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浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 15 6)327 ~ 331, ( : 2003

农杆菌介导的水稻转化及 bar 基因稳定遗传
胡张华, 吴关庭, 金 卫, 王伏林, 陈锦清*

(浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所, 浙江 杭州 310021)



要:以秀水 11、 和 ZH9905 的胚性愈伤组织为受体, 通过农杆菌介导法将抗除草剂基因 bar 072

导入水稻基因组, PCR、 经 转基因水 Southern 杂交分析获得大量转基因植株。除草剂喷洒试验表明, 稻对除草剂 Basta 具有高度的抗性。对 R1 代植株分析表明外源基因已遗传给后代, 部分株系的分 离比率符合 3 : 1。对部分转基因水稻植株考察结果表明, 部分转基因植株的农艺性状与亲本相似, 但育性下降。 关键词:水稻; 农杆菌介导法; 基因 bar 中图分类号:S511 . 035 . 3 文献标识码:A 文章编号: ( 1004 - 1524 2003) - 0327 - 05 06

Agrobacterium-mediated transformation of rice and stable inheritance of bar gene: Zhang-hua, HU WU ( Guan-ting, Wei, JIN WANG Fu-lin, CHEN Jin-qin* Institute for Virology and Biotechnology ,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021 , China) Abstract:Herbicide-resistant bar gene was incorporated into rice genome via Agrobacterium-mediated transformation using the embryogenic calli induced from 072, Xiushui 11 and ZH9905 . The transgenic nature of transformants was confirmed by PCR and Southern hybridization. Integration of both genes was confirmed by PCR and Southern hybridization. High herbicide resistance of transgenic plants was evident from spraying test with Basta. The foreign bar gene was inherited and segregation ratio in some R1 progeny was 3 : 1 . Agronomic traits of transgenic R1 plants were similar to those of parents’varieties, their fertilify decreased. but : Key words:rice( Oryza sativa L. ) Agrobacterium-mediated transformation; herbicide-resistant; gene bar

水稻是世界上最重要的粮食作物之一, 其遗传转化研究一直受到人们的广泛重视。 自 1988 年以来, 水稻遗传转化技术已取得了 显著进展, 利用 PEG 法 、 电激法 、 基因枪 [3] 法 等方法先后实现了水稻遗传转化。1994
[4] 年 Hiei 等 利用农杆菌转化粳稻首次获得 [1] [2]

成功后, 农杆菌介导水稻的遗传转化取得了
[5 很大进展 ~ 8] 并表现出良好的应用前景。 ,

Bar 基 因 编 码 PPT( L-Phosphinothricin ) 乙酰转移酶 PAT) PAT 催化乙酰辅酶 A 的 ( , 乙酰基转移到 PPT 的氨基上, 形成乙酰 PPT, 从而使 PPT 类除草剂的毒性失活。 bar 基因 是植物遗传转化中普遍使用的选择性标记基 因之一, 将它与其它重要性状的基因构建到 同一载体上, 转化后只需使用少量的除草剂, 即可有效地筛选转化体。 Bar 基因除了可作

收稿日期:2003 - 07 - 21 基金项目: 国家转基因植物专项 (TY03B1902) 作者简介:胡张华 (1969 - ) 男, , 浙江桐庐人, 硕士, 从事植 物生物技术研究。 j *通讯作者 E-mail:. q. chen@ zaas. org

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为有效选择标记使用外, 还能使得到的转基 因作物带有抗除草剂的有用性状。目前国内 外的许多实验室都获得了带有抗除草剂 bar
[3, 基因的转基因水稻 9] 。

1.2

方法

用 1 . 2 . 1 愈伤组织诱导 水稻种子去壳后, 再用 20% 花王漂白液浸 70% 酒精消毒 5 min, 泡 30 min, 最后用无菌水冲洗 3 ~ 5 次。将消 毒后的米粒接种在 N6 D2 培养基上诱导愈伤 组织, 待诱导出愈伤组织后, 挑选颗粒状愈伤 进行继代, 每隔 2 周转继一次。培养物均在 25 ± 1℃ 黑暗条件下培养。继代 1 至 2 次后 的胚性愈伤用于农杆菌转化。 1 . 2 . 2 农杆菌的培养和水稻转化 农杆菌 [4] 培养及转化基本参考 Hiei 等 的方法。农 杆菌 EHA105 在含卡那霉素 50 mg / L 和潮霉 素 50 mg / L 的 YEP 培养基中 28℃ 振荡培养 过夜。低速离心 5 min 后取沉淀用 AAM-AS 培养基漂洗一次, 再重新悬浮于 AAM-AS 液 体培养基中。愈伤浸入此菌液, 期间不断地 缓慢振荡, min 后取出愈伤并用无菌滤纸 20 吸去多余菌液, 随即转移至表面加有一层无 菌滤 纸 的 N6D2- AS 培 养 基 上 25 ℃ 暗 培 养 。 吸干后转移至 3 d 后用无菌水洗涤 2 ~ 3 次, 每 N6 D2 H50 上进行筛选, 2 周继代一次。 1 . 2 . 3 植株再生 筛选 3 ~ 4 次后的抗性愈 伤组织先转移到 N6 B2 K1 H50 预分化培养基上, 培养温度为 28 ± 2℃ , 暗培养。当形成紧密 的胚性愈伤组织时, 转移至 N6 B1 K1 H50 培养基 上, 培养条件为 10 h 光照、 ± 1℃ 与 14 h 黑 25 暗、 ± 1℃ 交 替, 照 强 度 3000 ~ 4000 lx。 光 21 分化出的小植株转移至 N6 H50 培养基上长根, 当苗长至 8 cm 左右, 移至田间。 [10] 1 . 2 . 4 PCR 扩增分析 参考卢扬江等 方 法从水稻叶片提取基因组 DNA。检测 hpt 基 因所 用 的 PCR 扩 增 引 物 为 5’ -CGCCGATG和 -GGCGTCGGTTTCCACTAT -3’ , GTTTCTA -3’ 5’ 检 两端 引 物 间 DNA 片 段 长 度 为 835 bp; 测 bar 基因的引物为 5’ -CAGGAACCGCAGGAGT 和 -CCAGAAACCCACGTCATGCC-3’两 , GGA-3’ 5’ 端引物间 DNA 片段长度为 372 bp。反应体 系 10 ? ) ( 引物 1 和 2 各 1 ? , l 包括: mol dNTP

本文利用农杆菌介导法将 bar 基因导入 水稻, bar 基因的表达和遗传进行了分析, 对 并对部分转基因 R1 代植株的农艺性状进行 了考察。

1 材料与方法
1.1 材料 1 . 1 . 1 水稻品种和培养基 供试用水稻品 种 (系) 秀水 11、 和 ZH9905, 均由本院作物 072 与核技术应用研究所提供。组织培养和农杆 菌转化使用培养基见表 1。 1.1.2 菌株和质粒 供试农杆菌为根癌农杆 菌 EHA105 pDBA121)含 Bar 基因和潮霉素抗 ( , 分别带有 CaMV35S 启动子和 NOS 性基因 hpt , 终止子, 为本实验室自行构建和保存。
表1 成分 Table 1 Culture medium and their components used in 水稻组织培养与遗传转化使用的培养基及其

tissue culture and genetic transformation of rice
培养基 N6 D2 成分 脯氨酸、 水解酪蛋 N6 大量, 微量, 5 维生素, MS B 白和谷氨酰胺各 500 mg / L,蔗糖 30 g / L, 4-D 2, 2 mg / L, Agar 8 g / L, . 8 pH5 (Toriyama and Hinata 1985) B5 , AA 盐及氨基酸 维生素, 水解酪蛋白 500 mg / L, 蔗糖 68 . 5 g / L, 葡萄糖 36 g / L, 乙酰丁香酮 (AS) mg / L, . 2 20 pH5 乙酰丁香酮 (AS) mg / L, N6 D2 , 20 Agar 8 g / L, pH 5.2 头 ( 潮 N6 D2 , 孢 霉 素 cefotaxime) 250 mg / L, 霉 素 (hygromycin) mg / L 50 N6 大量, 微量, 5 维生 素, MS B 6-BA 2 . 0 mg / L, 潮霉素 50 mg / L, KT 1 . 0 mg / L, NAA 0 . 2 mg / L, 蔗糖 60 g / L , Agar 12 g / L,pH 5 . 8 N6 大量, 微量, 5 维生素, MS B 6-BA 1 . 0 mg / L, KT 潮霉素 50 mg / L, 蔗糖 1 . 0 mg / L, NAA 0 . 2 mg / L, 30 g / L , Agar 8g / L, 5 . 8 pH 潮霉 N6 大量, 微量, 5 维生素, g / L 蔗糖 , MS B 30 素 50 mg / L,蔗糖 30 g / L ,Agar 8 g / L,pH 5 . 8

AAM-AS N6 D2 -AS N6 D2 H50 N6 B2 K1 H50

N6 B1 K1 H50

N6 H50

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扩增反应 程 序: 200 ? , 酶 1 u; mol Taq 94℃ 5 进行 30 个循环 94℃ 1 min) 55℃ 1 ( , min 后, ( , 最 min 扩增 bar 基因时为 61℃ )72℃ 2 min; 后是 72℃ 10 min 。反应完毕后, 2 ? 终产 取 l 物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳, 观察照相。 1 .2 . 5 Southern 杂交分析 从 PCR 为阳性 的植株中随机选取转化株进行 Southern 杂交 分析。10 ~ 15 ? 总 DNA 经 XhoI 完全消化, g 在 0 . 8% 的琼脂糖凝胶上电泳, 用标准 Southern 印迹方法进行转移。以 bar 基因为探针, 采用随机引物方法标记探针。杂交与预杂交
[11] 均按 Sambrook 等 方法进行。

织至相同的筛选培养基上继代 2 次后转移至 N6 B2 K1 H50高 渗 预 分 化 培 养 基 进 行 预 分 化。 经预 分 化 1 ~ 2 周 的 抗 性 愈 伤 组 织 转 入 (图 N6 B1 K1 H50 分 化 培 养 基 上 后 能 迅 速 出 苗 , 1)有时同一块愈伤组织能产生多株转化苗。 在供试的 3 个水稻品种中, 以秀水 11 的植株 转化频率最高, 达到 27 . 69% - 072 和 ZH9905 分别为 25 . 28% 和 15 . 62% , 表明不同基因型 的农杆菌转化频率是不一样的。 2 .2 R0 代植株的 PCR 检测和 Southern 杂交 分析 在抗性植株中随机选取 9 株 进 行 PCR 扩增分析, 使用 hpt 基因引物检测时, 从全部 9 株抗性植株的 DNA 中都扩增出 835 bp 的 片断与从质粒 pDBA121 扩增相同 (图 2-A) ; 同样用 bar 基因引物时, 从全部 9 株植株的 的 DNA 都也扩增到 372 bp 的片段与从质粒 (图 2-B)而对照植株均 , pDBA121 扩增的相同

1.2.6 1 株选一片稻叶浸沾 0 . 25% Basta 溶液, 周 1 后观察稻叶对 Basta 的反应, 然后对供试水稻 全株 喷 施 0 . 25% Basta 溶 液, 录 全 株 对 记 Basta 的抗性反应。 1 . 2 . 7 转基因植株的农艺性状考察 对部 分转基因株系及其对照的生长发育过程进行 考察记录, 成熟后每株系随机选取 10 株测量 株高并取样考种。

再生植株的 Basta 抗性鉴定

首先每

2
2.1

结果与分析
转基因水稻植株的获得 继代 1 ~ 2 次的水稻胚性愈伤组织经农

杆菌 EHA105 / p Bar1300 共培养 3 d 后转至选 择培养基 N6 D2 H50 上, 周后, 愈伤组织渐渐 1 发褐, 同时可以看到白色的抗性愈伤组织长 出。2 周后统计抗性愈伤组织数。三种基因 型均具有较高的转化频率, 抗性愈伤频率为 (表 2) 。挑选抗性愈伤组 34 .38% ~ 48 . 86%
表2 农杆菌介导的不同水稻品种转化频率 Agrobacterium-mediated transformation frequency in different rice cultivars
共培养的愈 伤组织数 (A) 65 178 32 HgrR 抗性愈 伤组织数 (B) 28 87 11 抗性愈伤频率 再生植株的 BastaR 抗性 (B (C) 植株数 (D) / % / A × 100% )愈伤组织数 43 . 08 48 . 86 34 . 38 18 45 5 25 61 10 转化频率 / % (C / A × 100% ) 27 . 69 25 . 28 15 . 62

图1 Fig.1

在分化培养基上得到抗性苗 Seedlings with herbicide-resistance from N6B1K1 H50

medium

Table 2
品种 秀水 11 072 ZH9905

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1 .λ -DNA / HindIII; . 未酶切质粒; . XhoI 单 酶 切 对 照 植 株 2 3 A: . PCR 分子量标准; ~ 10 . Basta 抗性植株 PCR 产物; . 1 2 11 对照植株 PCR 产物; . 质粒 PCR 产物 12 B: . PCR 分子量标准; . 质粒 PCR 产物; . 对照植株 PCR 1 2 3 产物; ~ 12 . Basta 抗性植株 PCR 产物 4 DNA; 5: 4, XhoI 单酶切转化植株 CB1 和 OB4 DNA

图3 Fig. 3 plants

部分转化植株的 Southern blotting 分析 Southern blotting analysis of some transformed

图2 Fig. 2

Basta 抗性植株的 PCR 分析 PCR analysis of Basta resistant plants using hpt

( ( gene primer A)and bar gene primer B)

对 R1 代转基因株系在抽穗期整株喷洒 0 .25% Basta 溶液, 周后大部分植株表现出 1 强烈的 Basta 抗性而生长完全正常, 少数植株 对 Basta 敏感而枯黄死亡, 表明 bar 基因已遗 传至后代并在后代植株中稳定表达。各株系 中, 基 因 的 分 离 情 况 见 表 3。 CB1 、 4 、 OB bar OB5 和 OB6 的 bar 基因分离比符合表现 3 : 1 的孟德尔分离方式, OB3 、 9 和 ZB2 的分 而 OB 离比分别为 10 : 1, . 5 : 1 和 6 : 1, 属于非孟德 1 尔分离方式, 这有待今后进一步研究。 对转基因株系 OB4 和 OB(图略) 的部分 5 植株进行 PCR 分析, 结果与除草剂抗性测验 结果完全一致, 表明 bar 基因确实已遗传到 (图 4) 。 R1 代 2.5 转基因 R1 代植株农艺性状考察 从表 4 可以看出, 1 代转基因抗除草剂 R 水稻的株高、 穗长、 有效分蘖数、 千粒重以及 全生育期等农艺性状与未转化对照植株相 似, 它们之间的差异主要表现在结实率和每 穗粒数上, 即转基因水稻的结实率下降, 每穗 粒数减少或增加。同时, 不同转基因株系间 这两个性状也有着较大差异。

没有扩增出上述带。说明外源基因确实已转 入水稻中。 对 PCR 检测为阳性的 2 株转化植株 CB1 和 OB4 进行 Southern 杂交分析, 以进一步确 证是否为转化体。 XhoI 单酶切基因组 DNA 的 Southern 杂交结果表明 (图 3) 2 个转化植 , 株均检测到阳性条带, 而对照植株没有出现 杂交带, 说明 bar 基因已整合入水稻基因组 中。 2.3 R0 代植株的 Basta 抗性鉴定 对部分 R0 代转化植株进行了 Basta 抗性

试验, 涂抹 0 . 25% Basta 溶液 1 周后, 株转 41 化植株的叶片保持正常绿色, 表现出强烈抗 性, 其余 6 株叶片出现部分损伤, 为部分抗 性; 而非转化对照植株经 Basta 处理过的叶片 出现枯黄。进一步用 0 . 25% Basta 溶液喷施 全株, 转化水稻植株仍保持正常绿色, 而对照 植株 1 周后完全枯黄而死亡。由此表明 bar 基因已导入水稻并得到高效表达。 2.4 bar 基因遗传分析

胡张华等: 农杆菌介导的水稻转化及 bar 基因稳定遗传

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参考文献:
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图4 Fig. 4

转基因水稻 R1 代 OB4 株系部分植株的 bar 基 PCR analysis of bar gene in OB4 transgenic plants

因 PCR 扩增分析 in R1 progeny of transgenic rice 表3 转基因水稻 R1 代植株 bar 基因遗传分析 Genetic analysis of bar gene in R1 transgenic

Table 3 rice lines
品种

R1 株系 喷施植株 抗性植株 敏感植株 数/株 数/株 数/株 0B1 072 8 5 3 0B2 6 6 0 0B3 11 10 1 0B4 19 15 4 0B5 73 56 17 0B6 65 51 14 0B7 82 60 22 0B8 3 3 0 0B9 32 19 13 ZH9905 ZB1 12 10 2 ZB2 14 12 2 秀水 11 CB1 38 28 10 CB2 5 5 0 CB3 1 1 0

表4

转基因水稻 R1 代植株与未转化植株的农艺 Comparison of agronomic traits of transgenic R1
平均值 对照 77 . 8 17 . 9 13 . 0 75 . 3 97 28 . 4 134

性状比较 Table 4 plants and control plants
株系 0B4 0B5 0B6 株高 / cm 76 . 2 77 . 9 75 . 3 76 . 5 穗长 / cm 17 . 6 17 . 3 16 . 9 17 . 3 有效分蘖数 / 个 12 . 0 13 . 0 12 . 0 12 . 3 每穗粒数 / 粒 74 . 8 86 . 4 63 74 . 7 结实率 / % 94 . 6 93 . 5 81 89 . 6 千粒重 / g 28 . 2 28 . 5 27 . 8 28 . 2 全生育期 / d 134 134 134 134

(责任编辑

袁醉敏)


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