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pSIMPLE-18 EcoR V BAP Vector


TaKaRa Code:D105A

pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector

说明书

宝生物工程(大连)有限公司


内 容
●制品说明 ●制品内容 ●保 ●纯 ●用 存 度 途


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●pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 的结构 ●实验操作
■Control DNA 片段的克隆实验 ■一般 DNA 片段的克隆实验

●相关说明 ●使用注意 ●Q&A

●制品说明
pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 是一种高效克隆末端平滑 PCR 产物的专用载体。本载体由 pUC18 载 体改建而成, 它消除了 pUC18 载体上的多克隆酶切位点, 再在多克隆酶切位点处导入了 EcoR V 酶切位点, 使用 EcoR V 将其切成末端平滑的线性 DNA 后,进行了 5’末端的去磷酸化处理,以避免克隆 DNA 片段 时产生大量载体自连现象。 本载体尽管消除了 LacZ 基因上的多克隆酶切位点,但不影响 β-半乳糖苷酶的正常表达,PCR 扩增片段克 隆于载体后仍可以利用 α-互补性进行蓝白菌落的筛选,挑选阳性克隆。 有很多高保真 DNA 聚合酶,如:TaKaRa Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu 等,其扩增的 DNA 片段为平滑末 端,可以方便使用本载体进行 DNA 克隆。由于本载体的 5’末端进行了去磷酸化处理,如果 PCR 扩增片 段的 5’末端不带磷酸基团时, 应对其进行 5’末端磷酸化 (可使用 TaKaRa DNA Kination Kit, TaKaRa Code:D402)处理后再使用本载体进行 DNA 克隆。 由于本载体上消除了多克隆酶切位点,当 PCR 产物使用本载体进行 DNA 克隆时,将无法使用载体上的限 制酶切下,需要在 PCR 扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用 PCR 扩增引物导入的酶切位点进 行 DNA 酶切时, 酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响, 可以大大提高酶切效率, 增加亚克隆成功率。 由于本载体以 pUC18 载体为基础构建而成,所以它具有同 pUC18 载体相同的功能。此外,本制品中的高 效连接液 Solution I 可以在极短时间内(约 5 分钟)完成连接反应,且此连接液可以直接用于细菌转化, 大大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert 2(500 bp)还可以用于 Control 反应。 本载体同样可以用于末端平滑的其他 DNA 片段的克隆。

●制品内容
pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector(50 ng/μl) Control Insert 2(50 ng/μl)*1 Solution I *2 20 μl×1 支 10 μl×1 支 75 μl×2 支

*1 本 DNA 片段与 EcoR V 酶切载体连接后, 可以使用 EcoR V 切下 DNA 片段。 *2 使用时请于冰中融解。

●保 ●纯

存: -20℃。 度

■ Control Insert 2 经克隆后的白色菌落中,有 90%以上含有 Insert DNA 片段。

●用



■ 平滑末端 PCR 产物的克隆。 ■ 其他平滑末端 DNA 片段的克隆。 ■ 对克隆后的DNA片段使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

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●pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 的结构

【pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 相关位点说明】
Cloning site 425 352~375 484~507 146~475 873~1461 1632~2492

BcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding site LacZ operator
ColE1 ori Ampr

●实验操作
■ Control DNA 片段的克隆实验 A)操作方法 1)在微量离心管中配制下列 DNA 溶液,全量为 5 μl。 pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector*1 Control Insert 2*2 dH2O 2)加入 5 μl(等量)的 Solution I。 3)16℃反应 30 分钟。 注) ① 室温(25℃)也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。 4)全量(10 μl)加入至 100 μl JM109 感受态细胞中,冰中放置 30 分钟。 5)42℃加热 45 秒钟后,再在冰中放置 1 分钟。 1 μl 1 μl 3 μl

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6)加入 890 μl SOC 培养基,37℃振荡培养 60 分钟。 7)在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8)挑选白色菌落,使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 注)此时也可以提取质粒,然后经 EcoR V 酶切鉴定插入 DNA 片段。 B)结 果 使用Control Insert 2 时的连接/转化结果如下,使用的感受态细胞的转化效率为:3×108 cfu/μg pUC19 DNA。 Control Insert 2 + - 连接/转化效率 (cfu/μg Vector) 1.45×106 1.1×105 白色菌落比率 (%) 97.9 43.5 效率(%)* 90 以上 0

* 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的插入效率。 ■一般 DNA 片段的克隆实验 1)在微量离心管中配制下列 DNA 溶液,全量为 5 μl。 pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector*1 Insert DNA*3 dH2O 2)加入 5 μl(等量)的 Solution I。 3)16℃反应 30 分钟。 注) ① 室温(25℃)也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。 ③ 长片段 PCR 产物(2 kbp 以上)进行 DNA 克隆时,连接反应时间请延长至数小时。 4)全量(10 μl)加入至 100 μl JM109 感受态细胞中,冰中放置 30 分钟。 5)42℃加热 45 秒钟后,再在冰中放置 1 分钟。 6)加入 890 μl SOC 培养基,37℃振荡培养 60 分钟。 7)在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8)挑选白色菌落,使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 *1 pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 的使用量 取 0.5 μl 也可得到满意的结果。 实际操作时, 可按需要确定载体的使用量。 pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 1 μl(50 ng)的摩尔数约为 0.03 pmol。 *2 Control Insert 2 Control Insert 2 为 500 bp 的末端平滑 (5’ 磷酸化) PCR 产物, μl 的 Control Insert 2 1 (50 ng) 的摩尔数约为 0.15 pmol。Control 实验后确认阳性克隆时,可以使用 PCR 法。 *3 Insert DNA 的使用量 进行克隆时,Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为 1 :2~10。 up to 1 μl 0.1 pmol~0.3 pmol 5 μl

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●相关说明
1. 感受态细胞的选择。 转化时请使用高效的热转化感受态细胞(转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19) ,这样才可能得到比较理想 的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时,宿主细胞必须具有正确的基因型(F’编码的[LacZ△M15] ) 产生 ω Fragment,才可能和载体 DNA 产生的 LacZ α多肽相结合,表现出 β-半乳糖苷酶活性(α-互补 性) 。 2. Insert DNA 的要求。 Insert DNA 无论是通过 PCR 方法得到,还是通过限制酶酶切方法得到,都应该进行切胶回收的纯化处理 后才进行载体连接,尽量避免引物、接头及其它杂质的存在。切胶回收时可使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒 (TaKaRa Code: D301 或 DV805A) 此外, pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 连接的 Insert DNA 。 与 的 5’末端需要带有磷酸基团,否则连接反应无法进行。限制酶酶切得到的平滑末端 DNA 片段的 5’末 端已具有磷酸基团,无需进行加磷反应;使用 TaKaRa Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu 等 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增得到的平滑末端 DNA 片段的 5’末端一般没有磷酸基团 (引物进行 5’磷酸化标记时除外) 此 , 时需要对 DNA 片段进行 5’磷酸化标记 (可使用 TaKaRa DNA Kination Kit, TaKaRa Code: D402) 。 3. Insert DNA 使用量的计算方法。 进行克隆时,Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为 1:2~10,我们可以根据自己的实验情况 选择合适的 Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比。Insert DNA 使用量的计算方法如下: Insert DNA 的使用量(ng)=nmol 数×660×Insert DNA 的 bp 数 本载体 1 μl(50 ng)的摩尔数约为 0.03 pmol。 4. 阳性克隆的检测。 DNA片段成功插入至pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector中后,一般情况下 β-半乳糖苷酶的表达将受到 破坏,重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比 较短的DNA片段插入载体时,基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合,克隆体也会显示蓝色菌 落。有报道称,2 kbp的DNA片段插入到载体中后,重组克隆体仍显示了蓝色。所以,当我们没有得到白 色菌落时,可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时,我们建议使用PCR的方法,扩增用引物可以使 用BcaBESTTM Sequencing Primers,可以对菌体直接进行PCR扩增。 5. 阳性对照实验。 为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性,我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法,使 用试剂盒中提供的 Control Insert 2,可以进行 10 次阳性对照实验。 6. 转化效率的计算。 取 0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至 100 μl的热转化感受态细胞中后,再加入 900 μl的SOC培养基 (0.1 ng DNA/ml) ,将上述培养液稀释 10 倍后(0.01 ng DNA/ml)取 100 μl涂布平板(0.001 ng DNA/100 μl) 记录菌落数。 , 以得到 200 个克隆体为例计算转化效率, 此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。

●使用注意
1. 由于载体上的多克隆酶切位点被破坏,所以使用本载体克隆 PCR 产物时,注意应在 PCR 引物上设 计导入酶切位点,否则将会难以切下 DNA 片段进行其它亚克隆实验。

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2.

为了避免载体自连, 本载体进行了去磷酸化处理, 因此 Insert DNA 片段的 5’端必须保证带有磷酸 基团,否则无法进行连接。TaKaRa Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu 等 DNA 聚合酶扩增的 PCR 片段 须经过磷酸化处理后才能进行连接反应(引物的 5’端进行磷酸化标记时除外) 。

3. 4. 5.

Solution I 请于冰中融解。 克隆时使用的 Insert DNA 片段(PCR 产物)建议进行切胶回收纯化,否则 PCR 产物中的短片段 DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段) 、残存引物等杂质都会影响克隆效率。 按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或 准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化 DNA 后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用核酸 共沉剂(TaKaRa Code:D605A)可以提高 DNA 的回收率。

6. 7.

连接反应请在 25℃以下进行,温度升高(>26℃)较难形成环状 DNA。连接效率偏低时,可适当 延长连接反应时间至数小时。 本制品来源于 pUC18 载体,因此,适合 pUC18 载体的感受态细胞都可以使用,如:JM109 等。

●Q&A
Q-1 怎样提高连接转化效率? A-1 1. 确认 Insert DNA 片段是否为平滑末端。大部分的高保真 DNA 聚合酶(如:TaKaRa Pyrobest、 KOD、Pfx、Pfu 等)扩增的 PCR 产物是平滑末端,但一般的 DNA 聚合酶(如 Taq 酶等)扩增 的 PCR 产物在 3’端都带有“A”尾,不能直接克隆于本载体。 2. 纯化 PCR 产物。最好使用切胶回收的 PCR 片段,以除去 PCR 产物中的非特异性片段和引物等 杂质。 进行切胶回收时可以使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒 (TaKaRa Code: D301 或 DV805A) 。 3. 确认 DNA 片段 5’末端是否磷酸化。 4. 请使用转化效率大于 108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。 5. DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段 DNA 的克隆 效率(连接效率与转化效率)偏低,此时可以延长连接反应时间,或采用电转化方法。 6. 进行切胶回收纯化 DNA 片段时,不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。 7. Solution I 应尽量避免反复冻融。 8. 建议使用新配制的平板培养基。 Q-2 转化后的菌落全为蓝色,但有目的 DNA 片段的插入,为什么? A-2 插入的 DNA 片段较短(小于 500 bp) ,且插入片段没有影响 LacZ 基因的读框,此时平板培养基上 出现的菌落有可能呈现蓝色(或淡蓝色) 。 Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时,使用何种引物? A-3 本载体来源于 pUC18 载体。因此,用于 pUC18 载体测序的通用引物都可以使用。 Q-4 限制酶酶切片段的 5’端是否带有磷酸基团?可否直接与本载体进行连接? A-4 限制酶酶切片段的 5’末端都带有磷酸基团,如果是平滑末端的酶切片段,经纯化后可以直接与本载 体进行连接,无需另外进行磷酸化处理。如果是粘性末端的酶切片段,需要先进行末端平滑处理后才 能与本载体连接。 Q-5 目的 DNA 片段要亚克隆至其它载体(如:表达载体等) ,酶切位点应怎样选择? A-5 因载体上无多克隆酶切位点,进行亚克隆时,酶切位点可以根据亚克隆载体的情况进行选择。进行 PCR 扩增时,应在 PCR 扩增用引物上预先导入合适的酶切位点,克隆至本载体后再使用该限制酶切 下目的 DNA 片段,然后克隆至目的载体中。

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技术咨询热线:
0411-87641685,87641686 8008909508,4006518769

宝生物工程(大连)有限公司
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V2010.02

本制品仅供研究用。请勿用于人体及动物的医疗、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂


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