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微生物降解纤维素的研究概况


中国农学通报

2010,26(01):231-236

Chinese Agricultural Science Bulletin

微生物降解纤维素的研究概况
文少白, 李勤奋, 侯宪文, 李光义, 晓 邓
(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 海南儋州 571737)

>摘 要: 纤维素的资源化利用是当前研究的热点。微生物作为处理纤维素的一种手段, 由于其对环境危 害小, 且能实现资源的再利用而越来越受到重视。阐述了国内外纤维素酶对纤维素降解机制的研究进 展, 高效纤维素降解菌的选育及其混合菌群构建的研究概况。弄清纤维素酶的作用机制是关键, 此外分 离和选育出针对不同行业的高效纤维素分解菌种, 研究不同来源纤维素酶以及不同菌种之间的协同作 用, 弄清菌株与菌株之间的关系及其在降解发酵过程中的作用, 以达到构建高效稳定的纤维素降解菌群 的目的, 从而为实现纤维素的资源化利用提供科学的基础保障。 关键词: 微生物; 降解; 纤维素; 纤维素酶 中图分类号: X-1 文献标识码: A 论文编号: 2009-1564

Abstract: Resource utilization of cellulose has become hot topic. Due to less damage to the environment and

(Environment and Plant Protection Institute, CATAS, Danzhou Hainan 571737)

Wen Shaobai, Li Qinfen, Hou Xianwen, Li Guangyi, Deng Xiao

Recent Advances in Microbial Degradation of Cellulose

realization of resource recycling, microorganism, as a way of degrading cellulose, was given more and more emphasis. Progress on the mechanism of cellulose degradation by cellulase, selecting the efficient cellulose-degrading microorganism and construction of composite microbial system were summarized in this paper. The attention should be paid was fully comprehending mechanism of cellulase action, which was the key isolation and selection high efficient cellulose-decomposing strains aiming at different industries and figuring guarantee for resource utilization of cellulose. 0 引言 纤维素是由 D-葡萄糖以β-1,4 糖苷键结合起来的 链状高分子化合物, 具有不溶性的刚性结构, 在常温下 不溶于水、 也不溶于稀酸和稀碱 , 在自然条件下分解 缓慢。全球每年产生的纤维素高达 1000 亿 t , 中国农
[2] [1]

issue of research. Added to this, study on cellulose with separate sources and synergistic effect among strains, out the relationship between strains and its action during fermentation should be laid stress on. The above Key words: microorganism, degradation, cellulose, cellulase 利用, 利用率极低, 在浪费能源的同时对环境造成了污 染[3-4]。目前, 对于纤维素的利用主要是通过化学或生 物处理从而实现资源化。微生物分解纤维素是纤维素 生物处理技术的核心, 早在 1912 年人们就开始对其进 行研究。但真正利用微生物分解纤维素的研究开始于 20 世纪 60 年代, 当时主要利用微生物分解纤维素生产 单细胞蛋白; 70 年代以后, 到 随着能源危机和环境污 aspects were helpful for building efficient and stable cellulose-degrading strains and provided scientific base

作物秸秆量达到 6 亿 t, 林木枝桠和林业废弃物年可获 得量约 9 亿 t, 但这些资源大部分通过简单的焚烧方式

基金项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 “热区几种大宗农业固体废弃物肥料化/基质化利用技术研究” (No.2008 hzs1j006) 。 第一作者简介: 文少白, 1983 年出生, 男, 汉族, 硕士生, 主要从事环境微生物研究。通信地址: 571737 海南省中国热带农业科学院环境与植物保护研 究所李勤奋课题组, E-mail: wenshaobai@163.com。 通讯作者: 邓晓, 1976 年出生, 女, 汉族, 助理研究员, 硕士, 主要从事农业环境保护研究。通信地址: 571737 海南省中国热带农业科学院环境与植物 保护研究所李勤奋课题组, 0898-23306827, Tel: E-mail: dx0928@yahoo.com.cn。 收稿日期: 2009-08-03, 修回日期: 2009-08-29。

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中国农学通报 http://www.casb.org.cn 1 纤维素降解机理研究 有关纤维素降解机理的研究有很多, 但纤维素酶 将天然纤维素转化成葡萄糖过程中的细节至今仍不清 楚。目前, 关于纤维素的降解机理主要有以下几种。 1.1 C1-Cx 假说 1950 年 Reese 等人就对纤维素酶的作用方式提出 了一个著名的 C1-Cx 假说, 其基本模式[1]可以表述为:
C1 Cx 无定形纤维素 可溶性产物 β-葡萄糖苷酶 可溶性产物

染, 研究的重点又逐步转移到开辟新能源和防止环境 污染上来。近二三十年来, 在纤维素酶菌株的选育、 纤 维素酶组分及降解机制、 纤维素酶合成的调节和控制 以及纤维素酶应用等诸多分枝课题都取得了很大的进 展。笔者就纤维素酶对纤维素降解机制的研究进展, 高效纤维素降解菌的选育及其混合菌群构建的研究概 况进行了综述。

结晶纤维素

该学说认为, 1 酶首先作用于结晶纤维素, C 使形成 结晶结构的纤维素链开裂, 长链分子的末端部分离, 使 其转化为非结晶形式, 从而使纤维素链易于水解; Cx 酶随机水解非结晶纤维素, 可溶性纤维素衍生物和葡 萄糖的β-1,4-寡聚物; β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维 三糖水解成葡萄糖 。 1.2 协同理论 协同理论是目前被大多数学者所普遍接受的理论 。 该理论认为: 纤维素降解是由 EG(内切葡聚糖酶)、 CBH(外切葡聚糖纤维二糖水解酶)和 CB(纤维二糖酶 或β-葡萄糖苷酶)共同作用的结果。其酶反应的顺序 机理: 内切葡聚糖酶首先进攻纤维素的非晶区, 形成外 切纤维素酶需要的新的游离末端, 然后外切纤维素酶 从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位, β-葡萄糖苷 酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。 1.3 原初反应假说 在对褐腐菌降解纤维素的研究过程中发现, 褐腐 菌降解结晶纤维素的早期阶段纤维素的机械强度大幅 度降低, 但只有极微量的重量损失和很少的还原糖生 成。这与纤维素酶解时的聚合度降低而还原糖增加现 象明显不同, 因此 Coughlan 提出了结晶纤维素降解
[7] [6] [5]

后发生并同时反复进行的过程所组成。前者起始于纤 维素酶分子对纤维表面的吸附, 导致了分子链间氢链 断裂和单一基元纤维的分离, 造成纤维素聚集结构态 的改变, 是降解过程的限速阶段。后一过程水解单一 基元纤维链的糖苷键, 使其断裂, 形成可溶性糖类, 对 解链也有协同作用。 总的来说, 以上机理虽然在某些方面能很好的解 释微生物对纤维素的降解过程, 但也存在一些缺陷。 C1-Cx 假说对 C1 酶的作用机制并不清楚; 而协同理论 始终没有说明协同作用的起始反应是如何进行的, 特 别是对结晶区的降解机制没有很好的解释 [9]; 短纤维 形成现象早在 20 世纪 60 年代就己被发现, 但是否是纤 维素降解中第一步所必需的则一直处于争论中。因 此, 对于纤维素酶降解纤维素的机理研究仍然是当前 和今后一段时间的热点问题。 2 菌种的选育概况 2.1 自然界中菌株的筛选 从自然界筛选纤维素分解菌是构建高效纤维素分 解技术的基础性工作。为了获得酶活较高的野生纤维 素降解菌, 国内外科学工作者自 20 世纪 60 年代开始做 了大量的工作, 目前已筛选到很多纤维素降解菌, 主要 包括细菌、 放线菌和丝状真菌等。 文献报道的能降解纤维素的细菌有很多, 主 要 有 纤维粘菌(Cytophaga)和纤维杆菌(Cellulomonas) 两类[10]。具有降解纤维素能力的放线菌主要有纤维放 线 菌 (Acidothermus. Cellulolyticus)
[12] [11]

的多步骤学说(Multisteps), 该学说认为原初反应即无 序化反应使纤维素的结晶状态发生改变, 更便于随后 的纤维素[EG, CBH, GE]水解。 1.4 短纤维形成理论 该理论认为天然纤维素首先在一种非水解性质的 解链因子或解氢键酶作用下, 纤维素链内或链内的氢 键打开, 从而形成短纤维, 然后再在其他纤维素酶的作 用下进行水解。 1.5 其他理论 2002 年山东大学的高培基 概括纤维素酶降解机
[8]

、诺 卡 氏 菌 属

[13] (Ncardia) 和链霉菌属 (Streptomyces) 。真菌由于具

有较高的胞外酶活性且其酶种类比较全面使其有很强 的纤维素降解能力, 因此对其的研究报道比较多。己 报道的对纤维素作用较强的菌株多是木霉属 (Trichoderma )、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 青 霉 属 (Penicillium)、 顶 孢 霉 属 (Acremonium)、 斑 霉 属 枝 漆 (Myrothecium)、脉 孢 霉 属 (Neurospora)、毛 壳 霉 属 (Chaetomium) 的 菌 株 等
[10,14]

制及纤维素酶分子结构与功能研究进展时, 提出了新 的纤维素酶降解模式。该模式认为纤维素降解是由纤 维素聚合物分子链的解链和其糖苷键的水解(解聚)先

。 目 前 瑞 氏 木 霉

文少白等: 微生物降解纤维素的研究概况

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(Trichderma)己经应用于工业上生产纤维素酶; 而胞外 内切酶活比较高的类群主要有曲霉属(Aspergillus), 根 霉属(Rhizopus), 其中以黑曲霉研究的最为深入, 在工 业生产上常和木霉属混合使用, 以提高纤维素类物质 的糖化率。最近几年在筛选新的菌种方面有很大进 展, 已发现的具有纤维素降解能力的微生物有 200 多 种[15]。蔡兴旺[16]等从中国天津地区堆肥中分离筛选到 纤维单孢菌(Cellulomonas sp.); 刘韫滔[17]等从用于堆肥 的 水 稻 秸 秆 中 筛 选 到 斜 卧 青 霉 (Penicillium decumbens); 白洪志 等在野生森林土样中筛选到简青
[18]

10 次传代仍然很稳定。董志扬[27]等人使用γ射线和亚 硝基胍交替处理康宁木霉的分生孢子, 突变株酶活提 高 1.77 倍。还有研究表明紫外光与化学诱变剂结合使 用会提高其产生突变体的效果。如 2001 年石家冀 [28] 等以康宁木霉 T3 为出发菌株, 经过紫外线和亚硝基胍 处理, 得到突变体 T199, 酶活力是出发菌株的 8 倍。曾 莹等 [29] 以 T. viride 为出发株, 经过紫外线和硫酸二乙 脂、 亚硝酸和氯化锂交替处理, 突变体酶活力是出发菌 株的 5.4 倍。 总体来说, 紫外光诱变操作简单, 经济实惠, 一般 实验室条件下都可以达到, 且出现正突变的几率较 高。而化学诱变在某种程度上应用更广泛, 其可操作 性强, 简单易行, 特异性强, 能诱变定位到 DNA 上的某 些碱基, 后代较易稳定遗传, 一般到 F3 代就可稳定, 应 用于遗传标记, 是细胞融合技术的基础[30], 但其也存在 突变的盲目性和随机性等问题。因此, 在实际应用中, 研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选 择合适的诱变方法。 2.3 利用基因工程技术构建纤维素降解菌 随着分子生物学的发展, 基因工程技术也越来越 多地运用到纤维素降解菌的筛选中。把编码纤维素 酶的基因分离出来, 然后通过分子生物学技术改进基 因的表达, 包括把基因连接到强启动子上, 以及排除 对阻遏敏感的操纵基因和提高转译效率等方法, 是目 前提高纤维素降解菌的产酶量和改善酶稳定性的方 法之一[31-32]。目前, 利用基因工程技术将纤维素酶的基 因克隆到细菌、 酵母、 真菌和植物中, 在国内外均取得 了一定的进展。 在国外, Wood[33] 等在大肠杆菌 E.coli Koll 中表达 了 Erwinia Chrysanthemi P86021 的葡聚糖内切酶基因, 最终得到的重组纤维素酶在每升培养基中可产生高达 3200IU。 Kim[34] 等 克 隆 了 Aquixfex aerolicus VF5 编 码 EG 的 Cel8Y 基因, 并在 E.coli XL1-Blue 中成功表达。 Thomas Ziegelhoffer[35] 使 Acidothermus cellulolyticus 中 的 E1 内切-1,4-β-葡聚糖酶基因在烟草植物中表达。 Abdeev[36]研究发现将控制耐热的内切-1,4-β-葡聚糖酶 合成的细菌基因在转基因烟草植物中表达时, 仍能保 持其活性及底物特异性。此外, 有学者 [37] 将两种具有 水解结晶纤维素作用的耐热纤维素酶基因 Cel6A 和 Cel6B 在烟草植株中成功表达。 在 国 内 , 圣 德 等 [38] 将 Erwinia chrysanthemi 的 周 CelY, CelZ 基 因 整 合 到 能 天 然 代 谢 纤 维 二 糖 的 K. oxytocaMSA 1 的产乙醇菌株 P2 的染色体上对菌株进行 改良。经过改良的新菌株产生的乙醇量比对照提高

霉等。 目前纤维素酶产生菌的筛选除了寻找高活力的产 酶菌外, 再就是寻找具有特殊活性的产酶菌株, 如中性 碱性纤维素酶, 低温、 高温纤维素酶等 。2005 年, 中 国学者韩韫 从汕尾一鲍鱼场采集的样品中分离出 2
[20] [19]

株能适应海水高盐环境的纤维素降解菌, 经初步鉴定 这 两 株 菌 分 别 为 Vibrio
[21]

alginolyticus 和

Aeromonassobria。2006 年 Kaur J 筛选到一株嗜热菌 M elanocarpus sp.可产生较高活力的耐热、 中性纤维素 酶, 有可能成为一个产纤维素酶的优良菌株。2008 年 郭大城 分离出一株适宜在碱性条件下生长的高效纤 维素降解菌, 该菌在 pH 为 7~11 的范围内能够产生纤 维素酶。经初步鉴定该菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)。 2.2 诱变育种 通过大量的筛选评价工作发现直接从自然界中筛 选获得单株降解效率高且适应性强的微生物的几率较 少, 要获得理想的降解菌往往需要对所筛选出的菌株 进行改造, 人工诱变是目前常采用的改造方法, 主要包 括紫外光诱变和化学诱变。 利用紫外光对目标菌种进行处理, 使其发生变异, 从而筛选出降解效果更好的纤维素降解菌种是目前比 较常用的一种诱变方法。国外这方面工作开展得很 早, 1981 年 Farkas V[23] 等人就利用紫外线处理绿色木 霉(T.viride) QM9414 的分生孢子; 1989 年, Witkowska D[24] 等人用紫外线处理绿色木霉的菌体, 突变体的酶 活最高可达到原始菌株的 5 倍。在国内, 赵琼 以木
[25] [22]

醋杆菌(Acetobacter x ylinum) C5 为出发菌株, 对其进行 紫 外 诱 变 , 得 一 株 细 菌 纤 维 素 酶 高 产 菌 株 A. 获 xylinumC544, 该突变株的产量是原始菌株的 1.5 倍。 此外, 有学者利用一些化学药品改变微生物的遗 传物质, 从而获得某一特性的正突变体。1999 年, Toyama H[26]等人利用秋水仙素处理里氏木霉 QM69 的 菌丝体, 再用 EMS(甲基磺酸乙脂)处理突变体, 得到两 株新的突变体, 每株纤维素酶产量都高于出发菌株, 经

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中国农学通报 http://www.casb.org.cn 选出 1 组纤维素分解能力强而稳定的纤维素混合菌 群, 100 ml 培养物在 37 ℃静置培养 5 天, 其 对滤纸、 纤 维素、 脱脂棉、 麦秆(片)、 纤维降解率分别达到 81%、 41%、 25%、 40%。在功能菌组合研究方面, 陈耀宁[48]通 过对一株黄孢原毛平革菌和一株歧皱青霉的混合培 养, 发现混合培养条件下半纤维素、 纤维素和木质素的 降 解 率 分 别 比 纯 培 养 高 53.1% , 52.7% 和 54.9% 。 Ikram-ul-Haq[49] 等 将 绿 色 木 霉 MSK-10 与 黑 曲 霉 MSK-7 混合培养研究发现, 反应底物中总蛋白质和各 种酶的量较单独培养增加了 30%~50%。 4 结语 作为自然界中储量最大的可再生资源物质, 木质 纤维素每年都在不断地积累, 为人类社会的可持续发 展提供了资源保障。目前关于木质纤维素的降解利用 技术研究尚待突破, 通过传统方法筛选的菌种在保持 纤维素分解活性上都存在一些问题 [44]。因此, 对于木 质纤维素类物质廉价高效的利用, 笔者认为仍有很多 工作要做。 (1) 菌种筛选方面: 加强高效野生菌种的筛选和发 酵工艺等基础工作的研究, 分离和筛选出针对不同行 业的高效纤维素分解菌种, 同时利用目前先进的分子 生物学技术, 选育出活性高, 产酶量大的菌种。此外, 在自然界中存在大量的未可培养微生物, 通过提取并 纯化特定环境样品中微生物的总 DNA, 进而构建环境 基因组文库, 并从构建的各种基因组文库中筛选新的 纤维素酶基因 [50], 为筛选新的高效纤维素降解菌提供 了一个新途径。 (2) 混合培养方面: 微生物种群的多样性可以影响 系统的功能, 由两种或更多种不同微生物组合成的微 生物集合体被证实在自然界中的许多生物转化中起主 要作用[51-52]。深入研究不同来源纤维素酶以及不同菌 种之间的协同作用, 弄清菌株与菌株之间的关系及其 在降解发酵过程中的作用; 利用分子生物学手段弄清 混合菌剂在木质纤维素降解过程中微生物群落的变 化; 为混合菌剂的选育、 优化提供有利支持。 (3) 机理研究方面: 由于底物的复杂性和酶本身的 多组分, 虽然纤维素酶作用的某些疑难问题已获解决, 但还遗留下许多问题。因此必须弄清自然界中微生物 降解木质纤维素的机制, 了解纤维素酶类不同组分以 及小分子活性物质之间的作用, 从酶学和非酶作用等 多个角度揭示木质纤维素的降解机理, 并用于指导筛 选培育高效降解木质纤维素的菌种以及建立高效的木 质纤维素生物降解体系, 从而最终实现纤维素类物质 的资源化利用。

22%。肖壮志等[39]采用刚果红染色法从 T.reesei cDNA 文库中筛选到 Egl3 基因, 转化到酿酒酵母中成功表 达。丁新丽等
[40]

从 瑞 氏 木 霉 (Trichoderrna reesei )

cDNA 文库中克隆到 CbhIcDNA 基因, 将其在酿酒酵 母种表达, 构建了同时表达 CbhI 和 Egl 的重组酵母菌 株 HMEPC, 该菌株的滤纸酶活提高了 14.3%。 3 混合菌剂降解纤维素的研究 自然界中大多天然纤维原料是由纤维素、 半纤维 素和木质素组成。微生物对它们的降解错综复杂, 有 的微生物酶系齐全, 三类组分都可降解, 有的只能降解 其中之一, 甚至仅限于某一反应过程 。目前, 虽然筛 选出了很多高效的纤维素降解菌, 但大部分由于其产 酶单一、 纤维素分解产物纤维二糖与葡萄糖抑制纤维 素酶的活性以及阻遏纤维素酶的合成、 培养液 pH 下降 到很低而无法恢复到适合培养物生长的条件等问题, 从而使纤维类物质的转化效率低 。在不做预处理的 情况下, 单菌种降解木质纤维素是很困难的。因此, 利 用各菌种的协同作用来高效快速地降解各木质纤维素 大分子越来越受到人们的重视。 获得混合菌种的复合菌系的方法主要有两种: 一 种是直接筛选复合菌剂 , 另一种是选取一些功能菌 株进行组合 。前者是在不破坏自然界中微生物间协 同关系的前提下, 通过优势组合筛选得到高效而稳定 的纤维素分解复合菌群; 后者则是对已分离出的各种 功能菌株按照功能进行组合培养, 从而得到比单一菌 株降解效果更好的菌种组合。在目前的研究工作中, 两种方法的应用都比较多。2002 年崔宗均[44]等人从 4 种堆肥样品中分别筛选出 4 种具有较强纤维素分解能 力的混合菌, 再以酸碱反应互补的原则重新优化组合 并驯化成一个纤维素分解能力强且稳定的分解纤维素 的复合菌系 MC1。该复合菌系在 72 h 内, 对滤纸的降 解率为 94.0%, 脱脂棉的分解率为 98%, 锯末的分解率 16%。在连续投放滤纸情况下纤维素分解能力稳定保 持 20 天以上。2003 年邱向阳等 在秸秆堆肥体系中,
[45] [43] [42] [41] [1]

以纤维素为唯一碳源筛选到一批具有较高纤维素降解 能力的微生物, 通过正交实验, 得到 4 组高效组合菌 剂, 能在 3 天内快速启动滤纸条降解。2005 年王伟东 等 人以麦秸垛下的土壤和麦秸为原料的堆肥作为材 料利用限制性培养技术经过多代淘汰及其不同系之间 的组配最终筛选构建了一组分解木质纤维素的复合菌 系 WSC-6。 该 复 合 菌 系 在 72 h 内 , 纸 降 解 率 为 滤 97.0%, 稻杆的降解率为 28.2%。2007 年, 费辉盈等
[47] [46]

在改良 PCS 培养基的基础上, 通过定期改变传代方 法, 从污泥、 森林土、 发酵腐熟牛粪、 堆肥处理麦秆中筛

文少白等: 微生物降解纤维素的研究概况
Technology, 2006, 38:931-936.

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