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易错PCR技术在淀粉酶定向进化中的应用


易错 PCR 技术应用于酶体外进化的研究进展
沈思军 1*,马春萍 2,哈杰提 2,马全磊 1 (1. 石河子大学动物科技学院,新疆,石河子,832003;2. 新疆西部牧业股份有限公司,新疆,石 河子,832000)

摘 要:易错 PCR 技术是通过调整 PCR 反应条件,产生随机错配而引入多个突变。由于该技
术操作简单易行,广泛应用于

酶工程改造研究中。本文介绍了易错 PCR 技术的影响因素及近几年在 酶工程改造中的应用进展。

关键词:易错 PCR 技术;影响因素;酶工程改造 在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。 常用的方法有易错 PCR (error-prone PCR) 、 DNA 重排 (DNA shuffling) 、 交错延伸法 (staggered extension process, StEP) 、随机引物体外重组(random-priming in vitro recombination, RPR) 、易错滚环扩增 法(error-prone rolling circle amplification, EP-RCA) 、序列饱和诱变(sequence saturation mutagenesis, SeSaM) 、随机插入/删除的链交换突变(random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE)等[1]。基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变 的酶,在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。易错 PCR 是通过改变 PCR 条件,提 高扩增产物的三大错配率,从而获得与原来不同的 DNA 序列或基因[2],其操作简便易 行,成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。本文就易错 PCR 过程中影响突变率的 因素和易错 PCR 技术在酶分子进化中的应用这两个方面,综述国内近几年的研究进展。

1. 影响易错 PCR 突变率的因素
易错 PCR 技术是结合随机突变与定向筛选,利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3`→5`校 对功能的特点,在 PCR 反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变,在特定培养基 或培养条件下定向选择所需酶的方法。 从而获得天然生物催化剂所不具备的某些优良特 性或产生新的催化能力[2]。为提高易错 PCR 引入突变的效率,常采用改变 Mg2+、Mn2+ 离子浓度、调整 4 种的 dNTPs 比例、多轮扩增等方法。 1.1 离子浓度 在 PCR 反应过程中, 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大。 Mg2+浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性,稳定非互补配对的碱基对,增加产量;浓度过低则影响 PCR 扩增产量 甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 Mn2+是很多 DNA 聚合酶的诱变因子, 加入 Mn2+ 可以降低聚合酶对模板的特异性,提高错配率。调整 Mg2+和 Mn2+离子浓度,可以获得 不同突变频率的多样性文库[3]。标准易错 PCR 中 Mg2+浓度为 7mmol/L,而 Mn2+浓度根 据不同的模板和扩增片段长度的要求,浓度范围在 0.1-0.5mmol/L 之间。刘治江等[4]利 用易错 PCR 方法进行酶体外进化研究,在优化易错 PCR 条件时设定了不同的 Mg2+和

Mn2+离子浓度,通过扩增片段电泳检测结果确定了最佳扩增效率的 Mg2+和 Mn2+离子浓 度分别为 7mmol/L 和 0.5mmol/L。由于 Mn2+浓度受扩增片段的大小和扩增片段碱基组 成等因素的影响,所以没有固定推荐的 Mn2+浓度,建立不同 Mn2+浓度梯度的 PCR 反应 是优化易错 PCR 体系中最常采用的方法[5-9]。 1.2 四种 dNTPs 比例 易错 PCR 体系中,4 种 dNTPs 比例不是 1:1:1:1 ,改变 4 种 dNTPs 的平衡,主要 的目的是提高碱基错配的倾向性,降低扩增过程中聚合酶的保真性,获得更多的突变。 易错 P F 的变化带有强烈的倾向性,碱基 A、T 突变为 G 和 C 的变异率高。有研究表明 增加 dTTP 和 dCTP 浓度的致突变效果优于增加 dATP 和 dGTP 的效果[10,11], 因此在标准 的易错 PCR 体系中 4 种 dNTPs 比例 dATP\dGTP:dTTP\dCTP=1:5。为了简化易错 PCR 优化过程,高义平等[12]检测了在不添加 Mn2+、不调整其它任何 PCR 成分,只降低 1 种 dNTP 浓度的条件下体外诱变,结果显示随着 dATP 浓度的降低,序列变异率和碱基突 变率均成升高趋势,且主要引起 AT→GC 的变异。 1.3 多轮 PCR 易错 PCR 是一种简便快速的在 DNA 序列中随机引入突变的方法, 是最常的无性突 变技术。该技术的关键是控制诱导片段的突变率[13]。为了有效地积累有益突变,常采用 二轮 PCR 的方法,以第一轮易错 PCR 产物为模板,不改变 PCR 体系的扩增条件进行第 二轮 PCR[14-16]。

2.易错 PCR 在酶体外定向进化中的应用
随着分子生物技术的发展,利用基于 PCR 的方法进行酶分子改造已经取得了大量 突破性成果。通过定向进化对酶进行改造后显著提高了酶的特性,获得了特定功能的工 业酶。利用该方法产生的突变型 β-葡聚糖酶的最适 pH 由 7.7 变化至 5.5,且保持了原有 的耐热性和比酶活[17]。SPT3 定向进化的菌株 M25 在 10%的乙醇中生长良好,且提高 了利用 125g/L 的葡萄糖进行乙醇发酵时的乙醇产量[9]。 黄瑛等利用易错 PCR 方法得到 的突变型脂肪酶其比活力比野生型脂肪酶提高了 1.31 倍[18]。β-甘露聚糖酶是一种半纤 维素酶类,可水解半乳甘露聚糖等,可广泛用于造纸、印染等行业,吴秀秀等从易错 PCR 方法建立的 β-甘露聚糖酶突变文库中筛选耐酸、耐高温的菌株,并结合 DNA 改组 技术获得了特定条件下高酶活的菌株[19]。 越来越多的研究利用易错 PCR 进行酶体外进 化,这表明该技术是改造酶分子切实有效的方法,在酶的体外高效定向进化研究中有较 好的应用前景。 参考文献:

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