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Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用


中国生物工程杂志  China B iotechnology, 2009, 29 ( 12 ) : 114 ~118

Tn5 转座突变技术在革兰氏阴性

细菌分子遗传研究中的应用
年洪娟   陈丽梅  李昆志
(昆明理工大学生物工程技术研究中心   昆明  650224)

摘要   随着广宿主载体

系统的发展 , Tn5 及其衍生载体已经广泛应用于革兰氏阴性细菌的分子遗 传学研究 。主要综述了 Tn5 转座突变技术在生防细菌生防机理研究 、 细菌必需基因的鉴定 、 病原 细菌毒力相关基因研究 、 代谢调控基因研究和菌株的遗传改良方面的应用研究进展 。 关键词  Tn5 转座突变   生防机理   必需基因   细菌毒力基因   代谢调控基因   菌株遗传改良
中图分类号  Q819

   随着后基因组时代的到来 , 基因功能研究越来越 重要 。转座子突变技术是通过构建突变体研究基因功 能的一种方法 ,该方法因其操作简便易行而备受关注 。
Tn5 属于复合转座子 ,由编码抗生素的核心序列和两条

倒置的 IS50 组成 , IS50 具有 19bp 的倒置末端序列 (即 外末端 OE 和内末端 IE ) , 此倒置末端是转座酶 ( Tnp ) 的作用位点 。 IS50R 编码 53kDa 的转座酶和 48kDa 的 转座阻遏蛋白 ( Inh ) 。而 IS50L 上存在一个突变 , 翻译 提前终止 , 不能产生有活性的转座酶和转座阻遏蛋白
(图 1 ) 。由 Tn5 构建而成的一系列衍生载体具有以下

优点 : ( 1 ) Tn5 转座子载体均为自杀性载体 , 必须在特 定的宿主中才能复制 ; ( 2 ) 转座区域带有可选择的抗生 素抗性基因 , 便于突变体的筛选 ; ( 3 ) Tn5 能抑制自身 的转座 , 保证在突变菌株上的单拷贝插入 , 有利于突变 性状的筛选 ; ( 4 ) 转座子在插入位点留下一段已知 DNA 序列 , 比传统的诱变方法更容易定位 ; ( 5 ) 由于转座酶 不发生转座 , 转座子在 DNA 上稳定存在 , 保证了突变 性状的稳定 。近年来 , Tn5 转座子突变技术成为革兰氏 阴性细菌分子遗传研究的一种简便方法 。本文主要综 述 Tn5 及其衍生载体突变技术在功能基因研究和工程 菌株构建中应用的研究进展 。

收稿日期 : 2009 2 2    05 06 修回日期 : 2009 2 2 05 21 3 云南省应用基础研究基金 ( 2009ZCO14X) 、 云南省教育厅科学 研究基金 ( 09C0106) 资助项目 33 电子信箱 : hjnian@163. com

33

图 1  Tn5 转座子的结构 [ 1]
F ig. 1  Structure of the Tn5 tran sposon

1  Tn5 转座子突变技术的应用
   采用 Tn5 转座子插入突变方法 , 将 Tn5 转座子导 入染色体 DNA 并利用插入位点处基因发生突变 , 从而 筛选功能发生变化的突变株 , 再来研究突变株中被插 入位点基因的功能 。
1. 1   生防细菌生防机理的研究

   荧光假单胞菌 ( Pseudom onas fluorescens ) 是一类重 要的根围细菌 ,它主要是通过产生抗生素 、 嗜铁素等次 生代谢产物及生长调节物质来发挥其防病增产的作 用 。利用转座子突变技术获得产抗生素等次生代谢产 物能力缺乏或者缺失的突变株 , 是研究其生防机理最 行之有效的方法 。
1. 1. 1  抗 生 素 合 成 基 因 的 研 究   Pseudom onas

用转座子插入突变的方法使之失去产生吩嗪 2 2 酸 1羧 的防效也随之下降 , 将含有该抗生素合成基因的质粒
( Phenazine 2 2carboxylate, PCA ) 的能力 , 对小麦全蚀病 1

au reofaciens 30 2 对小麦全蚀病有比较强的防治效果 , 84

3

2009, 29 ( 12 )

年洪娟 等 : Tn5 转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用
[2 ]

115

转入突变菌株 , 抑菌能力和防病效果也随之恢复



研究方法 。反向研究方法是通过判断某些区域是非必 需的从而可以推断出必需的基因或区段 。具体过程还 需要利用 PCR 方法进行定位或者进行大规模的转座子 突变 。正向研究方法即转座子插入后产生条件突变或 者致死表型从而直接判断某些基因是必需基因 。这种 方法是用一个诱导型的启动子来替代基因本身的启动 子 。如果插入位点是必需基因 , 那么细菌必须在诱导 条件下利用诱导型启动子才能进行生存或者生长 。该 方法经过修饰后已经鉴定了大量的在特定条件下生存 或生长所必需的基因 。 Judson 和 M ekalanos 用阿拉伯 糖诱导的启动子 (称为 TnA raOut) 鉴定了 16 个只有在 阿拉伯糖诱导下才能生长的 ORF, 其中 5 个 ORF 是细 菌在 LB 培养基上形成菌落所必需的 , 另外 11 个 ORF 则是在阿拉伯糖诱导下生长速度下降 、 形成的菌落也 比较小
[8 ]

硝吡咯菌素 ( pyrrolnitrin, Prn ) 也是某些生防菌株产生 的抗生素 , 用 Tn5 对 P. fluorescens BL915 产 Prn 的 32kb 片段进行突变 , 将 Prn 合成基因定位在 6. 2kb 的 DNA 片段上 , 该片段是由 4 个开放阅读框组成的基因簇 , 其 中任何 一 个 基 因 突 变 都 会 导 致 不 能 产 生 硝 吡 咯 菌 素
[3]



1. 1. 2  嗜铁素合成基因的研究  产生嗜铁素也是荧

光假单胞菌生防机制之一 。 P. fluorescens ATCC17400 中细胞色素 C 的生物合成与嗜铁素产生密切相关 , 其 细胞色素 C 生物合成基因 ccm C 被 Tn5 插入失活后 , 嗜 铁素产量显著减少 , 表明血红素合成破坏会影响嗜铁 素的产生
[4]



1. 1. 3  根部定殖与运动特性的研究  维生素的产生

是刺激细菌生长 、 根部定殖竞争 、 共生固氮的重要影响 因子之一 。 P. fluorescens 267 除了产生维生素 B 以外还 能够产生大量的烟酸 , 从而促进三叶草型豌豆根瘤菌 和三叶草的生长 。 Tn5 转座子插入后产生的烟酸营养 缺陷型突 变 体 P. fluorescens 267. 1 不能 产 生 喹啉 酸 ,
Tn5 阻断的 nadA 基因编码 39. 0kDa 蛋白 , 与许多细菌



1. 3   病原细菌毒力相关基因的研究

   病原菌致病性研究是微生物功能基因组学研究的 重要领域 。鉴定致病细菌毒力基因可以加深对感染机 制的认识 , 为制定疾病控制措施奠定理论基础 。转座 子突变方法在鉴定病原微生物毒力相关基因中起着非 常重要的作用 。首先转座子插入可以使致病重要基因 产生阻断 ,然后分离筛选毒力缺失的突变体 , 从而确定 阻断基因在病原菌致病过程中所起的作用 , 是研究植 物病原菌毒力相关基因的常用方法 。
1. 3. 1  植物病原细菌毒力相关基因与功能的研究  
P. fluorescens ( PfA7B ) 产生的粘质菌素 ( viscosin, V is) 会

的喹啉合成酶有很高的同源性 , 将携带该基因的质粒 转入突变体中可以恢复喹啉酸合成能力和互补烟酸营 养缺陷的表型
[5 ]

。对多种植物病害具有抑制作用的溶

杆菌菌株 C3 能够产生多种胞外水解酶 。利用 Tn5 转 座子突变技术得到几种胞外水解酶活性 、 滑移运动能 力和体外抗菌活性均下降的突变体 5E4。研究发现转 座子插入到了 Crp 调控因子基因家族的 clp 基因中 , 将
clp基因重新整合到突变体 5E4 的染色体后 , 其所有的

引起花椰菜头部腐烂 , 通过筛选 Tn5 突变库得到 V is产 生突变体 , 通过染色体定位和蛋白谱分析 , 将影响 V is 合成产量的 3 个高分子量蛋白定位在 25kb 的染色体区 域上 , 该 DNA 的克隆转入突变体中则可以恢复 V is的 产生
[9 ]

突变性状都得到了恢复

[6 ]



   作者本人也利用 Tn5 转座子插入的方法构建了 P.
fluorescens TC222 突变体库 , 筛选到了生物膜形成突变

。水稻黄单胞菌 ( X an thom onas oryzae pv. O ryzae,

体 , 克隆到了 5 个参与生物膜形成的基因 , 即 dTDP 2 2 4 噬菌体信号肽蛋白基因 bspA、 编码 M ig2 族蛋白基因 14
ep sB 和可溶的嘧啶核苷转氢酶基因 py r A
[7]

Xoo ) 是引起水稻枯萎病的细菌 , 利用 Tn5 衍生转座子

脱氢鼠李糖还原酶基因 lipA、 鞭毛合成蛋白基因 flaR、 。

构建了 Xoo KACC10331 随机插入突变库 , 得到一株对 水稻致病性降低的突变体 M793。序列分析发现 , 转座 子插入了编码磷酸核糖胺 - 甘氨酸连接酶的 pu r 基因 D 中 , 该突变体在微量培养基中加入外源的嘌呤和硫胺 才能生长 , 此结果表明 , pu r 基因在生长和毒力发挥中 D 起着重要的作用
[ 10 ]

1. 2   细菌必需基因的鉴定

   必需基因指在某些特定过程包括细胞分裂 、 芽孢

形成 、 运动性和抗药性中所不可缺少的基因 。转座子 插入后会引起插入位点的基因失活 , 如果插入某个开 放阅读框 ( ORF ) 后可以形成菌落 , 则说明该 ORF 并非 是此条件下生存所必需的基因 。用该方法鉴定是否为 细菌生存必需基因有两条途径 : 反向研究方法和正向

。丁香假单胞菌 DC3000 是番茄细

菌斑点病的致病菌 , 它可以在植物细胞间的质外体空 间繁殖 ,其定殖过程需要毒力因子的表达 。为了鉴定 参与这些过程的新的致病因子 , 通过筛选对拟南芥毒 力降低的 Tn5 转座子插入突变体 , 得到了突变体 mqo,

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中国生物工程杂志 China B iotechnology

Vol 29 No. 12 2009 .

Tn5 插入了苹果酸 : 苯醌氧化还原酶基因 , 该突变体在

感染早期阶段生长无法达到野生型的水平

[ 11 ]



1. 3. 2  动物病原细菌毒力相关基因与功能的研究  

嗜铁素在人类条件致病菌铜绿假单胞菌侵染过程中具 有重要作用 。利用转座子突变方法 , 当 EDDHA 和嗜铁 素 PVD 存在时 , 得到不能利用这些嗜铁素的突变体 。 其中 2 个突变体利用 PVD 的能力受到破坏 , 其转座子 插入到细胞色素 C 合成基因 ccmB 和 ccm E 中
[ 12 ]

。利

用 Tn5 转座子对羊致病菌 B rucella m elitensis 大规模突 变后 , 筛选到了 95 个对毒性发挥和病菌生存具有贡献 的基因 , 其中 2 /3 是新发现的基因
1. 4   代谢调控的研究
[ 13 ]



   运用各种转座子插入突变手段进行基因相关功能 的研究 , 是目前开展基因定位及其功能研究 , 特别是一 系列代谢调控基因研究的首选方法 。
1. 4. 1   对有机硫的代谢   恶臭假单胞菌 ( Pseudom onas
pu tida ) S2 可以利用芳香磺酸盐作为硫源 , 对不能利 313
[ 14 ]

用芳香磺酸盐的 Tn5 突变体研究发现 , 转座子插入到 了 ssuEADCB F 操纵子中 , 该操纵子包括含有 ATP 结合 域的转运蛋白 ( ssuAB C ) , 依赖于还原型 FMN 的双组分 单加氧酶 ( ssuED ) 和钼铁结合蛋白 ( ssuF ) 。这些突变 体即使在其他有机硫作为硫源时也不能生长 运用相似的方法
[ 15 ]

。 P.

pu tida DS1 在利用硫酸二甲酯作为硫源的研究中也是



1. 4. 2   N 源的利用  在 P. pu tida KT2442 中 , 硝酸 对

盐还原酶 ( nasB ) 参与硝酸盐同化作用 。利用无启动子 的发光酶基因 luxAB 与转座子形成转录融合 , 进行第二 次突变 , 研究对 nasB 具有调控作用的基因 。结果发现 编码谷氨酸合成酶大亚基的基因插入失活后 , 在氮缺 乏条件下不能诱导 nasB 基因的表达
[ 16 ]

。因此 , 利用转

座子与无启动子的报告基因融合构建突变体 , 是研究 细菌 代 谢 调 控 基 因 普 遍 应 用 的 方 法 。在 P. pu tida
KT2442 中 ,参与赖氨酸代谢的氨基酸转移酶的表达在

根部 是 受 根 分 泌 物 调 控 的 , 该 研 究 也 是 采 用 这 种 方法
[ 17 ]



1. 4. 3  对有害污染物代谢的研究  有些 P. pu tida 可

以降解环境中的有害污染物 。 P. pu tida S 12 利用外排 系统可以耐受有机溶剂 , 若有机溶剂外排蛋白基因失 活则该突变体无法在辛酸和甲苯存在时生长
[ 18 ]

。通过

对 P. pu tida CA 2 的 Tn5 突变体筛选 , 得到两个影响聚 3 羟基脂肪酸酯 ( PHA ) 积累的突变体 。其中一个突变体
CA 2 2 积累 PHA 大幅度降低 , Tn5 插入了胁迫相关 3 126

γ2 氯环己烷和多菌灵 。 六

蛋白 Clp 蛋白激酶亚基 ClpA 中 ; 另一个突变体 CA 2 2 3M 累积 PHA 减少 ,在各种 C 源上生长量也降低 , Tn5 的插 入影响了 I型氨基转移酶
1. 5   菌株的遗传改良
[ 19 ]



   利用转座载体可以将目的基因导入受体菌株的质

粒或者染色体并且使外源基因稳定地表达和遗传 , 该 方法可以将菌株进行遗传改良 。
1. 5. 1  杀 虫 工 程 菌 株 的 构 建  张 杰 等
[ 20 ]

分别用

子系统将 cry1A c基因导入 P. fluorescens P303 菌株 。工 程菌对小菜蛾显示出较强的毒杀活性 , 对棉铃虫初孵 幼虫也具有明显的毒杀作用 。利用冰核细菌促冻杀虫 在理论上已确凿无疑 , 但难以应用野生型冰核细菌冻 杀田间和仓储越冬害虫 , 唐朝荣等
[ 21 ]

细菌冰核基因 iceA ,构建了能进行转座作用的重组质粒 到阴沟肠杆菌 ( En terobacter cloacae ) 染色体上 , 成功构 建了在无选择压力下冰核基因仍稳定存在并有效表达 冰核活性的促冻杀虫基因工程菌 , 为防治我国西北 、 华 北和东北地区农林果树和仓储主要越冬害虫 , 开辟了 一条生防新途径 。
1. 5. 2   抗病工程菌株的构建  利用 Tn5 转座子将 2, mob 2Tn5 2iceA, 又利用该重组质粒将冰核基因 iceA 整合 DAPG) 合成基因簇分别整合到野生 P. fluorescens P32, DAPG阳性菌 CPF 2 和 2P24 的抗生素产量可显著提 10
[ 22 ]

高 。番茄青枯病菌 、 小麦全蚀病菌 、 棉花立枯病菌的平 的提高对防治病害具有增效作用 。

板抑菌实验和温室防病实验结果说明 , 2, 4 2 DAPG产量
1. 5. 3   降解多种农药工程菌的构建  W u 等
[ 23 ]

座子载体 pUT /m ini2Tn5, 将来源于对 γ2 氯环己烷有 六 降解作用的鞘胺醇单胞菌 BHC 2 的脱氯化氢酶基因 A 制 ,而现在转座子突变技术已经成为微生物分子遗传 学研究的有力工具之一 。用此方法分离基因的好处在 于不需要鉴定待测基因的产物 , 只要转座因子插入可
6 中 ,筛选到的多功能遗传菌株 DJL 2 可以同时降解 6A

DAPG阴性菌 P32 可以产生抗生素 2, 4 2 DAPG, 2, 4 2

4 2 乙酰基间苯三酚 ( 2, 4 2diacetylphloroglucinol, 2, 4 2 二 CPF 2 和 2P24 的 染 色 体 上 , HPLC 结 果 表 明 2, 4 2 10

Pseudom onas2E. coli 穿梭载体 pUCP18 /19 和 Tn5 转座

利用自行分离的

利用转

2  结语和展望

   最初 ,体外转座技术的开展只是为了研究转座机

linA 引入对多菌灵有降解活性的鞘胺醇单胞菌株 DJL 2

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引起表型变化的基因均可用此法分离鉴定 , 这对于那 些已知表型而未知其基因调控机制的微生物遗传学研 究尤为有利 。此外 , Tn5 转座子突变技术已经成为一种 成熟的研究方法 ,在发现新基因 、 研究基因的功能和构 建工程菌方面发挥了重要作用 。但是 , Tn5 随机转座突 变技术也存在局限性 , 比如插入位点的基因可能是已 知基因而并非新基因 , 转座区内的转录终止信号会影 响同一操纵元中下游基因的表达 , 使突变体表现多个 基因的复合性状 。 Tn5 转座突变结合基因同源重组技 术可以有效解决上述问题 , 在功能基因研究中成为不 可替代的工具 。因此 , Tn5 转座突变技术的广泛应用必 将对基因功能的研究起到巨大的推动作用 。

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strain

Acta M icrobiologica Sinica, 2008, 48 ( 1) : 45 ~50

Applica tion of Tn5 Tran sposon M utagenesis Technology in M olecular and Genetic Researches of Gram 2 nega tive Bacter ia

(B iotechnology Research Center, Kunm ing University of Science and Technology, Kunm ing 650224, China)

mutagenesis technology to genetic researches of bacteria were briefly discussed, including researches on biological of bacterial pathogens, characterization of metabolis regulatory genes and genetic imp rovements of bacteria. m gene  M etabolism regulatory gene  Bacteria i p rovem ents m

   近日 ,梅特勒 - 托利多在中国市场隆重推出内嵌 G P ExcellenceTM质量管理功能的新超越系列 XP天平 。继 2008 年推 W 出良好的称量管理规范 ( G P λ )后 ,梅特勒 - 托利多又在 2009 年将这一规范内置在超越系列 XP 天平中 ,推出了全新质 W 量管理系统 G P ExcellenceTM ,帮助客户避免风险 ,保证质量 ,降低成本 ,符合法规 。 G P ExcellenceTM集成了独特的安全功 W W 能 ,包含了砝码管理 、 测试程序管理 、 任务管理和测试数据记录储存等等实际功能 , 您只需将 G P λ 建议书或自己系统中 W 的标准操作规程 ( SOP)信息输入至天平 ,在天平触摸屏上轻触数次 ,就能轻松设置参数 ,确保天平始终正确而准时地进行测 试 ,确保您的流程符合法规和质量管理体系要求 。 G P ExcellenceTM质量管理功能不但包含在新超越系列 XP 天平中 ,对于 W 客户正在使用中的超越系列 XP天平也可通过升级的方式获得此项功能 。    获取更多有关 G P λ 的信息 ,请登陆 www. good 2 W weighing2 ractice. com。 p

  Abstract W ith developm ent of w ide 2host2range vector system s, Tn5 transposon and its derivative vectors
have been w idely app lied to genetic research of gram 2negative bacteria. The app lications of Tn5 transposon Key words   Tn5 transposon m utagenesis  B iocontrol mechanis  B acterial essential gene  V irulence m

control mechanis s of biocontrol bacteria, identification of bacterial essential genes, discovering virulence genes m

G P Excellence 超越系列 XP天平新增质量管理功能 W
避免风险 保证质量 降低成本 符合法规

N I N Hong2juan  CHEN L i2 ei L I Kun 2zhi A m
T M

hexachlorocyclohexane and carbendazim by transposon m ini2Tn5.


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