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猪繁殖


第 18 卷 第 2 期 1 9 98年 3 月

中  国  兽  医  学  报 Chinese   Journal  of  Vet er inary  Science

Vol. 18,    M arch

No . 2 1 99 8

猪繁殖- 呼吸道综合征病毒( PRRSV) CH-1a

株基因型鉴定
仇华吉 郭宝清 童光志  刘文兴 于 力 
( 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室, 哈尔滨 150001)
*

摘要  根据猪繁殖- 呼吸道综合征病毒( P RRSV ) 美洲型毒株和欧洲型 毒株的基因组序列 设计合成了 2 对
引物, 即 1008P S/ 1009PR 和 1010PL S/ 1011P L R。 我国分离的 CH-1a 株用这 2 对引物均能扩增出与预期大小 相符的 RT PCR 产物, 分别与美洲型代表株( V R-2332) 的 RT - CR 产物大小相当。特异性试验表明, 这 2 对 P 引物均不能扩增其他常见的繁 殖障碍相关病毒的 RN A 或 DN A 以及未感染的 M A RC 145 细胞 R N A。间接 免疫荧光 试验也证明, CH -1a 株与 P RRSV 核衣壳蛋白 特异性单克 隆抗体以 及美洲型毒 株抗血清 均呈阳性 反应。因此初步证实 CH- 株为美洲型 P RRSV 。 1a

关键词 猪繁殖- 呼吸道综合征病毒 RT -P CR 基因型 中图分类号  S 852. 65 Q 78   近年来, 猪繁殖- 呼吸道综合征( porcine repro duct ive and r espirat ory syndr ome, P RRS) 在 亚太国家和地区呈蔓延之势 济损失。1996 年, 郭宝清等
[ 1~3]

株( 分别由 Dr D A Benfield 和 Dr G W ensv oort 惠赠) , 分别用作美洲型和欧洲型参考毒株; CH1a 株由本所分离, 按已报道的方法用 M ARC145 [ 7] 细胞( 由 Benf ield 惠赠) 培养 。猪瘟病毒( HCV ) 石门株( 由黄骏明副研究员惠赠) 、 猪伪狂犬病病 毒( PrV) Bart ha 株( 由李亚香副研究员惠赠) , 分 别用作 RN A 病毒和 DNA 病毒对照毒株。 1. 2 RT-PCR 1. 2. 1  RNA 抽 提 病毒 培养物 收毒后 冻融 3 次, 以 6 300 r/ min 4℃离心 30 m in( Beckman JA 20. 1 转子) , 弃沉淀, 上清液以 27 000 r / min 4℃ 离心 2 h ( Beckman WS -28 转子) , 弃上清, 病毒粒 子沉淀( 除 PrV 核酸选用 DNA 抽提法外) 均用异 硫氰酸 胍- 酚- 氯仿 一步法[ 8] 抽提病 毒 RNA, RNA 悬浮于 DEP C 处理水中。 1. 2. 2 引物 根据 PRRSV IAF -ex p 91 株( 美洲 型) 基因 组 ORF 7 序 列 设计 1 对 引物 1008PS / 1009PR, 上游 1008P S 序列为 5′ AAAT AT GCT CAAAAACAAC3′ 下 游 1009PR 序 列 为 5′ , T AGGT GACT T AGAGGCACA3′ 预 期 扩 增 产 , 物大小为 468 bp 。根据 PRRSV LV 株基因组 3′ 末端序列设计 1 对引物 1010PL S/ 1011P LR, 上游 1010PL S 序 列 为 5′ GGCCAGCCAGT CAT AAT CA 3′下 游 1011PL R 序 列 为 5′CGCCC, T , T AAT T GAAT AGGT G 3′预期 扩增产物 为 433

。 在国内, 原因不

明的猪繁殖障碍综合征早已存在, 并造成重大经
[ 4]

从国内疑似 PRRS

PRRS 病毒 流产胎儿分离出 PRRS 的病原 ( PRRSV ) , 首次确 认了 PRRS 在中国 大陆的 存 在。PRRSV 为单股正链 RNA 病毒, 其基因组含 有 8 个开放阅读框架( ORF ) [ 5] , 其中 ORF 7 编码 保守的 15 000 核衣壳蛋白( N ) 。 PRRSV 分离株 间存在很大变异, 可区分为 2 种基因型, 即欧洲型 ( 代表株为 L ely st ad 病毒, L V) 和美洲型( 代表株 为 AT CC VR-2332 株) 。 CH-1a 株 系 从 暴 发 PRRS 的国内某猪场分离的一株 P RRSV 。 为了确 定国内毒株的基因型类型, 以便为 PRRS 的诊断 与防制提供依据, 我们应用 RT - CR 对 PRRSV P CH -1a 株进行了鉴定, 并结合间接免疫荧光( IIF ) 试验证实了 CH-1a 株属于美洲型。
[ 6]

1 材料与方法
1. 1 病毒   P RRSV AT CC VR-2332 株和 L V
  * 通讯作者    本文收到日期: 1996- 09 09-

第 2期

仇华吉等: 猪繁殖- 呼吸道综合征病毒( PRR SV ) CH - a 株基因型鉴定 1

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bp。 1. 2. 3   反 转 录 ( RT )   总 RNA 10 LL 加 25 pm ol/ L 下游引物, 70℃变性 10 min, 立即冰浴致 冷。cDNA 合成反应为 50 LL , 含 1×cDNA 第一 链 缓 冲 液、10 mmol / L DT T 、1 m mol/ L 各 dNT P 、 U 鼠源反转录酶( L ife T echnolog ies, 400 Inc 产品) 和 40 U RNasin( 华美公司产品) , 37℃ 温育 1 h 。反转录产物 94℃加热 5 min 灭活反转 录酶。 1. 2. 4 PCR PCR 反应总体积为 50 LL , 含 cDNA 10LL 、 1×PCR 缓冲液、 2 m mol/ L dNT P 、 0. 上下游引物 25 pmo l/ L 、 U T aq 酶( 原平公司产 1 品) , 加一层石蜡油, 按下列程序进行 PCR 反应: 95℃ 5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 2 min, 共 35 个循环; 72℃延伸 10 min 。P CR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检查, 紫灯下观察、 照相。 1. 3   间 接 免 疫 荧 光 ( IIF) 试 验   用 PRRSV AT CC VR-2332 株、 NVSL 株 ( 由 Dr M L F rey 惠赠) 和 CH -1a 株分别接种 M ARC -145 细胞, 出 现 CPE 后, 制备细胞涂片, 用针对 N 蛋白保守表 位的单抗 SDDW-17( 由 Benf ield 惠赠) 、 VR-2332 和 NVSL 抗血 清以及 HCV、 、 PrV PPV 和 HEV [ 9] 抗血清, 按以往的方法 进行 IIF 试验。
附 图  PRR SV CH- VR 1a、 2332、 V 株及 HCV 、 rV 和 L P 未 接 种 的 M A R C145 细 胞 用 引 物 对 1008P S/ 1009 PR 和 1010PL S / 1011P L R 的 RT PCR 结 果  1. 100 bp DN A L adder ( Gibco BR L ) ; 2. CH-1a 1010PL S/ 1011PL R ; 4. LV 3. CH-1a 1008P S/ 1009PR ; 5. 2332 VR 1010P L S/ V R-2332 1010PL S / 1011 PL R; 1008P S/ 1009P R; 9. 8. HCV

1008PS/ 1009P R; 6. L V 1010PL S/ 1011P LR ; 7. 1011 PL R; Pr V 1010P L S / 1011PL R ; 10. 145 细 胞 1010PL S / 1011P L R; 11. ddH 2O M A RC 1010PL S/ 1011PL R ; 12. 100 bp D NA L adder

附 表   PRRSV SDOW -17 单 抗 及 VR -2332、 NVSL 、 HCV 、 、 V 和 HEV 抗血清 PrV PP 用 IIF 试 验 对 CH-1a、VR-2332 和 NVSL 及未 接种的 M ARC-145 细胞 试 验结果
单抗或抗血清 S DO W -17( 1∶5 000) V R-2332 抗血清 N V SL 抗血清 HCV 抗血清 PrV 抗血清 PPV 抗血清 HEV 抗血清 CH-1a # 1∶80 1∶80 V R -2332 N V S L 对照细胞 # 1∶80 1∶80 # 1∶80 1∶80 -

2 结果
2. 1 RTPCR  CH -1a 株、 -2332 株用 2 套引 VR 物均能扩增出预期大小的 RT -PCR 产物, 并且产 物 大 小 分 别 相 近; 而 对 L V 株, 仅 1010PL S/ 1011PL R 能 扩增 出 预 期 大 小 的 产 物, 1008 PS / 1009PR 则无特异性扩增条带; HCV、 PrV 及未接 种的 M ARC-145 细胞用 RT -PCR 检验均无扩增 产物( 附 图) , 表明 CH -1a 与 VR -2332 的基因 组 具有很高的同源性。 2. 2 IIF 单抗 SDOW-17 以 1∶ 5 000 稀释 对 CH-1a、 VR-2332 和 NVSL 细胞培养 物进行 IIF 检测, 均呈强阳性胞浆荧光, 对照细胞( 未接种的 M ARC-145 细胞) 则为阴性, 表明该单抗可 识别 PRRSV 2 种基因型的 保守性抗原表位; 用 V R2332 和 NVSL 抗血清对 CH -1a 进行 IIF 试验, 间 接免疫荧光滴度均达 1∶80, 而 P rV 、 HCV 、 PV P 和 HEV 抗血清对 CH-1a 和未接种的 M ARC-145 细胞用 IIF 试验均呈阴性( 附表) , 表明 CH -1a 与 美洲型毒株有共同抗原。

3 讨论
  RT -PCR 以其敏感特异、 快速简便的优点而 被广泛用于 RNA 病毒的检测 。该方法不仅 [ 13, 14] 可以用于 PRRSV 的检测 , 而且根据引物的 特异性还可用来鉴定 PRRSV 的基因型。本研究 所用的 引物 1008P S/ 1009PR 是根 据 IAF -ex p91 株( 美洲型) 基因组 N 基因设计合成的, 用它只能 扩 增 美 洲 型 ORF 7 片 段, 而 不 能 扩 增 欧 洲 型
[ 10~12]

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中  国  兽  医  学  报

1998 年

ORF 7 片段, 具有 型特 异 性; 1010PL S / 1011P L R 是根据 L V 株 3′ 末端 ORF 7 的保守序列设计的, 它兼能扩增美洲型和欧洲型毒株的特定序列, 因 而 具 有 通 用 性。2 套 引 物 合 并 应 用, 可 用 于 PRRSV 分离株的基因型鉴定。根据 RT -P CR 试 验结果, 可以确定 CH-1a 株属于美洲型。   据报道 , 欧洲型与美洲型毒株间存在相当 大的抗原差异。美洲型毒株虽与欧洲型毒株抗血 清有交叉反应, 但与之相反的是, 欧洲型毒株与美 洲型毒株抗血清不发生交叉反应。IIF 试验结果 显示, CH -1a 株与美洲型毒株的抗血清有交叉反 应, 这从另一方面佐证了上述结论。   P RRSV 是如何传入我国的尚不清楚。根据 本研究结果推测, 国内毒株与美洲毒株有很高的 同源性, 很可能来自北美洲, 这与我国同该地区频 繁的贸易往来和密切的人员互访有极大关系。尚 需进一步探讨国内毒株与美洲毒株的分子病毒学 关系。今后我国 PRRS 的检测与防制应重点针对 美洲型毒株采取相应措施, 并加强对欧洲地区输 入 产 品 的 检 疫, 防 止 欧 洲 型 毒 株 的 传 入 而 使 PRRS 防疫工作复杂化。
   ( 本 研究 得到阎 玉河 博士、 张绍 杰硕 士、 王柳助 理研 究 员、 玫同 志、 王 王莉同 志和 张伟华 硕士 的大力 支持, 谨 致谢忱)
[ 15]

r elated t o L DV and EA V . V ir olo gy , 1993, 192: 62~ 72 6  M eulenberg J J M , Besten A P , De K luy ver E P et al. Char acterizat ion of pro teins encoded by O RF s 2 t o 7 of L elystad virus. V ir olo gy , 1995, 206: 155~163 7 Kim H S, K w ang J, Yo on I J et al. Enhanced replication of po rcine repr oductive and respir ato ry sy ndro m ( PR RS ) v ir us in a homo geneous subpo pulatio n of M A 104 cell line. A rch V ir io l, 1993, 133: 477~483 8 Chomczynsky P Y, Sacchi N . Sing le step method of R N A isolatio n by acid g uanidium thio cy anatephenol chlor ofo rm ex traction . A nal Bio chem , 1987, 162: 156~159 9 郭 宝清, 陈章 水, 刘文兴 等 . 应 用间 接免 疫荧光 法从 国内生 殖障 碍综 合征猪 群中 检测 P RRS 阳 性抗 体的 研究 . 中国兽医科技, 1996, 26( 3) : 3~5 10 A ndr easo n J R Jr , Jackw o od M W, Hilt D A . Po ly merase chain r eact ion amplification of t he genome of infectio us bro nchitis virus . A v ian Dis , 1991, 35: 216~ 220 11 Chirnside E D, Spaan W J M . Rever se t ranscription and cDN A amplification by the poly merase chain r eactio n of equine art erit is vir us ( EAV ) . J Viral M etho ds, 1990, 30: 133~140 12  Hy ypia T , Auv inen P , M aa ro nen M . Poly merase chain r eactio n fo r human picor nav ir uses . J Gen Viro l , 1989, 70: 3261~3268

参 考 文 献
1   Wensvo or t G . P or cine r epr oduct ive and r espirato r y sy ndr ome. In : P ro ceeding s of the 13th Inter na tio nal P ig V et erinar y So ciety Co ngr ess. 1994. 11~14 2 Chang C C . Po rcine r epr oduct ive and r espirato ry sy ndro me in T aiwa n. J Chin So ci V et Sci, 1993, 19( 4) : 268~270 3 Shimizu M . Isolatio n of repr oductive a nd r espirato r y sy ndr ome v ir us fr om pigs w it h Heko Heko disease. J V et M ed Sci, 1995, 56( 12) : 389~391 4 郭 宝清, 陈章 水, 刘文 兴等 . 从疑 似 PR RS 流产 胎儿 分离 PRR SV 的研究 . 中国畜禽传染病, 1996, 2: 1~4 5  M eulenber g J J M , Hulst M M , De M ijer E J et al. L elystad virus, the causative agent of por cine epidemic abor tio n and r espir ato ry syndro me ( P EAR S ) , is

′ 13 Su a r ez P , Zardoy a R , Pr ieto C et al. Dir ect detectio n of the por cine r epr oduct ive and respir ato ry sy ndr ome ( PR RS ) v ir us by r ever se tr anscr iption po ly merase chain r eactio n ( RT PCR ) . A r ch V iro l , 1994, 135: 89~99 14 M ar dassi H, Wilson L , M ounir S et al. Detectio n of por cine repr oductive and r espir ato ry syndro me v irus and efficient differentiatio n betw een Canadian and Euro pean str ains by r ever se t ranscription and P CR amplificatio n. J Clin M icr obio , 1994, 32: 2197 ~ 2203 15 Wensvo or t G, D e K luy ver E P, L uijtze E A et al. A nt ig enic compar ison of L ely st ad virus a nd sw ine infertility and respira tor y syndr om e v ir us. J V et Diagn Invest , 1992, 4: 134~138

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Genotyping of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain CH-1a Isolated in China by RT-PCR and Indirect Immunof luorescence Test
Qiu Huaji Guo Baoqing T o ng Guangzhi  L iu Wenx ing  Yu L i ( St ate K ey L ab of V et B iot echnol ogy , H arbin V et Res Inst , CA A S , H arbi n 150001)   Abstract CH-1a iso lated f rom an out break of P RRS in a pig farm in China. T w o set s of olig onucleot ide primers , 1008PS / 1009PR and 1010PL S / 1011PL R w ere desig ned acco rding t o t he sequences of PRRSV st rain IAF -exp 91 and L V ( Euro pean pro to ty pe ) t o det ermine t he g enot ype of t he PRRSV st rain. T he r esult s show ed that PRRSV st rain CH-1a could be amplif ied using eit her primer pair by RT -PCR, yielding a sing le band of t he predict ed size aft er agarose gel elect rophor esis, t o be sim ilar in size t o the products of str ain VR -2332. No ampl if icat ion w as o bser ved w hen RNAs w er e ex t ract ed fr om hog chol era virus ( HCV ) and uninfect ed M ARC-145 cells or DNAs f rom pseudorabies virus ( P rV) . MA RC-145 cells infect ed wit h strain CH-1a w ere show n t o r eact w it h antiser a against st rains VR-2332 and NVSL ( Am er ican isolat e) by indirect imm unof luorescence st aining . T hus, it is concluded t hat t he Chinese PRRSV st rain CH -1a bel ong s t o Am er ican genot ype .   Key words PRRSV; RT -PCR; g enot ype
  * cor r esp onding author
*


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