学名称: D-Biotin(VITAMIN H) 标准: USP24/BP98 规格:医药级(≥ 99.0%)饲料级(≥2%) 二四滴( 2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-D) 一种人工合成的具有与生长素类似生 理效应的有机物。化学名称为 2,4-二氯苯氧乙酸,合成过程简单,可以大量生产,在农业 及园艺生产上已广泛应用。 低浓度具有促进插枝生根, 阻止器官脱落, 形成无子果实等作用, 如 10~15ppm(1ppm=10-6)溶液蘸花或喷洒花簇,即可得到无子果实;高浓度可杀死双子 叶植物,作为单子叶植物小麦、玉米、高梁等田间的除草剂。 吲哚丁酸 (IBA)和一种植物细胞分裂素: 6—苄基腺嘌吟(6—BA) D-生物素/VH 叶酸 /VBc 萘乙酸简称NNA,是一种植物生长调节剂,近年来在果树生产上应用十分广泛 . 培养基的种类 培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养 基。 培养基的产生最早是 Sacks(1680)和 Knop(1681) ,他们对绿色植物的成分进行了分 析研究,根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计出了由无机盐组成的 Sacks 和 Knop 溶液, 至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。 以后根据不同目的进行改良产生了 多种培养基,White 培养基在 40 年代用得较多,现在还常用。而到 60 和 70 年代则大多采 用 MS 等高浓度培养基,可以保证培养材料对营养的需要,并能生长快、分化快,且由于浓 度高,在配制、消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡。

培养基的名称,一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名,如 White 培养基, Murashige 和 Skoog 培养基(简称 MS 培养基) ,也有对某些成分进行改良称作改良培养基。 目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下: (1) 培养基 它是 1962 年由 Murashige 和 Skoog 为培养烟草细胞而设计的。 MS 特点 是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适,可满足植物 的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官、花药、细 胞和原生质体培养,效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 (2)B5 培养基 是 1968 年由 Gamborg 等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是 含有较低的铵,这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在 B5 培养基 上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物。 (3)White 培养基 是 1943 年由 White 为培养番茄根尖而设计的。1963 年又作了改 良,称作 White 改良培养基,提高了 MgSO 4 的浓度和增加了鹏素。其特点是无机盐数量 较低,适于生根培养。 (4) 培养基 是 1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 N6 其特点 是成分较简单,KNO 3 和(NH 4 )2SO 4 含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其 他植物的花药培养和其他组织培养。 (5)KM-80 培养基 它是 1974 年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复 杂,它包括了所有的单糖和维生素,广泛用于原生质融合的培养。 培养基的选择 1、选择合适的培养基 选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。 选择合适的培养基主要从以下两个方面 考虑:一是基本培养基;二是各种激素的浓度及相对比例。MS 培养基适合于大多数双子叶 植物,B5 和 N6 培养基适合与许多单子叶植物,特别是 N6 培养基对禾本科植物小麦、水稻 等很有效,White 培养基适合于根的培养。首先试用这些培养基进行初步实验,可以少走弯 路,大大;减少时间、人力和物力的消耗。当通过一系列初试之后,可再根据实际情况对其 中的某些成分做小范围调整。在进行调整时,以下情况可供参考。一是当用一种化合物作为 氮源时,硝酸盐的作用比铵盐好,但单独使用硝酸盐会使培养基的 PH 向碱性方向漂移,若 同时加入硝酸盐和少量铵盐,会使这种漂移得到克服。二是当某些元素供应不足时,培养的 植物会表现出一些症状,可根据症状加以调整,如氮不足时,培养的组织常表现出花色苷的 颜色(红、紫红色) ,愈伤组织内部很难看到导管分子的分化;当氮、钾或磷不足时,细胞 会明显过度生长, 形成一些十分蓬松, 甚至呈透明状的愈伤组织; 铁、 硫缺少时组织会失绿, 细胞分裂停滞,愈伤组织出现褐色衰老症状;缺硼时细胞分裂趋势缓慢,过度伸长;缺少锰 或钼时细胞生长受到影响。培养基外源激素的作用也会使培养物出现上述一些类似的情况, 所以应仔细分析,不可轻易下结论。 2、激素浓度和相对比例的确定 组织培养中对培养物影响最大的是外源激素,在基本培养基确定之后,实验中要大量进 行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。 在实验中, 首先 应参考已有的报道,看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或失败的试验,如果 有则可直接作为参考;如果没有,则在建立激素配比中,将每一种拟使用的激素选择 3-5 个 水平,再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。 这样就设计出了 16 种激素配比的实验方案,即 16 种不同的培养基。用着 16 种培养基进行 初试之后, 你会找到 1 种或几种是比较好的。 再在这些比较好的组合的基础上进行小范围的 调整,设计出一组新的配方。如在表一中,您认为 6 号培养基较有希望,就可以在此基础上 做出如表二的一组新的设计。

表一 两种激素 4 种浓度的组合试验 浓度为 mg ? L -1 细胞分裂素 0.51.5 3 4.5 生 长 素 0 123 4 0.5 56 7 8 1.0 9 101112 2.013 141516 有 16 种不同的培养基 表二 第二次激素配比实验 浓度为 mg ? L -1 细胞分裂素 1.01.25 1.50 1.75 生 长 素 0.251 234 0.55 678 0.75 9101112 有 16 种不同的培养基 一般来说,经过这次实验就可能选出一种适合于你的实验材料的培养基,或许不是最好的, 但结果是可靠的。在此基础上可进行培养基中其他成分的变动实验,如可变动蔗糖浓度、琼 脂用量、培养基的 PH 或添加某些氨基酸等。但必须掌握一个原则,就是要有理有据,特别 是对一些宝贵的植物培养材料,更要慎之有慎。 如果上述试验失败,那就要做一些更细致、更麻烦的实验,花费更多的时间、人力和物 力,而且最好在专业人员的指导下进行,切莫根据想象来随意设计培养基,这样成功的概率 极小,使宝贵的植物材料丢失,或失去时机。 培养基的配制 配制培养基有两种方法可以选择,一是购买培养基中所有化学药品,按照需要自己配制;二 是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂,如 MS、B5 等。 自己配制可以节约费用,但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题,给实验带 来麻烦。就目前国内的情况看,大部分还是自己配制。为了方便起见,现以 MS 培养基为例 介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 (1)配制 MS 大量元素母液 一般将大量元素分别配制成 100 倍的母液,使用时再分别稀释 100 倍。 分别称取 NH 4 NO 3 165g KH 2 PO4 17g KNO 3 190g CaCl 2 ·2H 2 O 44g MgSO 4 ·7H 2 O 37g 各自配成 1L 的母液。倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 (2)配制 MS 微量元素母液

一般将微量元素配制成 100 倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 0.025g H 3 BO 3 0.62g CuSO 4 ·5H 2 O 0.0025g MnSO 4 ·H 2 O 1.69g CoCl 2 ·6H 2 O 0.0025g ZnSO 4 ·7H 2 O 0.86g 配成 1L 母液,倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 CuSO 4 ·5H 2 O 和 CoCl 2 ·6H 2 O 由于称取量很小, 如果天平精确度没有达到万分之一,可 先配成调整液。 分别称取 CuSO 4 ·5H 2 O 0.05g CoCl 2 ·6H2O 0.05g 各自配成 100ml 的调整液,然后取 5ml 就还有 0.0025g 的量。 (3)配制 MS 有机母液 一般配制成 100 倍 MS 有机母液。 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素(VB1) 0.01g 烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇(VB6) 0.05g 配成 1L 母液,倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 (4)配制 MS 铁盐母液 一般配制成 100 倍 MS 铁盐母液。 依次称取 EDTA 二钠 3.73g FeSO4·7H2O 2.78g 配成 1L 母液,倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 所以 MS 母液有 5 种大量元素母液, 加上 MS 微量元素母液、 有机母液和 MS 铁盐母液, MS 共 8 种母液。 激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制,不能混合在一起,生长素类一般要先用少量 95%的 酒精或 1 当量的 NaOH 溶解,细胞分裂素一般要先用 1 当量的盐酸溶解,然后再加蒸馏水 定容。一般取 100mg 配成 100ml 母液。 2、配制培养基 以配置 1L MS 培养基为例,按顺序进行如下操作: (1)先在烧杯中放入一些蒸馏水。 (2)分别取上面八种母液 10ml 倒入。 (3)一般称取 30g 蔗糖倒入,搅拌溶解。 (4)加蒸馏水用量筒定溶至 1L。 (5)按设计好的方案添加各种激素,由于激素的用量很小,而且激素对组培植物的生长至 关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,减少误差。 (6)用精密试纸或酸度计调整 PH 至 5.7-5.8。 (有条件的话使用酸度计,比较精确) 可配 1 当量的 HCL 和 1 当量的 NaOH 用来调溶液 PH 值。 1 当量 HCL 配制:用量筒量取 8.3ml 配成 100ml 溶液。 1 当量 NaOH 配制:称取 NaOH 4g 配成 100ml 溶液。 (7)称取 5g 左右琼脂粉(质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在电炉上加热至

沸腾,直到琼脂粉熔化。 (8)稍微冷却后,分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口,用橡皮 筋或绳子扎紧。 (9)放入消毒灭菌锅灭菌,灭菌 20 分钟左右。 (10)灭菌后从灭菌锅中取出培养基,平放在实验台上令其冷却凝固。 有机营养成分 有机营养成分包括维生素、氨基酸或某些有机混合物。维生素在某些酶系统中有催化作用, 加速酶功能的发挥。硫氨素(维生素 B1)可能是几乎所有植物都需要的一种维生素,缺少 维生素 B1 时离体培养的根就不能生长或生长十分缓慢。维生素 B1 常常以盐酸盐的形式即 盐酸硫胺素加入培养基中。盐酸吡哆醇(维生素 B6)和烟酸可能有刺激生长的作用。在细 胞分裂素浓度低于 0.1mg/L 的情况下特别需要添加维生素 B1,在细胞分裂素浓度高于 0.1mg/L 时,烟草细胞在没有维生素 B1 的培养基上亦可缓慢生长,这表明细胞分裂素可能 有诱导植物合成维生素 B1 的作用。除维生素 B1、维生素 B6 之外,在部分培养基中还添加 维生素 BX(氨酰苯甲酸) 、维生素 C (抗坏血酸) 维生素 E(生育酚) 维生素 H(生物素) 、 、 、 维生素 B12(氰钴胺酸) 、维生素 BC(叶酸) 、维生素 B2(核黄素) 、泛酸钙和氯化胆碱等 维生素。除叶酸外各种维生素都溶于水,叶酸需要先用少量稀氨水溶解,再加蒸馏水定容。 甘氨酸(氨基乙酸)和肌醇(环己六醇)也是一些培养基的添加成分。另外,在某些植物或 某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红 柿汁和酵母浸出物等。 这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用, 如肌醇主要 以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由 Ca 介导的信号转导。 无机营养成分 无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、 无机盐或无机元素。 它们在植物生活中具有非常 重要的作用,如氮( N) 、硫(S) 、磷(P)是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即 酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不 可缺少的关系。氮占蛋白质含量的 16%-18%,在植物生命活动中占有首要的地位,故又称 为生命元素。磷是能量货币腺苷三磷酸(ATP)的主要成分之一,与全部生命活动紧密相连, 在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等过程中不可缺少。钾对于参与活体内各种重要反应的酶起着 活化剂的作用,钾供应充分时糖类合成加强,纤维素和木质素含量提高,茎秆坚韧,植株健 壮。胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫,这些氨基酸几乎是所有蛋白质的构成 分子。镁离子(Mg 2+ )是叶绿素分子结构的一部分,缺少镁,叶绿素就不能形成,叶子 就会失绿,就不能进行光合作用。镁也是染色体的组成成分,在细胞分裂过程中起作用。钙 是细胞壁的组分之一,果胶酸钙是植物细胞胞间层的主要成分,缺钙时细胞分裂受到影响, 细胞壁形成受阻,严重时幼芽、幼根会溃烂坏死。现代生物学研究还证明钙是植物体内的信 号分子(信使)之一,在植物信号转导中发挥重要作用,钙离子与钙调蛋白结合形成的 Ca2+·CaM 复合体,能活化各种酶,调节植物对外界环境的反应与应答过程。 根据植物对这些元素要量的不同或者根据目前植物培养基中添加的这些元素量的大 小,可将它们分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培养基中的浓度大于 0.5mmol/L 的元素,微量元素指小于 0.5mmol/L 的元素。 1、大量元素 主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种。其中,氮常以硝态氮(NO 3- )或氨态氮(NH 4+ ) ,或两者相互配合的形式存在。缺氮时某些植物的愈伤组织会出现一种很引人注目的 花色素苷的颜色,愈伤组织内部不能形成导管。镁常 MgSO 4 ·7H 2 O 的形式,既提供了镁 也提供了硫。硫还有用 Na2SO4 的形式提供,不过其中的钠(Na)对植物并不是必需的, 或者说常常是不利的。磷常以 NaH 2 PO 4 ·H 2 O,KH 2 PO 4 或(NH 4 )H 2 PO 4 的形式

提供。钾常以 KCl、KNO 3 或 KH 2 PO 4 形式。钙常以 CaCl 2 ·2H 2 O、Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O 或其无水形式提供。 缺硫时培养的植物组织会明显的退绿; 缺磷或钾时细胞会过度生长, 愈伤组织表现出极其蓬松状态。 (1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分,是生 命不可缺少的物质。在制备培养基时以硝态氮(NO 3- )或氨态氮(NH 4+ )两种形式供 应。大多数培养基既含有硝态氮(NO 3- )又含有氨态氮(NH 4+ ) 。氨态氮(NH 4+ )对 植物生长较为有利。供应的物质有 KNO 3 、NH 4 NO 3 等。有时,也添加氨基酸来补充氮 素。 (2) P 是磷脂的主要成分。 而磷脂又是原生质、 细胞核的重要组成部分。 磷也是 ATP、 ADP 等的组成成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅增加养分、提供能 量,而且也促进对 N 的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有 KH 2 PO 4 或 NaH 2 PO 4 等。 (3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K 增加时,蛋白质 合成增加, 维管束、 纤维组织发达, 对胚的分化有促进作用。 但浓度不易过大, 一般为 1-3mg/L 为好。制备培养基时,常以 KCl、KNO3 等盐类提供。 (4)Mg、S 和 Ca、Mg 是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S 是含 S 氨基酸 和蛋白质的组成成分。它们常以 MgSO 4 .7H 2 O 提供。用量为 1-3mg/L 较为适宜;Ca 是构 成细胞壁的一种成分,Ca 对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用,常以 CaCl 2 .2H 2 9 提供。 2、微量元素 培养基的微量元素主要包括铁(Fe) 、锰(Mn) 、铜(Cu) 、锌(Zn) 、氯(Cl) 、硼(B) 和钼(Mo)等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用,有的对蛋白质或酶的生物 活性十分重要,有的是参与某些生物过程的调节。Fe 有两个重要功能,作为酶的重要组成 成分和合成叶绿素所必需,缺铁时细胞分裂停止。Mn 对糖酵解中的某些酶有活化作用,是 三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B 能促进糖的过膜运输,影响植物的有性生殖 如花器官的发育和受精作用。B 还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用,改善某些植物 组织的培养状况,缺硼时细胞分裂停滞,愈伤表现出老化现象。Zn 是吲哚乙酸生物合成必 需的,也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。Cu 是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等 氧化酶的成分,可影响氧化还原过程。Mo 是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。Cl 在光合 作用的水光解过程中起活化剂的作用,促进氧的释放和还原 NADP(辅酶 II) 。为了某些植 物组织培养的特殊需要有人还把钠(Na) 、镍(Ni) 、钴(Co) 、碘(I)等也加入微量元素 的行列。Na 对某些盐生植物、C4 植物和景天酸代谢植物是必需的。Ni 对尿酸酶(urease) 的结构和功能是必需的。 但是有些成分的作用至今还不十分清楚, 可人们仍然把它们加入培 养基中,如碘(I)和钴(Co)等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组 成成分。同时,它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗 转绿有促进作用。铁作为一种微量元素,对植物也是必需的,但由于 Fe 的特殊性质,即很 不稳定、易沉淀,需要在酸性条件下才能比较稳定,故在培养基配制时常常把 Fe 盐单独配 制,且常以螯合物的形式,把 FeSO 4 和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠(Na 2 EDTA)先分别 配成溶液,再相互混合使形成螯合铁,以防沉淀和帮助被植物吸收。但 EDTA 可能对某些 酶系统和培养物的形成发生有一定的作用,使用时应慎重。 为了使用方便, 无论是大量元素还是微量元素都常常是先配制成母液 (即比实际培养 基中的使用浓度高的储存液) ,储存在 4 度冰箱内或在室温下短期存放。 总之,植物必需营养元素可组成结构物质,也可是具有生理活性的物质,如酶、辅酶以 及作为酶的活化剂,参与活跃的新陈代谢。此外,在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平

衡等电化学方面起着重要作用。 当某些营养元素供应不足时, 愈伤组织表现出一定的缺素症 状。如缺氮,会表现出一种花色素苷的颜色,不能形成导管;缺铁,细胞停止分裂;缺硫, 表现出非常明显的褪绿;却锰或钼,则影响细胞的伸长。 碳水化合物 所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源, 但当培养物通过光合作用提供 的 CO2 能足以维持生长时可不在培养基上加碳源,这种情况是很少见的。用作碳源的碳水 化合物通常为蔗糖或 D-葡萄糖,用量通常为 2%-4%,高者可达 5%,亦可用市售的白糖所 代替,但一般应增加用量,而且最好用比较固定的厂家生产的产品,以保证实验的稳定性。 在改用一批新的市售白糖时最好先做预试,以防在大量使用时出现问题,伤害培养材料,造 成不必要的损失,因为市售白糖是一种混合物,成分复杂且不稳定。几乎所有的培养物在蔗 糖作为碳源时生长都比较好, 只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长 更合适。也有用麦芽糖、半乳糖、 甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源的。 蔗糖在经高温灭菌后, 会发生部分降解,产生 D-葡萄糖和 D-果糖等,与用过滤法灭菌相比,可能会出现一些不同 的实验结果,但这并不说明高温灭菌与过滤灭菌哪一种方式更好。如果要进行比较严格、精 确的实验, 最好用过滤法灭菌蔗糖, 除此之外在大部分情况下可与培养基一起进行高温灭菌。 研究表明蔗糖不仅作为碳源影响到培养物的营养状况, 而且在某些情况下还会影响到细胞的 分化,如在进行叶用莴苣的髓细胞培养时,诱导木质部分化的适宜浓度为 2g/L,但要让木 质部进一步发育则最好再提高蔗糖浓度, 这样才能更有利于木质部的形成。 木质部成分的分 化,特别是管胞分子的分化形成,往往是器官发生的先决条件。 蔗糖、葡萄糖、白糖等的纯度问题,现在也引起人们的注意,因为在结晶时,它们往往 包藏有恒量的有机物如氨基酸等, 这些虽然不会使实验受到很大影响, 但有时可能影响到实 验结果的分析,在使用时应稍加留神。 糖的种类和用量是植物组织培养能否成功的重要因素之一。 蔗糖的作用具有普遍性和广 泛性,这一点已无人怀疑。近年来,其它糖类在植物组织培养中的作用引起很大关注。在淀 粉作为凝固剂的培养基中加入 12%蜜二糖,比只加 8%蔗糖的大麦花粉培养基产生胚状体的 频率高 35 倍,可高达 40%。乳糖、麦芽糖、半乳糖和甘油均可显著促进培养的柑橘的胚状 体发生。麦芽糖、麦芽浸出物和果糖对苜蓿胚状体发生的促进作用均大于蔗糖。葡萄糖、果 糖、甘露糖、核糖和蔗糖对培养的烟草原生质体再生都有促进作用,半乳糖则有抑制作用。 麦芽糖可明显提高培养的大麦花药的绿苗产率, 而蔗糖、 果糖和葡萄糖单独或麦芽糖混合使 用,均不利胚状体的生长。 植物生长调节剂 植物生长调节物质是一些调节植物生长发育的物质。植物生长物质可分为两类:一类是植 物激素;另一类是植物生长调节剂。植物激素是指自然状态下植物体内合成,并从产生处运 送到别处,对生长发育产生显著作用的微量(1 微摩尔/升以下)有机物;植物生长调节剂是 指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。 但在平常工作中人们并没有将它们严格区分开 来,而笼统称之为“激素”、“植物激素”或“植物生长调节物质”。这类物质既可以刺激植物生 长,也可以抑制植物的生长,对植物的生命活动真正起到调节作用。在植物组织培养中使用 的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类,少数培养基中还添加赤霉素 GA3 等。 1、生长素 生长素在植物体中的合成部位是叶原基、嫩叶和发育中的种子。成熟叶片和根尖也产生 很微量的生长素。在植物组织培养中,生长素主要被用做诱导刺激细胞分裂和根的分化。在 植物组织培养中常用的生长素有:NAA(萘乙酸) 、IAA(吲哚乙酸) 、IBA(吲哚丁酸) 、 NOA(萘氧乙酸) ,P-CPA(对氯苯氧乙酸) 、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸) ,2,4,5-T(2,

4,5-三氯苯氧乙酸)等。NAA 有 α -和 β-两种形式,是由人工合成的,培养基中总是用 α型,所以在配制培养基时总是说加 α-萘乙酸。与 IBA 相比,NAA 诱发根的能力较弱,诱发 的根少而粗, 但对某些植物如杨树等却具有很好的效果, IBA 在根的诱导与生长上作用强烈, 作用时间长,诱发的根多而长,特别有效,但也不可一概而论。IBA 是天然合成的生长素, 可被光迅速溶解或被酶所氧化, 由于培养基中可能有氧化酶存在, 所以在使用浓度上应相对 较高 (1-30mg/L) 对愈伤组织增殖最有效的是 2, 。 4-D, 特别是对单子叶植物, 10-7-10-5mol/L 即可以诱导产生愈伤,常常不需再加细胞分裂素。但 2,4-D 是一种极有效的器官发生抑制 剂,不能用于启动根和芽分化的培养基中。 2、细胞分裂素 细胞分裂素是腺嘌呤(adnine,也叫 6-氨基嘌呤的衍生物。腺嘌呤的第 6 为氨基、第 2 位 碳原子和第 9 位氮原子上的氢原子可以被不同的基团所取代, 当被取代时就会形成各种不同 的细胞分裂素,因此,确切的讲应该叫细胞分裂素类物质。植物和微生物中都含有细胞分裂 素。 细胞分裂素在植物生长发育的各个时期均可表现出它的调节作用, 由于它是一种腺嘌呤 的衍生物,所以人们联想到它的调节作用,由于它的调节作用可能对核酸的影响有关。它可 以影响某些酶的活性,可以影响植物体内的物质运输,可以调控细胞器的发生,还可以打破 某些植物种子的休眠和延缓叶片的衰老。 现代生物学研究初步证明, 细胞分裂素可以结合到 高等植物的核糖核蛋白体上,促进核糖体与 mRNA 的结合,加快翻译速度,从而促进蛋白 质的生物合成。它还可以与细胞膜和细胞核结合,影响细胞的分裂、生长与分化。在 tRNA 分子的反密码子附近发现有细胞分裂素的结合位点, 这可能预示着细胞分裂素在基因表达的 翻译水平上具有调节作用,其实,细胞分裂素本身就是 rRNA 的组成部分,植物 tRNA 中的 细胞分裂素就有异戊烯基腺苷、 反式玉米素核苷、 甲硫基异戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷 等数种。 自然情况下,细胞分裂素主要在根中合成,但根并不是唯一的合成部位,茎端、萌发中 的种子、发育中的果实和种子也能合成。 在组织培养中使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂, 诱导芽的分化、 叶片扩大和 茎长高,抑制根的生长。培养基中经常使用的天然的细胞分裂素主要有:从甜玉米未成熟种 子或其他植物中分离到的玉米素[6-(4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基)嘌呤]。人工合成的细 胞分裂素主要有激动素(KT,6-呋喃氨基嘌呤) 、6-苄基腺嘌呤(6-BA) 、2IP(异戊烯氨基 嘌呤)和 TDZ(thidiazuron,噻二唑苯基脲)等。细胞分裂素常常与生长素相互配合,用以调 节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化和器官形成。 3、赤霉素 主要是 GA3,虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究,但在培养基中很少 添加, 因为它的作用往往是负面的。 虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道, 但在使用中仍需慎重,不可轻易添加。如果想在实验中添加赤霉素,则必须先用一些不重要 的材料做预试,待获得肯定结果时再用于正式实验。 4、乙烯 乙烯的作用逐渐引起重视,它在芽的诱导和管胞分化上具有一定作用,管胞分化往往又 是器官发生的基础。乙烯单独地或与 CO2 共同加入瓶中以代替 BA 或 BA+2,4-D 的作用, 促进水稻愈伤组织芽的生长,CO2 对乙烯促芽的促进作用明显,AgNO3 可逆转乙烯和 2, 4-D 的抑制作用,促进小麦愈伤组织生芽。在有 IAA 和 KT 时乙烯促进 Wigitalis obscura 芽 的形成。 乙烯对芽形成的这种相对独立的效果不只是因为种的差异, 也与不同发育时期植物 对乙烯的敏感性不同有关。 如烟草的组织随着培养时间而对乙烯的敏感性有变化, 在培养早 期促进芽的发端,后期则起抑制作用。温度可以影响乙烯的产生量,25-35℃下产生量较高, 可促进水稻培养细胞产生根,15℃或 40℃下产生量降低,不生根。番茄叶圆片培养时,乙

烯抑制 IAA 诱导的生根。一般说来,依稀抑制体细胞胚胎发生,非胚性愈伤组织比胚性愈 伤组织产生更多的乙烯。在悬浮培养中,乙烯对细胞的指数生长期有双向作用。由于乙烯是 一种简单的不饱和碳氢化合物,在生理环境的温度和压力下,是一种气体,比空气轻,实验 中很难掌握用量,所以一般不使用。高等植物各器官都能产生乙烯,但不同组织、不同器官 和不同发育时期,乙烯的释放量不同。在组织培养中,培养的植物组织也会产生乙烯,如果 封口用的是不透气的塑料膜,容器内就会逐渐积累乙烯,严重时可引起培养物的死亡。培养 瓶内乙烯的积累量因植物种类而不同,小麦的悬浮细胞培养物 24H 中每克干重可产生乙烯 5nmol,水稻的为 6nmol,亚麻的可高达 900nmol。烟草的愈伤组织产生的乙烯量比胡萝卜的 高 400 倍。 琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外, 所有的培养物都应生长在固定或半固定的培养基上以防止培养物沉入 液体培养基,因缺氧而死亡。就目前情况而言,琼脂是一种极为理想的支持物。它是由海藻 得来的多糖类物质, 但并不是培养基中的必需成分, 只是作为一种凝固胶黏剂使培养基变成 固体或半固体状态,以支撑培养物,虽然琼脂只是作为一种胶连物,但由于其生产方式和厂 家不同而可能含有数量和种类不等的杂质,如 Ca、Mg、Fe、硫酸盐等,从而可能影响到培 养效果或某些实验的结果。在选择琼脂时,最好固定厂家,但国内尚没有一个比较稳固的生 产厂家提供优质琼脂。虽然市售的琼脂或琼脂条价格便宜,可以使用,但其带来的潜在副作 用可能是组培失败或中途夭折的主要原因。建议在经济条件允许的情况下,建议买进口、固 定厂家的商品。琼脂的使用浓度取决于培养目的,使用的琼脂性能(胨力张度、灰分、热水 中不溶物、 粗蛋白等) 等因素,一般浓度为 0.4%-1%,质量越差的琼脂用量越大。除琼脂外, 为了更好的调控培养物的生长, 现在发展的趋势是使用一种含有琼脂的混合物作为固体胶连 剂,如 Sigma 公司生产的 Agargel 就是用琼脂和 Phytagl 混合在一起的一种新型胶连剂 混合在一起的一种新型胶连剂,可 以用来控制培养物的玻璃化。 培养基中添加琼脂使培养基呈固体或半固体状态, 使培养物能够处于表面, 既能吸收必 需的养分、水分,又可不致因缺氧而死亡。但固体或半固体状态,一方面限制了培养基中营 养成分和水的移动; 另一方面也限制了培养的植物组织分泌物, 特别是有毒代谢产物的扩散, 使有培养物周围的营养成分逐渐匮乏,代谢产物逐渐积累,植物生长受阻或受到毒害。为了 解决这个问题,人们试验使用其他支持物来代替琼脂。滤纸桥法即是一种,该法是将一张较 厚的滤纸折叠成 M 型,放入液体培养基中,将培养的植物组织放在 M 的中间凹陷处,这样 培养物可通过滤纸的虹吸作用不断吸收营养和水分,又可保持有足够的氧气。在此基础上, 又发展出了一种类似与“看护”培养的方法,即在滤纸桥的中间凹陷处加一种固体培养基,固 体培养基中也可混有分散的植物细胞团, 将材料放在固体培养基上, 再把滤纸放入另一种液 体培养基中,用两种不同的培养基同时培养材料,可收到较好的效果。现在也有用玻璃纤维 滤器或人工合成的聚酯羊毛代替琼脂的试验中人们或许能受到一些启发, 即培养基中添加琼 脂的目的主要是为了支持培养物, 只要达到这个目的, 可选用不同的材料和方法进行代替琼 脂的试验。需要考虑的主要问题是,这种材料必须无毒害作用,且不被培养的植物组织所吸 收,不与培养液成分发生化学反应。 琼脂作为支持物或凝固剂对绝大部分植物都是有利的或者说是无害的, 但也有一些报道 说琼脂对某些培养物不利。在马铃薯、胡萝卜、烟草、小麦等作物组培中,均发现以淀粉代 替琼脂更有利于培养物的生长和分化。但是,目前情况下还没有哪种支持物比琼脂更优越。 其他添加剂 为了特殊的培养目的,在一部分培养基中还添加了一些特殊成分,如水解酪蛋白,水解乳蛋 白,甲硫氨酸(蛋氨酸) L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、 , L-精氨酸等氨基酸,酵母提取物,胰蛋白胨,椰乳,西红柿汁,香蕉粉,橘子汁,可可汁,

活性炭,渗透调节剂等。添加少量甲硫氨酸有促进乙烯合成和刺激木质部发生的作用,但添 加多种氨基酸后往往有制止生长的作用,这可能是由于各种氨基酸之间的相互竞争而引起 的。对天然提取物的应用虽然有不同观点,有的主张使用,有的主张不使用,因为其营养成 分和作用无法弄明白,但在用已知化学物质无法达到目的时,适当使用一些天然混合物,的 确使一些用常规培养方法没有获得愈伤或不能诱导再生的植物产生了愈伤和分化形成植株。 1、活性炭 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构,它结构疏松、孔隙大,吸水力强,有很 强的吸附作用,它的颗粒大小决定着吸附能力。粒度越小,吸附能力越大。温度低吸附能力 强,温度高吸附能力弱,甚至解吸附。通常使用浓度为 0.5-10g/L。它可以吸附非极性物质 和色素等大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压 消毒时产生的 5-羟甲基糖醛及激素等。 茎尖初代培养,假如适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物,其效力优于 VC 和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和伸长,但其作用有一个 阀值,一般为 0.1%-0.25,不能超过 0.2%。 活性炭在生根时有明显的促进作用, 其机理一般认为与活性炭减弱光照有关, 可能是由 于根顶端产生促进根生长的 IAA,但 IAA 易受可见光的光氧化而破坏,因此活性炭的主要 作用就在于通过减弱光照保护了 IAA,从而间接促进了根的生长,由于根的生长加快,吸收 能力增强,反过来又促进了茎、叶的生长。 此外,在培养基中加入 0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产生玻璃苗 有良好作用。 活性炭在胚胎培养中也有一定作用, 如在葡萄胚珠培养时向培养基加入 0.1%的活性炭, 可减少组织变褐和培养基变色,产生较少的愈伤组织。 但是,活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附 100ng 左右的生长调节物 质, 这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中调节物质。 大量的活性炭加入会 削弱琼脂的凝固能力, 因此要多加一些琼脂。 很细的活性炭也易沉淀, 通常在琼脂凝固之前, 要轻轻摇动培养瓶。总之,那种随意抓一撮活性炭放入培养基,会带来不良的后果。因此, 在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。 也许是由于活性炭的存在使培养基变黑, 产生了类似于土壤的效果, 以利于植物的生长。 还有报道指出, 活性炭有刺激胚胎发生或组织生长和形态发生的作用。 活性炭来源的不同也 可能使它所起的作用不同, 如木材活性炭比骨质活性炭含有更多的碳, 而骨质活性炭中含有 的混合物可能对培养物有副作用。 2、渗透调节剂 植物细胞对水的吸收受到其所含液泡与培养基之间的相对水势所控制。 培养基中影响 水分利用的主要成分是琼脂的百分含量, 蔗糖的含量和添加的一些用于调节渗透压的非代谢 物。渗透调节剂往往是选用一些代谢微弱的糖来充当,如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇 等, 这些糖基本上不被培养的植物组织所吸收, 而只存留在培养基中, 起到调节渗透的作用。 3、抗生素 培养的植物组织,很容易发生细菌或真菌污染。引起的原因是多方面的,有的是消毒 不彻底,有的是无菌操作过程中器皿或操作人员不注意,有的是消毒不彻底,有的是无菌操 作过程中器皿或操作人员不注意,有的是培养过程中由于盖培养容器的盖子破损或没扎紧, 有的是培养的植物组织内部携带有病原物, 表面消毒不解决问题。 污染会给组培工作带来很 大影响或损失,尤其是已经培养一段时间的材料在发生;污染所造成的损失更大。为了解决 或防止这个问题,可在配置培养基时添加抗生素,比如加 200-300U 的庆大霉素可使细菌污 染受到很好的控制,浓度超过 600U 时可在一定程度上抑制分化,但这种抑制作用可在除去

庆大霉素后异端时间内得到恢复。 4、抗氧化剂 植物组织在初割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化或由酶类催化 氧化为相应的醌类,产生可见的茶色、褐色以致黑色,这就是酚污染。这些物质渗出细胞外 就造成自身中毒,使培养的材料生长停顿,失去分化能力可,最终变褐色死亡。在木本,尤 其是热带木本及少数草本植物中较为严重。 目前还没有彻底完善的办法, 只能按不同的实际 情况,加用一些药物,并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法,使之有不同 程度的缓解,当然像严格选择外植体部位,加大接种数量等也应一并考虑。 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及 VC,可用 50-200mg/L 的浓度洗涤刚切割的外植 体伤口表面, 或过滤灭菌后假入固体培养基的表层。 其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、 谷胱甘肽、 硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯。 5、椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在 10%-20%,与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在 马铃薯茎尖分生组织很草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过 1mm 时,椰乳就不发生作用。 6、香蕉 用量为 150-200ml/L。 用黄熟的小香蕉, 加入培养基后变为紫色。 PH 值的缓冲作用大。 对 主要在兰花的组织培养中应用,对发育有促进作用。 7、马铃薯 去掉皮和芽后,加水煮 30 分钟,再经过过滤,取其滤液使用。用量为 150-200g/L。对 PH 值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 8、水解酪蛋白 为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度为 100-200mg/L。受酸和酶的作用易 分解,使用时要注意。 9、其他 酵 母 提 取 物 (YE) (0.01%-0.05%) 主要 成分 为 氨 基 酸 和 维 生 素 类; 麦 芽 提 取 物 , (0.01%-0.5%) 、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定,大多 在培养困难时使用,有时有效。 培养基的配制 配制培养基有两种方法可以选择,一是购买培养基中所有化学药品,按照需要自己配制;二 是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂,如 MS、B5 等。 自己配制可以节约费用,但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题,给实验带 来麻烦。就目前国内的情况看,大部分还是自己配制。为了方便起见,现以 MS 培养基为例 介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 (1)配制 MS 大量元素母液 一般将大量元素分别配制成 100 倍的母液,使用时再分别稀释 100 倍。 分别称取 NH 4 NO 3 165g KH 2 PO4 17g KNO 3 190g CaCl 2 ·2H 2 O 44g MgSO 4 ·7H 2 O 37g 各自配成 1L 的母液。倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。

(2)配制 MS 微量元素母液 一般将微量元素配制成 100 倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 0.025g H 3 BO 3 0.62g CuSO 4 ·5H 2 O 0.0025g MnSO 4 ·H 2 O 1.69g CoCl 2 ·6H 2 O 0.0025g ZnSO 4 ·7H 2 O 0.86g 配成 1L 母液,倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 CuSO 4 ·5H 2 O 和 CoCl 2 ·6H 2 O 由于称取量很小, 如果天平精确度没有达到万分之一,可 先配成调整液。 分别称取 CuSO 4 ·5H 2 O 0.05g CoCl 2 ·6H2O 0.05g 各自配成 100ml 的调整液,然后取 5ml 就还有 0.0025g 的量。 (3)配制 MS 有机母液 一般配制成 100 倍 MS 有机母液。 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素(VB1) 0.01g 烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇(VB6) 0.05g 配成 1L 母液,倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 (4)配制 MS 铁盐母液 一般配制成 100 倍 MS 铁盐母液。 依次称取 EDTA 二钠 3.73g FeSO4·7H2O 2.78g 配成 1L 母液,倒入 1L 试剂瓶中,存放于冰箱中。 所以 MS 母液有 5 种大量元素母液, 加上 MS 微量元素母液、 有机母液和 MS 铁盐母液, MS 共 8 种母液。 激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制,不能混合在一起,生长素类一般要先用少量 95%的 酒精或 1 当量的 NaOH 溶解,细胞分裂素一般要先用 1 当量的盐酸溶解,然后再加蒸馏水 定容。一般取 100mg 配成 100ml 母液。 2、配制培养基 以配置 1L MS 培养基为例,按顺序进行如下操作: (1)先在烧杯中放入一些蒸馏水。 (2)分别取上面八种母液 10ml 倒入。 (3)一般称取 30g 蔗糖倒入,搅拌溶解。 (4)加蒸馏水用量筒定溶至 1L。 (5)按设计好的方案添加各种激素,由于激素的用量很小,而且激素对组培植物的生长至 关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,减少误差。 (6)用精密试纸或酸度计调整 PH 至 5.7-5.8。 (有条件的话使用酸度计,比较精确) 可配 1 当量的 HCL 和 1 当量的 NaOH 用来调溶液 PH 值。 1 当量 HCL 配制:用量筒量取 8.3ml 配成 100ml 溶液。 1 当量 NaOH 配制:称取 NaOH 4g 配成 100ml 溶液。

(7)称取 5g 左右琼脂粉(质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在电炉上加热至 沸腾,直到琼脂粉熔化。 (8)稍微冷却后,分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口,用橡皮 筋或绳子扎紧。 (9)放入消毒灭菌锅灭菌,灭菌 20 分钟左右。 (10)灭菌后从灭菌锅中取出培养基,平放在实验台上令其冷却凝固。 灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是: 凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。依此观点,无 菌室等未处理的地方、 超净台的表面、 简单煮沸的培养基、 我们使用的刀、 剪在未处理之前、 我们身体的整个外表及与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培 养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是:极小, 肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单, 繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理或化学的灭菌方 法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的) ,高层大气、岩石内部、健康的动、 植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从 以上可以看出:在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。 灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把 所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微 生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀 死, 即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物, 所以通过严格灭菌的操作空间 (接 种、超净台等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的 条件下进行的操作,就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的,甚至超过微生物的培养要求,这是因 为培养基含有丰富的营养,稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的,必须根据不 同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌, 才能保证培养时不受杂菌的影响, 使试管苗能正 常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧) 、湿 热(常压或高压蒸煮) 、射线处理(紫外线、超声波、微波) 、过滤、清洗和大量无菌水冲洗 等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1、培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的 24 小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其 中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在 0.1MPa 的压力下,锅内温度达 121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度 耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不 同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放 气阀,通电后,待压力上升到 0.05MPa 时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后, 再关闭放气阀。 关阀再通电后,压力表上升达到 0.1MPa 时,开始计时,维持压力 0.1-0.15MPa,20 分 钟。

按容器大小不同,保压时间有所不同,见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字, 如果容器体积较大,但是放置的数量很少,也可以减少时间。 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器的体积 /mL 在 121℃ 灭菌所需最少时间 /min 20-5015 75-15020 250-50025 100030 到达保压时间后,即可切断电源,在压力到 0.5MPa,可缓慢放出蒸汽,应注意不要使 压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开 盖,取出培养基,摆在平台上,以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养 基无法摆斜面。一旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气 压入,内外压力平衡,盖子便易打开了。 对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种工具,可以延长灭菌时间或提 高压力。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效 力降低,不能随意延长时间。 对于一些布制品,如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装 好,高压灭局 20-30 分钟。 高压灭菌前后的培养基,其 PH 值下降 0.2-.3 单位。高压后培养基 PH 值的变化方向和 幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高 PH 值至预定值的则相反。培养基中成分单一 时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的 PH 值变化幅度较大,甚至可大于 2 个 PH 值单位。环境 PH 值的变化大于 0.5 单位就有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖, 从而改变培养基的渗透压。 8%-20% 在 蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高 0.43 倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解, 可使 15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果 糖。培养基值小于 5.5,其水解量更多,培养基中添加 0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大 增强,添加 1%活性炭,蔗糖水解率可达 5%。 为防止高压灭菌产生的上诉一些变化可用下列方法: (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,以便及时采取有效措施。 (2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果 糖和山梨醇而用甘露醇,以 IBA 代替 IAA,控制活性炭的用量(在 0.1%以下)注意 PH 值 对高压灭菌下培养基中成分的影响等。 (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加 入。 (4)注意高压灭菌后培养基 PH 值的变化及回复动态。如高压灭菌后的 PH 值常由 5.8 升高至 6.48。而 96 小时后又回降至 5.8 左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时,把镊子、剪刀、解剖刀等浸入 95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯 火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用 250 或 500 毫升的广口瓶,放入 95% 的酒精,以便插入工具。 3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到 160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下,细菌 的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用 170℃持续 90 分钟来灭菌。

干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎 可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数 量不宜过多,以免防碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以 免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。 4、不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的,不能用高压灭 菌处理,通常采用过滤灭菌方法。 一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素 GA3 的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的 10%。蔗糖经高温后部分被降解成 D-葡萄糖和 D-果糖,果糖又可被部分水解,产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化 合物和氨基酸发生反应。IAA,NAA,2,4-D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。维 生素具有不同程度的热稳定性, 但如果培养基的 PH 值高于 5.5, 则维生素 B1 会被迅速降解。 泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌,不能高温灭菌,否则会失去作用。 防细菌滤膜的网孔的直径为 0.45 微米以下,当溶液通过滤液后,细菌的细胞和真菌的 孢子等因大于滤膜直径而被阻, 在需要过滤灭菌的液体量大时, 常使用抽滤装置; 液量小时, 可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注 射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。 过滤除菌操作步骤: 首先将过滤器、接液瓶用纸包好,滤膜可放在培养皿内用纸包好。 使用前先经 121℃高压蒸汽灭菌 30 分钟;在超净工作台上,将滤器装置装好,用灭菌无齿 镊子将滤膜安放在隔板上,滤膜粗糙面向上;然后将待除菌的液体注入滤器内,开动真空泵 即可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。 5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌 (1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐 射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质很核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造 成死亡。紫外线的波长为 200-300nm,其中 260nm 的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿 透能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过 1.2 米为宜。 (2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以 杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面 张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说来,温度越高,作用时间越 长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态, 如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例 外。 常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按 5-8ml/m 3 用量,将甲醛置于广口容器 中,加 5g/m 3 高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行 加热熏蒸,但效果不如甲醛。 6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂搽,喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用 75%的酒精反复涂搽灭菌,1%-2%的来苏儿溶液以及 0.25%-1%的新洁尔灭也可以。 7、植物材料表面用消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料, 都不同程度地带有各种微生物。 这些污染源一旦带入培 养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手 续接种到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(explant) 。 首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子

等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟 至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流 水冲洗在污染严重时特别有用。 洗时可加入洗衣粉清洗, 然后再用自来水冲洗洗衣粉水。 洗衣粉可除去轻度附着在植物 表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面 活性物质吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻 璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用 70%酒精浸 10-30 秒。由于酒精具有使植物 材料表面被浸湿的作用,加之 70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不 能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽 等等,以及主要取用内部的材料,则可只用 70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无 菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取 1-2 种使用见下表。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较 表 灭菌剂名称使用浓度 %消毒难易灭菌时间灭菌效果 酒精 70-75 易 0.1-3 好 氯化汞 0.1-0.2 较难 2-10 最好 漂白粉饱和溶液易 5-30 很好 次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好 次氯酸钠 2 (活性氧)易 5-30 很好 过氧化氢 10-12 最易 5-15 好 抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好 上述灭菌剂应在使用前临时配制, 氯化汞可短期内储用。 次氯酸钠和次氯酸钙都是利用 分解产生氯气来杀菌的, 故灭菌时用广口瓶加盖较好; 升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的; 过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的, 这种药剂残留的影响较小, 灭菌后用无菌水漂洗 3-4 次即可; 由于升汞液灭菌的材料, 难以对升汞残毒去除, 所以应当用无菌水漂洗 8-10 次, 每次不少于 3 分钟,以尽量去除残毒。 灭菌时,不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入消毒溶液,不时 用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快 到时间之前 1-2 分钟,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,氢净后 立即倒入无菌水,轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。记录时 间还便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液,切勿勉强 在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。 在灭菌溶液中加吐温-80 或 Triton X 效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易 于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温 的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的 0.5%,即在 100ml 加入 15 滴。 最后一步是用无菌水漂洗,漂洗要求 3 分钟左右,视采用的消毒液种类,漂洗 3-10 次 左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 灭菌原理 紫外线灭菌的原理: 紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在 220-300 纳米的紫 外线称为“杀生命区”,其中以 260 钠米的杀菌力最强。紫外线作用于细胞 DNA,使 DNA 链 上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体(如胸腺嘧啶二聚体) ,抑制了 DNA 复制。另外,空气在 紫外线照射下可以产生臭氧,臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差,适用

于空气及物体表面的灭菌,与被照物的距离以不超过 1.2 米为易,照射时间以视紫外线灯管 的功率大小、被照空间及面积大小,根据灭菌效果测定结果而定。由于紫外线对人体有伤害 作用,因此,不要在紫外线灯照射下进行操作。 氯化汞灭菌的原理: 氯化汞也称升汞,是一种剧毒的重金属盐杀菌剂,其杀菌的原理 是 Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合, 使细菌蛋白变性, 酶失活。 氯化汞使用浓度 0.1%-0.2%, 浸泡 6-12 分钟时,就可以有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢,灭菌效果极好。 但用氯化汞灭过菌的外植体材料要用无菌水反复多次洗涤(一般不少于 5 次) ,才可将残留 的药剂除净。使用氯化汞给环境造成污染,一般情况下,应尽量用其它消毒剂灭菌,而以少 用或不用氯化汞为易。 次氯酸钠灭菌的原理: 次氯酸钠又称为 “安替福民”, 活性氧含量是 0.8%,使用时稀释 3-5 倍,浸泡外植体 5-30 分钟,再用无菌水洗涤 4-5 次.它分解出具有杀菌作用的氯气,灭菌后易 于除去,不留残余,杀菌力强,对植物材料无害,是植物组织培养常使用的杀菌剂之一。 漂白粉灭菌的原理: 漂白粉为白色粉末,一般含 10%-20%(质量/体积)的次氯酸钙 [Ca(ClO)2],使用时用饱和溶液,杀菌的原理在于它分解出具有杀菌作用的氯气。氯与蛋 白质中的氨基结合, 使菌体蛋白质氧化, 代谢功能发生障碍。 注意漂白粉腐蚀金属、 棉织品, 刺激皮肤,易吸潮散失有效氯而失效,平时要密封储藏,最好现配现用,不要储藏太久。 酒精灭菌的原理: 酒精具有较强的穿透力和杀菌力,它使细菌蛋白质变性。使用的浓 度一般为 70%-75%。处理时间 15-30 秒,不宜太长,因为细胞容易收缩脱水。它具有浸润 和灭菌的双重作用,适用于表面消毒,但不能达到彻底的灭菌,必须结合其它药剂灭菌。 为了提高乙醇的杀菌效果,可在乙醇溶液中加入 0.1%的酸或碱,以改变细胞表面带电 荷的性质而增加膜透性,提高乙醇的杀菌效果。 高锰酸钾灭菌的原理: 高锰酸钾能使细菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性。 浓度稀释时起氧化作用杀死细菌,日常生活中通常用作皮肤、果蔬的表面消毒剂,在一盆清 水中加几粒高锰酸钾就可起到杀菌的作用。 接 种 接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要由空气中 的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用 1%-3%的 高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在 使用期间用 70%的酒精或 3%的来苏儿喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以 下步骤进行: (1)在接种 4 小时前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外线灯进行杀菌; (2)在接种前 20 分钟,打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯; (3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等; (4)上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处。然后搽拭工作台面; (5)先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火 尖端处,对培养皿要过火烤干; (6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; (7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外线灯灭菌 30 分钟,若连续接种,每 5 天要大强度灭菌一次。 接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块,放入培养基 的过程。现将接种前后的程序连贯地介绍。 无菌接种步骤: ( 1 )将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲

洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。 ( 2 )材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。如 叶片切成 0.5cm 平方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含 1-2 片幼叶的 茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。 ( 3 ) 用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 具体操作过程 (以试管为例)是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰,并将 管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉 棉塞,再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基上。 若是叶片直接附在培养基上, 以放 1-3 块为宜。至于材料放置方法除茎尖、 茎段要正放 (尖 端向上)外,其他尚无统一要求。接种完后,将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞,塞 好后,包上包口纸,包口纸里面也要过火。 培 养 培养指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里,使之生长,分裂和分化形成愈 伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1、培养方法 (1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。 是现在最常用的方法。 虽然该方法设备简 单,易行,但养分分布不均,生长速度不均衡,并常有褐化中毒现象发生。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 由于液体中氧气含量较少, 所以通 常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给, 采用往复式摇床或旋转式摇床进行 培养,其速度一般为 50-100r/min,这种定期浸没的方法,既能使培养基均一,又能保证氧 气的供给。 2、培养步骤 (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某些外植体后,最初的几代培养。初 代培养时,常用诱导或分化培养基,即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初 代培养建立的无性繁殖系包括:茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方 向可分为: 1)顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素, 可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长, 从而形成 一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。 在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继 代,重复芽苗增殖的培养,并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基 上, 就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。 一些木本植物和少数草本植物也可以通过这 种方式来进行再生繁殖, 如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖, 它不经过发生愈伤组织而再生,所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。 适宜这种再生繁殖的植物,在采样时,只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段,其他 如种子萌发后取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组 织作为外植体进行接种。在实际操作中,采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养,这 样便保证了操作方便以及容易成活。 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长,有直立向上的茎梢,扩繁时主要用切割 茎段法,如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽,形成芽丛。 2)不定芽的发育

在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。然 后,经再分化,即由这些分生组织形成器官原基,它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性 (这与胚状体不同) 。多数情况下它形成芽,后形成根。 另一种方式是从器官中直接产生不定芽,有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能 力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下,培养基中提供了营养,特别是提 供了连续不断植物激素的供应, 使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。 许多种类的外 植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。 在许多常规方法中不能无性繁殖的种类, 在试管条件下 却能较容易地产生不定芽而再生,如柏科,松科,银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器 官能强烈地发生不定芽,用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。 在不定芽培养时,也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物,一般采 用芽丛进行繁殖,如非洲菊、草莓等。 3)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同,它也通过球形,心形,鱼雷形和子叶形的 胚胎发育时期, 最终发育成小苗。 但它是由体细胞发生的。 胚状体可以从愈伤组织表面产生, 也可从外植体表面已分化的细胞中产生,或从悬浮培养的细胞中产生。 4)初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后,其表面开始褐变,有时甚至会使整个培养基褐变的现象。 它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活, 而使细胞的代谢发生变化所致。 在褐变过 程中,会产生醌类物质,它们多呈棕褐色,当扩散到培养基后,就会抑制其他酶的活性,从 而影响所接触外植体的培养。 褐变的主要原因如下: a、植物品种 研究表明,在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性 上的差异,因此,有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变,而有些花卉品种的外植体在 接种后不容易褐变。因此,在培养过程中应该有所选择,对不同的品种分别进行处理。 b、生理状态 由于外植体的生理状态不同,所以在接种后褐变程度也有所不同。一 般说来,处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅,而从已经成年的植株采收的外植体,由于含 醌类物质较多,因此褐变较为严重。一般来说,幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显,而 老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。 c、培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加,此外,细胞 分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性,从而使褐变现象加深。 d、培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚氧化酶的 活性提高,从而加速被培养的外植体的褐变程度。 为了提高组织培养的成苗率, 必须对外植体的褐变现象加以控制。 可以采用以下措施防 止、减轻褐变现象的发生。 1、选择合适的外植体 一般来说,最好选择生长处于旺盛的外植体,这样可以使褐变 现象明显减轻。 2、合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均 可以减轻材料的褐变现象。 3、使用抗氧化剂 在培养基中,使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效 地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外,使用 0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为 明显的效果。 4、 连续转移 对容易褐变的材料可间隔 2-24 小时的培养后, 再转移到新的培养基上, 这样经过连续处理 7-10 天后,褐变现象便会得到控制或大为减轻。 (2)继代培养

在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不够,它们需要进 一步增殖,使之越来越多,从而发挥快速繁殖的优势。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。 旨在繁殖出相当数量的无根 苗,最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以 2 株苗为基础,那么经 10 代将生成 2 10 株苗。 继代培养中扩繁的方法包括:切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割 茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行,能保持母种特性。培 养基常是 MS 基本培养基;分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。 若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块,放入 MS 培养基中,待到稍大时,再分离开来继续培 养。 增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同, 由于培养物在接近最良好的环 境条件,营养供应和激素调控下,排除了其他生物的竞争,所以能够按几何级数增殖。 在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程,而继代培养则是经常性不停的进行过程。 但在达到相当数量之后,则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲,增殖只是 储备母株,而生根才是增殖材料的分流,生产出成品。 (3)继代培养时材料的玻璃化 实践表明,当植物材料不断地进行离体繁殖时,有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透 明水迹状,这种想象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。 玻璃化为试管苗的生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根,因此,使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品 种间,试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时,也容易出现玻 璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质,能够在一定程度上减轻玻璃化的 现象发生。 呈现玻璃化的试管苗,其茎、叶表面无蜡质,体内的极性化合物水平较高,细胞持水力 差,植株蒸腾作用强,无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高, 透气性较差造成的,其具体解决的方法为: a、增加培养基中的 溶质水平,以降低培养基的水势; b、减少培养基中含氮化合物的用量; c、增加光照 d、增加容器通风,最好进行 CO2 施肥,这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用; e、降低培养温度,进行变温培养,有助于减轻试管苗玻璃化现象发生; f、降低培养基中细胞分裂素含量,可以考虑加入适量脱落酸。 3、生根培养 当材料增殖到一定数量后,就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养 物转到生根培养基上去, 就会使久不转移的苗子发黄老化, 或因过分拥挤而使无效苗增多造 成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程,这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。 生根培养可采用 1/2 或者 1/4MS 培养基,全部去掉细胞分裂素,并加入食粮非的生长素 (NAA、IBA 等) 。 诱导生根可以采用下列方法 a、将新梢基部浸入 50 或 100*10-6IBA 溶液中处理 4-8 小时; b、在含有生长素的培养基中培养 4-6 天 c、直接移入含有生长素的生根培养基中。 上述三种方法均能诱导新梢生根, 但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。 而第 三种对幼根的生长有抑制作用。 其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在, 则

不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。 另外也可采用下列方法就可生根。1、延长在增殖培养基中的培养时间;2、有意降低 一些增殖倍率,减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步) ;3、切割粗壮的嫩枝 在营养钵中直接生根,此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作,切割下的插穗可 用生长素溶液浸蘸处理,但这种方法只适于一些容易生根的作物。 另外少数植物生根比较困难时,则需要在培养基中放置滤纸桥,使其略高于液面,靠 滤纸的吸水性供应水和营养,从而诱发生根。 从胚状体发育成的小苗,常常有原先已分化的根,这种根可以不经诱导生根阶段而生 长。但因经胚状体发育的苗数特别多,并且个体较小,所以也常需要一个低浓度或没有植物 激素的培养基培养的阶段,以便壮苗生根。 试管内生根壮苗的阶段,为了成功地将移植到试管外的环境中,以使试管苗适应外界 的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花,以 18-20℃为宜。实践证明植物 生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。 而且还牵涉到菌类易滋生的问题。 温度过低使幼苗 生长迟缓,或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线,使基质温度略高于气温 2-3℃,这 不但有利于生根和促进根系发达,而且有利于提前成活。 移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高,并可适应强度较高的漫射光, (约 4000lx 左右) ,以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强,会使水分平 衡的矛盾更尖锐。 文章链接:中国制药机械设备网 http://www.zyzhan.com/Tech_news/Detail/2397.html


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组培设备与条件概述 24页 免费 组培设备及应用 16页 10财富值 植物组织培养基本设备 4页 1财富值 组培项目项目建议书 17页 免费如要投诉违规内容,请到百度文库投...
组培
组培设备与条件概述 24页 免费组​培 暂无评价|0人阅读|0次下载|举报文档 好​的愈伤组织:原来是指植物在受伤以后,在伤口表面形成的一团薄壁细胞,在组织培养...
植物组织培养技术简介
植物组织培养技术简介_生物学_自然科学_专业资料。植物组织培养技术简介上世纪 30...4. 培养条件 温度: 对大多数植物组织 20~28℃即可满足生长所需,其中 26~...
组培室筹建估算
场地租金 水电费 人工工资 流动资金 组培概述 1 准备室 主要用于配制药品、...植物组织 培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件,需要一定的设备、...
组织培养课程简介及课程标准
室的布局与组成以及相应的设备、工厂化生产的工艺流 程、组培生产的成本核算和...(三)教学实施条件 1、教学团队 “双师” 结构, 专兼教师比例, 学缘结构, ...
组织培养
植物组织培养概述 --- 2 1.1 植物组织培养的定义及工艺流程 ---...器官 或细胞,原生质体等,通过无菌操作,在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株...
组培总结
组培总结 隐藏>> 上 篇 组织学 组织学总论第 1 ...是把从机体取得的细胞在体外模拟体内的条件下进行...概述 组成: 组成:肌细胞+少量 CT、血管、淋巴管及...
植物组织培养技术习题
第1章课堂讨论题: 植物组织培养实验室的基本设备和...4、简述植物组织培养无菌操作技术的一般过程。 第二...必需元素的条件是什么?其在植物体内 的生理作用主要...
组织培养的历史简介
组织培养的历史简介_农学_农林牧渔_专业资料。植物组织培养技术发展简介史 录入...由于受当时科学技术发展水平和设备条件的限 制,他们取得的进展很小。但是这些...
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