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慢病毒转染手册


慢病毒(Lentivirus)载体是以 HIV-1(人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发 展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细 胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因 有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感 染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、

干细胞等多种类型的 细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常 理想,因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。 由于有些类型细胞脂质 体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达 的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建 能够表达 siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体 有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA, 在长期稳定表达载体的细胞中, 甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。 在所构建的 siRNA 表达载体中, 是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的, 这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列, 而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在 转录产物 3’端形成 1~4 个 U。U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖 的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~ 21ntRNA 和~50ntRNA 茎环结构(stem loop) 。在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA;也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体 包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4~5T 转录终止位点之间的茎环结构序列, 转 录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ’ 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA。构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法,寻找高效的 siRNA,然后 从中挑选符合载体要求的序列,将其引入 siRNA 表达载体。 慢病毒载体

慢病毒载体(Lentiviral vector)较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病 毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分 化的后代细胞中表达 shRNA,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳 定的基因表达的功能性沉默, 为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究 基因功能, 以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒作为 siRNA 的携带者,不但具备特异性地使基因表达沉默的能力,而且充分发挥了慢病毒载 体自身所具备的优势,为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 慢病毒表达载体 包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所 有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴 度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病 毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后, 可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整 合到基因组,从而高水平的表达效应分子。 慢病毒载体与其它常见病毒载体的特征比较 目前常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能 感染分裂期细胞,而且容量有限,腺病毒一般不能整合到染色体上,只能进行瞬 时感染。与其它逆转录病毒相比,慢病毒(LV)具有可以感染非分裂期细胞、 容纳外源性基因片段大,可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细 胞免疫应答,可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能 持续数月,且无可观察到的病理学现象。[1]

病毒表达系统 病毒基因组

腺病毒表达系统 双链 DNA 病毒

慢病毒表达系统 RNA 病毒 病毒基因组整合

逆转录病毒 RNA 病毒 病毒基因组整 合于宿主基因 组,长时间、稳 定表达外源基

病毒基因组游离于 于宿主基因组, 长 是否整合 宿主基因组外,瞬 时间、 稳定表达外 时表达外源基因 源基因

因 感染分裂细胞, 感染分裂和不分裂 感染细胞类型 细胞 裂细胞 表达效率低 表达丰度 表达时间 高水平表达 快(1-2 天) 滴 滴度 1012pfu/ml 可插入高达 8kb 的 外源片段,滴度随 克隆容量 插入片段长度增加 而降低 免疫原性 高免疫原性 滴度随插入片段 长度增加而降低 低免疫原性 可产生转基因动 不能得到转基因动 动物模型 物 上 可以更换特异性启 启动子 动子 能 否 用 于 可以 MIRCORNA 能否用于四环 不可以 素诱导 系统的目的与意义 ● 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大 大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增 加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 ● 进行稳转细胞株的筛选; TET-OFF TET-ON , 不可以 可以 不可以 启动子 可以更换特异性 不需要启动子 物,效率达 50 以 可以,但很难 低免疫原性 6kb 的外源片段 10TU/ml 可插入不超过 8kb 的外源片段, 可插入不超过 10TU/ml 度 高 达 高水平表达 慢(2-4 天) 最高可达 109- 高水平表达 快(1-2 天) 最高可达 109- 感染分裂和不分 但在干细胞中

● 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液; 解决的问题 ● 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大 大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增 加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 ● 进行稳转细胞株的筛选; ● 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液; 在细胞相关的实验操作中, 对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细 胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效 瞬时表达。

细胞相关的实验 实验目的 对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞, 通过病毒介导的实验能 够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达。 实验流程 1. 根据目的基因相关信息(序列,序列号等) ,构建含有外源基因或 siRNA 的重组载体; 2. 对于测序正确的重组质粒, 提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒; 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T 细胞,进行病毒包装和 生产,收集病毒 液; 4. 浓缩、纯化病毒液; 5. 用高质量的病毒液感染细胞; 6. 通过定量 PCR 精确测定病毒滴度(高精确滴定方法)和 Western 分析 实验结果; 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞;检测基因功能或者 siRNA 的沉默效率 以及使用药物进

行稳定转染细胞株的筛选,通常状况下,筛选的细胞克隆株具有长期的表达 稳定 性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。

慢病毒使用操作手册

1 慢病毒使用操作 2 慢病毒安全使用规范 3 悬浮细胞感染方法概要 4 相关专业术语 5 细胞培养器皿的相关参数

1、慢病毒使用操作手册 1.1 慢病毒的储存与稀释: 1.1.1 病毒的储存: 用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验, 可以将病毒暂 时放置于 4 ℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使 用封口膜封口) A.病毒可以存放于-80℃ 6 个月以上;但如果病毒储存时间超过 6 个月, 我们建议在 使用前需要重新滴定病毒滴度 B.反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度 10%;因此在病毒 使用过程中 应仅尽量避免反复冻融, 为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照 每次的使用量

进行分装。 1.1.2 病毒的稀释:用户需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后, 使用培养目的细 胞用 PBS 或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后 4℃ 保存(请尽量 在三天内用完) 分装后使用。 1.2 慢病毒用于体外(In Vitro)实验:感染培养原代细胞和建系 细胞 1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同,用户使用 Invabio 提供的慢 病毒之前可以通过 查阅相关文献,了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数(MOI 值) 以及在体(In Vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,可以通过感 染预实验得到合适的感染复数(MOI 值) (使用 24 孔板检测病毒对目的细胞的 亲嗜性) 1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验 1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A.测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高 的细胞(HEK293T,Hela)作为平行实验的对照细胞。 B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用)稀释; 理论上,含有 血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 C. Invabio 提供的病毒单位为 TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病 毒颗粒数。如: 病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有 1X108 个具有生物 活性的慢病毒颗粒。

1.2.2.2 以 24 孔培养板为例,进行目的细胞和 HEK293T 细胞的感染预实验

实验前按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据 MOI 和细胞数量计算所需要

的病毒量,如 有必要可以使用 PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液 第一天,准备细胞:在 24 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3~5X104 个目的细胞,铺板时细胞的融合率为 50%左右,每孔培养基体积为 100 ?l;进 行病毒感染时细胞的融合度约为 70%左右。

第二天,准备病毒:取出 4℃保存的病毒,使用台式离心机离心 20 秒(使 病毒完全悬于 离心管底部即可) ;如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化 后使用。 亦可以根据实验 室的实际情况将按照 MOI 准确计算好的慢病毒稀释到 培养基中,并尽可能保证所获得的含有 慢病毒的培养基的总体积为最小体积, 以期获得最佳的感染效率。 第二天,感染目的细胞:病毒准备好之后,从培养箱中拿出细胞,首先观察 细胞生长状态,如细胞状态较好则开始实验 a 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基 b 吸去培养基的培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好,密度适宜,则不 用换液) c 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液 d 混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)孵育过夜 注:感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证 加病毒之前细胞处于良好的生长状态 亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的 混合液直接加入培养器皿中 慢病毒对目的细胞的感染效率较低,通过提高 MOI 值可以提高病毒的感染 效率, 但是当 MOI 高于 20 时, 我们建议客户在培养基中加入 ploybrene ?g/ml (8 左右)来提高病毒的感染效率。 A.第三天,更换培养液:一般在 24 小时候后将含有慢病毒的培养液更换 成正常培养液;在 感染后观察细胞状态,如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而 影响细胞生长状态, 可以最 短在加病毒 4 小时候更换新鲜培养液后继续培养 (建 议在 8-12 小时更换为宜) 。第一次换 液后,如果慢病毒对细胞没有明显毒性作 用,按照正常培养条件培养换液。 B.第六天,感染效率检测:在倒置荧光显微镜观察荧光,估计慢病毒感染

目的细胞的效率; 如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带 Marker Gene 的,可以 通过 Real-time RT-PCR 检测目的基因的表达来拍评估感染效率。 注意: Invabio 提供的病毒载体上带有 GFP 绿色荧光蛋白,用户可以在病毒感染 96 小时后用倒置 荧光显微镜观察 GFP 绿色荧光,以观察病毒对目的细胞的感 染情况。 如果慢病毒载体携带其他 Marker Gene 如 RFP\BFP 可以用荧光显微 镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况 慢病毒表达时间较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染后 96 小时后观测 荧光表达。感染 后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光的表达时间和表达 强度来确定慢病毒对目的细胞 的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对 细胞进行及时换液,以保证细胞良好的生长状态。 2、慢病毒使用安全使用规范 Invabio 提供的慢病毒为“自杀”性病毒,即病毒感染目的细胞后不会再感染 其他细胞,也不 会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。 慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外 源性目的基因所 取代,属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生 物学危险, Invabio 建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经 完全公认某个基 因肯定没有致癌性, 否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 如有疑问, 请与我们联系。 使用时请参照如下所示进行实验: 2.1.病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒, 请不要打开排风机。 2.2.病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。 2.3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有 病毒

污染, 请立即用 70%乙醇加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。 接触过病毒的枪头, 离心管,培养板,培养液请于 84 消毒液或 1%SDS 中浸泡过夜后弃去。 2.4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培 养 板。用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验 台之前,用 70%乙醇清理显微镜实验台。 2.5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心, 而且尽量使用组织培养室内的离心机。 2.6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。 3、悬浮细胞感染方法概要 1.1 根据细胞的量将细胞在 1.5ml 管中离心收集然后用 100-200ul 的无血 清培养液稀释细胞 沉淀,以细胞完全浸没在培养基中为准 1.2 按照 MOI 换算病毒颗粒数量,吸取病毒液加入细胞中,将 1.5ml 管放 在 37℃度培养箱 中孵育 30 分钟 1.3 将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里 1.4 加入足够量的新鲜培养液 1.512 小时后换液 1.696 小时后观察细胞阳性率 4、相关专业术语 (详情可参考公司网站 FAQ) 常用术语: MOI:病毒感染复数传统的 MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义 是感染时噬菌体 与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量 单位为 pfu。 一 般 认 为 MOI 是 一 个 比 值 , 没 有 单 位 , 其 实 其 隐 含 的 单 位 是 pfu number/cell。后来 MOI 被

普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值,本 手册中提到的 MOI 都是沿用这个概念。 然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使 MOI 产生了不同的 含义。能产生细 胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用 pfu 表示病毒数量,因 此其 MOI 的含义 与传统的概念相同。 MOIstands for "Multiplicity of Infection." It is the ratio of infectiousvirus particles to the number of cells being infected. The recommended MOI isin the range of 0.1 (meaning that you inoculate 1 virus particle for every 10cells) to 0.01. The general theory behind MOI is to introduce one infectiousvirus particle to every host cell that is present in the culture. However, more than one virus may infect the same cellwhich leaves a percentage of cells uninfected. This occurrence can be reduced by using a higherMOI to ensure that every cell is infected. 5、细胞培养器皿的相关参数

Flask/Dish 96 well plate 48 well plate 24 well plate 12 well plate 6 well plate 35mm 60mm 100mm

Surface (mm) 50 100 200 401 962 962 2827 7854

Cell number 1.5-5.0×10 3.0×104-1.0×10 8.0×104-2.0×10 1.6-4.0×10 3.0-8.0×10 3.0-8.0×10 1.0-2.5×10 2.5-6.4×10

Media Volume 100 ?l 200 ?l 500 ?l 1.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 6.0 ml 10.0 ml

慢病毒载体的包装与纯化

1 实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒, 四种质粒载体分别进行高 纯度无内毒素抽提,共转染 293T 细胞,转染后 8 h 更换为完全培养基,培养 48h 后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓 缩液,感染 Hela 细胞后定量 PCR 检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度 的要求不同,生产过程中可以通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。 2 实验材料 2.1 慢病毒载体、包装细胞和菌株 慢 病毒 载 体系 统( Tronolab ) 该病 毒包 装 系 统为 四 质粒 系统 , 组 成 为 pRsv-REV, pMDlg-pRRE,pMD2G, 目的干扰质粒。其中目的干扰质粒能表 达绿色荧光蛋白(GFP). pRsv-REV, pMDlg-pRRE,pMD2G 含有病毒包装 所必须的元件. 细胞株 293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养 基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 2.2 主要试剂 试剂名称 生产厂家 货号 包装细胞 293T 细胞株 中科院上海细胞所 大肠杆菌菌株 DH5α Invitrogen 公司 胎牛血清 Invitrogen 公司 胰蛋白酶 Invitrogen 公司 限制性内切酶 Fermentas

T4DNA 连接酶 NEB 公司 M0202V 质粒 DNA 提取试剂盒 Axygen 公司 制备感受态试剂盒 BIOSCIENCES 凝胶回收试剂盒 Qiagen 公司 1kb/100bpladder Fermentas 2.3 主要仪器 仪器名称 生产厂家 货号 PCR 仪 Applied Biosystems 公司 电泳仪 Bio-rad 公司 荧光倒置显微镜 奥林帕斯 冷冻超速离心机 Hitachi 细胞培养箱 healforce 凝胶成像仪稳压 DNA 电泳仪 Tianneng 恒温摇床 上海博讯仪器

电热恒温培养箱 上海博讯仪器 移液器 eppendorf 电热恒温水浴锅 上海一恒实验设备有限公司 数码凝胶处理系统 天能科学仪器 一次性平皿 Cell-star 烧瓶 3 慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱 该病毒包装系统为四质粒系统, 组成为 pRsv-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G, 目的穿梭质粒。 其中穿梭质粒 (目的穿梭质粒) 含有能表达绿色荧光蛋白 (GFP) ; pRsv-REV, pMDlg-pRRE,pMD2G 含有病毒包装所必须的元件。 3.1 穿梭质粒:目的穿梭质粒 3.2pRsv-REV 3.3pMDlg-pRRE 3.4pMD2G 4 慢病毒生产实验步骤 4.1 慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的 293 T 细胞,细胞密 度为 0.5×10 时;重新接种于 25 mL 的 15cm 细胞培养皿,37℃,50 mL/L CO2 培养箱内培养; 4.2 制备慢病毒包装系统中四种质粒 DNA 溶液; pRsv-REV 10 ?g, pMDlg-pRRE 15 ?g, pMD2G 7.5 ?g, 干扰质粒 20 ug 加入无菌水定容至 1800 ?L, 再加入 CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液 200 ?L, 混匀,

加入 2×BBS 缓冲盐溶液 2000 ?L,室温放置 20~30 min; 4.3 当细胞密度达 60%~70%时转染. 将 DNA 和磷酸钙混合液转移至含单 层细胞的培养液中, 混匀, 培养 12 h 后弃去含有转染混和物的培养液, 加入 PBS 15 mL,轻摇后弃去,重复该步骤 3 次.; 4.4 每瓶细胞中加入含 100 mL/L 小牛血清的细胞培养液 15 mL,继续培养 48 h.; 4.5 收集转染 72 h 的 293T 细胞上清液; 4.6 将收集的上清液于 4℃,4000 g 离心 10 min,收集上清液; 4.7 将各种不同 RNA 干扰质粒上清液以 0.45 ?m 滤器过滤; 4.8 于 40 mL 超速离心管中,4℃,25000 r/min 离心 20 min; 4.9 而后以冰 PBS 液, 分别溶于 500ul Dmem,和 500ul PBS 重旋病毒沉淀于 4℃ 溶解过夜

参考资料 慢病毒与腺病毒、逆病毒特征比较 http://www.inovogen.com/uploads/


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