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耐高温酵母菌的筛选及特性研究


第 34 卷 第 2 期





Vol.34.№.2 Mar. , 2007

2 0 0 7 年 3 月
文章编号 :1002- 8110 2007) 02- 0052- 03 (

LIQUOR

MAKING

耐高温酵母菌的筛选及特性研究
刘 畅 1, 王 涛 2, 石翠芳 3
( 1. 河北科技师范学院食品工程系, 秦皇岛 066600 ; 2. 海口农工贸 罗牛山) 股份有限公司, 海口 570125 ) (



要: 从轻微腐烂的水果中筛选到两株在 45℃可以良好生长的耐高温酵母菌 B- 2 和 J- 7, 并对其基本形态特

征、 生理特性及发酵性能进行了研究。结果表明: 高浓度的糖、 盐或酒精均会抑制两株耐高温酵母菌的生长; B- 2 的耐糖性、耐酒精性优于 J- 7 ; 两株菌的最适生长 pH 约为 5.5 ; 37℃发酵实验表明, B- 2 发酵能力较强, 发酵

72h 能从 20%葡萄糖中产 7.9%Vol 酒精, 而相同条件下, J- 7 仅产 4.9%Vol 酒精。
关键词: 耐高温酵母; 筛选; 生理特性; 酒精发酵 中图分类号: TS261.11 ; TS261.15 文献标识码: B 稀释液涂布于麦芽汁固体培养基中, 30℃ 培养 36h 。挑取典型 酵母 菌 菌 落 接 种 于 YPD 固 体 培 养 基 中 , 50℃ 培 养 24h , 长 出 菌落后进一步划线分离, 镜检为纯种后分别转入 YPD 培养基 中。

酵母菌是酒精和食品行业的重要生产菌株, 随着人类能 源危机和环保意识的不断加强, 以燃料酒精代替汽油逐渐成 为发展趋势。耐高温酵母菌能减少酒精生产中由于降温所带 来的麻 烦 和 费 用 , 保 证 工 业 发 酵 能 在 高 温 下 正 常 进 行 , 因 此 , 围绕耐高温酵母菌的筛选成为研究热点
[1,2]

。 近年来, 已有多株

1.2.2 耐高温酵母 菌 的 筛 选 : 利 用 产 酒 精 能 力 强 的 酵 母 菌 能
( 还 原 三 苯 基 四 氮 唑 盐 酸 盐 TTC) 变 为 深 红 色 这 一 特 性 , 筛 选 深 红 色 菌 落 , 将 酵 母 菌 接 种 于 YPD 固 体 培 养 基 中 , 长 出 菌 落 后再接种于附有杜氏小管的麦芽汁试管中, 观察杜氏小管的 产气情况, 确定目的菌株。

人工选育的耐高温酵母菌投入到生产中, 并取得了良好的经 济效益 [3,4]。 目前, 耐高温酵母菌的选育主要集中在自然筛选和 高温驯化, 也有学者采用分子生物学手段来改造酵母菌 [5,6], 使 耐高温酵母菌的研究取得了显著进展。 本文通过自然筛选的方法从水果中分离到两株耐高温酵 生理特性及发酵性能进行了 母菌 B- 2 和 J- 7 , 对其基本形态、 研究。

1.2.3 酵母菌的生理特性 1.2.3.1 耐糖性: 制备葡萄糖含量分别为 5% 、 、 、 、 10% 20% 30% 40% 、 、 ( w/v) 的麦芽汁, 灭菌后分别接种酵母菌 , 接 种 50% 60%
量 为 1×107 个 /mL, 30℃ 培 养 24h, 每 个 糖 浓 度 重 复 三 次 , 血 球计数板镜检计数, 取平均值。 ( 1.2.3.2 耐 酸 性 : 制 备 不 同 pH 3.0 、 、 、 、 、 、 、 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 原料: 轻微腐烂的水果。 1.1.2 菌种: 安琪活性高温干酵母, 市售。 1.1.3 培养基 : 富 集 培 养 基 : 麦 芽 汁 液 体 培 养 基 : 11 ̄12° 麦 BX
芽汁。 分离培养基: 麦芽汁固体培养 基 : 麦 芽 汁 , 2% 琼 脂 。 YPD 培 养 基 : 葡 萄 糖 20g、 蛋 白 胨 20g、 酵 母 浸 膏 10g、 定 容 至

7.0) 的麦芽汁, 测定方法同 1.2.3.1 。 1.2.3.3 耐盐性: 制备含有氯化钠浓度分别为 0 、 、 、 、 0.5 1.0 1.5 2.0 、 、 2.5 3.0mol/L 的麦芽汁, 测定方法同 1.2.3.1 。 1.2.3.4 耐 酒 精 性 : 制 备 含 不 同 酒 精 量 6% 、 、 、 、 10% 12% 14% 16% 、 18%Vol 的 麦 芽 汁 试 管 , 附 杜 氏 小 管 , 接 种 待 测 酵 母 菌 , 30℃ 培养 24h , 观察发酵现象并镜检计数。 1.2.3.5 生 长 曲 线 的 测 定 : 将 酵 母 菌 接 种 于 麦 芽 汁 中 , 在 一 定
温度下, 200r/min 的摇床培养, 每隔 2h 取样一次, 用未接种的 麦芽汁作空白对照, 于 660nm 测其 OD 值, 以培养时间为横坐 标, OD 值为纵坐标, 绘制生长曲线。

1000mL。
产 孢 子 培 养 基 : 葡 萄 糖 1g, KCL1.8g, 酵 母 浸 膏 2.5g, 醋 酸 钠 8.2g, 水 1000mL。 酒 精 发 酵 培 养 基 : 适 当 浓 度 的 葡 萄 糖 , 玉 米 浆 20g, 尿 素

2g, 水 1000mL。 1.2 方法 1.2.1 酵母菌的分离纯化 1.2.1.1 富集培养酵母: 分别称取 5g 轻微腐烂的水果, 切块投
入麦芽汁液体培养基中, 30℃ 培养 36h 。

1.2.4 酵母菌的发酵实验 1.2.4.1 最适发酵温度的确定: 将酵母种子液接入发酵培养基
中 , 在 不 同 温 度 下 恒 温 培 养 72h , 称 量 CO2 失 重 , 根 据 失 重 大 小确定最适发酵温度。

1.2.1.2 分 离 纯 化 酵 母 : 将 富 集 培 养 液 系 列 稀 释 , 分 别 取 1mL
收稿日期 :2006- 10- 22 作者简介: 刘 畅 1979- ) , 女, 硕士, 讲师, 研究方向: 食品微生物。 (

1.2.4.2 三角瓶发酵实验: 将酵母种子液接入三角瓶发酵培养
基中, 每瓶 200mL, 37℃ 摇床培养 72h , 每 12h 称 重 一 次 , 计 算

CO2 失重, 发酵结束后蒸馏酒精, 用比重计测酒精含量。 2 结果与分析

? 52 ?

第二期
表1 菌株 两株酵母菌在不同温度下的生长情况 培养温度 ℃) (




2.1 耐高温酵母菌的筛选

2007

经过 初 筛 从 样 品 中 分 离 到 62 株 酵 母 菌 , 复 筛 得 到 两 株
50 ++ + 51 + - 52 - -

35 ++ ++

40 ++ ++

45 ++ ++

能 在 45℃ 正 常 生 长 的 典 型 酵 母 菌 , 分 别 为 B- 2 和 J- 7 , 其 温 度适应性 实 验 结 果 见 表 1 。 由 表 1 可 知 : 低 于 45℃ 时 两 株 菌 的生长状况良好; 在 50℃ 时, B- 2 生长状况良好, J- 7 生长缓

B- 2 J- 7
表2

注: ++ 生长良好 + 生长 - 不生长 耐高温酵母菌的基本形态特征 基本特征

基本特征

B- 2
圆形或椭圆形, 芽殖, 在产孢子培 养基上形成子囊, 每个子囊中有 1

J- 7
圆形, 芽殖, 在产孢子培养基上形成子 囊, 每个子囊中有 1~4 个圆形或卵圆 形子囊孢子。 表面不产膜, 底部有沉淀。 乳白色, 中心无凸起, 表面光滑, 无褶 皱; 边缘不规则, 呈波形, 直径为 0.8cm, 生长速度慢。

细胞形态

~4 个圆形或卵圆形子囊孢子。
液体生长 巨大菌落 ( 培养 15d 后) 表面产膜, 底部有絮状沉淀。 乳白色, 圆形, 中心凸起, 表面光 滑, 不透明, 无褶皱, 边缘整齐, 直径为 1.8cm; 生长速度快。

慢; 51℃ 时, B- 2 生长缓慢, J- 7 没有生长迹象。

对营养物质的吸收和利用。由图 2 可知: 当 培 养 液 的 pH 为

2.2 耐高温酵母菌的形态特征
对两株酵母的细胞形态、液体生长及巨大菌落形态进行 了研究, 结果见表 2 。

3 ̄6 时, 两株菌的数量随 pH 的增大而逐渐增加, 当 pH=5.5 时
达到最高值, 当 pH>6 时, 酵母菌的数量明显减少。因此, 两株 菌的最适生长 pH 为 5.5 。

2.3 耐高温酵母菌的生理特性 2.3.1 糖浓度对酵母菌的影响
将酵母菌接种到含不同葡萄糖浓度 6.5%~15%) 的麦芽 ( 汁中, 其生长情况如图 1 所示, 两株酵母在低浓度的葡萄糖中 都能良好生长, 当糖浓 度 >10% 时 , 酵 母 的 数 量 随 糖 浓 度 的 增 加 而 减 少 ; 当 糖 浓 度 为 50% 时 , B- 2 能 微 量 生 长 , 而 J- 7 基 本 不生长; 因此 B- 2 的耐糖性高于 J- 7 。
1.2
个数 108) 个 /mL (

2.3.3 盐浓度对酵母菌的影响
培养基中盐浓度的变化可以影响酵母的好氧量、生长速 度以及发酵率等方面的生理功能, 由图 3 可知, 随着盐浓度的 增长, 两 菌 株 都 受 到 不 同 程 度 的 抑 制 , 其 耐 盐 性 基 本 相 同 , 当

NaCl 浓度达 2.5mol/L 时, 两株菌基本不生长。

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20
图1

B- 2 J- 7

30

40

50

60 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 3 5 7 9 11 13 15 17

葡萄糖浓度 %) ( 糖浓度对酵母菌的影响

2.3.2 pH 对酵母菌的影响
( 培 养 基 的 氢 离 子 浓 度 pH) 对 酵 母 的 生 命 活 动 有 显 著 的 影响, 氢离子能改变细胞原生质膜胶体的电荷, 从而影响细胞

酒精浓度 %) ( 图 4 不同酒精浓度下的生长状况

2.3.4 酒精度对酵母菌的影响
酵 母 菌 在 酒 精 含 量 为 3%Vol~16%Vol 的 麦 芽 汁 中 的 生 长情况见图 4 , 两株菌随着酒精浓度的增加, 其菌数 不 断 减 少; 表明高浓度的酒精含量会抑制酵母菌的生长繁殖。 当培养 液的酒精含量为 14%时, 有少量 B- 2 菌株生长, J- 7 基本没有 ? 53 ?

第二期



畅, 等:耐高温酵母菌的筛选及特性研究
3 结论与讨论

2007

生长。由此可见, B- 2 的耐酒精性强于 J- 7 。

2.3.5 生长曲线

从水果中经分离、 筛、 筛得到两株耐高温酵母菌, 分 初 复 别为 B- 2 和 J- 7 。 B- 2 和 J- 7 的最高生长温度分别为 52℃ 和

51℃ 。 高 浓 度 的 糖 、 盐 或 酒 精 均 会 抑 制 两 株 酵 母 菌 的 生 长 ; B- 2 的 耐 糖 性 和 耐 酒 精 性 优 于 J- 7 ; B- 2 具 有 较 高 的 发 酵 能
力, 37℃ 时发酵 72h , 产酒精达 7.9%。在 B- 2 发酵实验中还有 需进一步研究的地方: 如接种量、 最适发酵温度、 最适发酵 pH 的测定, 通过上述发酵条件的优化, 可提高酵母菌的酒精产
图 5 生长曲线

量。此外, 两株菌的鉴定工作有待于进一步研究。 一般工业用酵母菌的最适发酵温 度 为 30℃~33℃ , 本 实 验筛选的耐高温酵母菌 B- 2 的最适发酵温度为 37℃ , 但其酒 精产量较安琪高温干酵母稍差, 如通过分子生物学手段, 将耐 高温的 B- 2 和高产酒精的酿酒酵 母 进 行 原 生 质 体 融 合 , 将 会 构建优良的耐高温酒精酵母。

将一定数量的酵母菌接种于的麦芽汁中, 于 37℃ 测 定 生 长曲线, 结果如图 5 所示, 两株菌在好氧条件下均表现出典型 的 Monod 生 长 曲 线 , 在 0h ̄2h 都 有 不 同 程 度 的 成 长 , 在 对 数 生 长 期 , B- 2 生 长 速 度 较 快 , J- 7 较 慢 。 两 株 菌 在 10h 都 达 到 稳定期, 世代时间分别为 3.1h 和 3.3h 。

2.3.6 酒精发酵实验
将酵母种子液接入发酵培养基中, 于不同温度下发酵

[参考文献 ]
鉴 [1] 陈叶福, 王正祥, 王晨霞, 等 . 耐高温酵母菌株 的 分 离 、 定 及 其 酒精发酵初步研究 [J]. 微生物学通报, 2003 , 30(5): 25~27

72h , 称 量 CO2 的 失 重 , 结 果 表 明 : 在 37℃ 发 酵 72h 后 , CO2 失
重达最大, B- 2 和 J- 7 分别可达 11.6g 和 8.1g, 说明两株酵母 的最适发酵温度为 37℃ 。
表3 菌株 耐高温活性干酵母 耐高温酵母菌的发酵性比较 ( CO2 失重量 g) 酒精度 % Vol) (

[2] 金承涛, 曾云中, 吴雪昌, 等 . 耐热酵母菌株 HU- TY- 1 的耐热机
( ( 理初探 [J]. 浙江大学学报 理学版) , 2001 , 28 6) , 676~681

14.5 11.6 8.1

9.8 7.9 4.9

[3] 华子安, 田亚平, 金其荣 . 选育耐高温酒精酵母的研究 [J]. 酿酒,
( 2003 , 30 3) , 37~39

B- 2 J- 7

[4]

Sree. Ethanol Production in Solid Substrate Fermentation using

以两株耐高温酵母作为发酵菌种, 以耐高温活性干酵母 作对照, 接种于葡萄糖浓度为 20% w/v) 的发酵培养基进行 (

Thermotolerant Yeast [J]. Process Biochemistry1999 , (34): 115~119 [5] Wu Wei- xiang, Min Hang, KamdemDGC. Biological and fermentative properties of a Thermotolerant yeast Strain in alcohol production from cassava flour. Journal of Zhejiang University (Agric.& Life Sci.), 2001 , 27(3): 277~281 [6] 孙 君 社 , 李 雪 , 李 军 席 . 原 生 质 体 融 合 构 建 耐 高 温 酵 母 菌 株 [J].
食品与发酵工业, 2002 , 28 5) , 1~4 (

250mL 摇瓶发酵实验, 37℃ 发酵 72h , 结果见表 3 。由表 3 可
知, B- 2 的 发 酵 性 能 优 于 J- 7 , 但 两 株 菌 的 发 酵 性 能 较 活 性 干 酵母差。 B- 2 于 37℃ 发酵 72h 后酒精度为 7.9% , 而 J- 7 仅为

4.9%。

Study on Scr eening and Char acter istics of Ther motoler ant Yeast
LIU Chang1, WANGTao2
(1.Department ofFood Engineering, Hebei Normal UniversityofScience &Technology, Qinhuangdao066600, China; 2.Haikou Agriculture &Industry&Trade Luoniushan Co., Ltd, Haikou 570125, China) Abstr act: Two thermotolerant yeast strains B- 2 and J- 7 were isolated from the slightly decayed fruits. Some morphological and physiological characteristics and fermentation properties oftwostrains were investigated. Results indicated that B- 2 showed better resistances tohigh concen tration alcohol and glucose than J- 7. The optimumgrowth pH value ofB- 2 and J- 7 was 5.5. The ethanol fermentation experiment at 37℃showed that B- 2 can produce 7.9% vol ethanol from20% glucose after 72h, while J- 7 can produce 4.9% vol ethanol under the same condition. Key wor ds: thermotolerant yeast;screening;physiological characteristics;ethanol fermentation

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