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安捷伦GPC软件培训


Agilent

GPC软件

现场培训教材

安捷伦科技有限公司 化学分析仪器部

一. 仪器配置:

? ? ? ? ? ? ? ?

单元泵 (G1310A) 在线脱气机 (G1379A ) 自动进样器 (G1313A ) 柱温箱 (G1316A) 视差

折光检测器 (G1362A) 化学工作站 (G2170AA, G2182AA) GPC-SEC 有机相起始套包(PN: 5064-8251) GPC-SEC 水相起始套包(PN: 5064-8252)

注:如果使用二元泵或四元泵,千万不要使用泵的比例阀进行混合。在使用 二元泵情况下,严格使用100%通道A和0%通道B。 四元泵的连接应使梯度比 例阀旁路,这需要一个转换接头(P/N 0100-1847)以便使溶剂直接到达主动 阀而不是比例阀。本培训操作以GPC-SEC 有机相起始套包为例:

? 色谱柱: ? 安捷伦PLgel Mixed-C, 300 x 7.5 mm, 5 ?m (79911GP-MXC)
此 PLgel Mixed-C 色谱柱填料为5 ?m 不同孔径的颗粒,因而可以使分子 量范围很宽的高聚物得到分离 (约200-3,000,000),这样宽的分子量范 围一般需要几根(通常2到3根)传统意义上单一孔径的色谱柱串联完成。 另一方面,一根30 cm长混合gel 色谱柱不可能与一套串联色谱柱具有相 同的柱效。因此该混合柱通常用于方法的快速开发,其优化需要使用几根 混合柱或单一柱串联来完成。

二.样品制备:
? 为节约时间,样品制备和仪器参数的设置最好在前一天的下午来完成, 这样可以使日RI检测器和色谱柱有足够的时间平衡过夜。 1. 分别加入1.0 mL THF 到三个含有窄标聚苯乙烯标样混合物的小瓶中 (红, 蓝 和绿)以及一个宽标样品瓶(黄色)中,让其溶解60分钟,每10 分钟摇动一次。在样品加入溶剂后其使用不应超过2天。 2. 通电打开GPC系统各模块。 3. 确认系统在使用 THF时没有盐析出且没有溶剂不互溶的现象,否则用 水或过渡溶剂异丙醇充分冲洗系统。 4. 添加1L含有稳定剂的THF到1100单元泵的溶剂瓶中。 (对于四元泵只用 A通道) 5. 打开Purge阀并以5 mL/min流量purge该通道10分钟。 6. 关闭purge 阀并在不接色谱柱的情况下以1mL/min流量冲洗泵, 自动进 样器和柱温箱至少5分钟。

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三.仪器参数:
? 分析条件:
1. 如果GPC软件版本为A.02.01 或更高你可以从硬盘中调入下列方法: 路径 C:\hpchem\X\Methods (此处 X 仪器号)或者根据下列参数建立: ? OK_STAN.M – 用于分析聚苯乙烯标准 ? OK_SAM.M –用于分析宽带聚苯乙烯测试样品 这两个方法的不同在于积分参数和运行时间表”Run Time Checklist”。 对于窄标标准品和宽带聚苯乙烯样品需要不同的积分参数是因为它们不 同的峰形,当然也可以对这些参数进行调节以满足GPC系统对峰鉴定的要 求。 高聚物窄标标准品的分析是传统的HPLC分析, 不需要在运行时间表中激活 GPC数据分析软件。 方法参数:

对于聚苯乙烯标准的积分参数:(AK_STAN.M):

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对于宽带聚苯乙烯测试样品的积分参数:(方法 AK_SAM.M): (对于每个系统的保留时间和峰形需做特殊调节):

2. 改变流速到 0.5 mL/min 3. 在柱温箱中安装色谱柱,连接色谱柱入口到自动进样器,出口到RI检 测器,以0.5 mL/min的流速冲洗色谱柱30min以置换色谱柱中的溶剂(甲 苯),在此期间Purge RI检测器的参比池。 4. 提高流速到 1 mL/min 并维持至少2小时直到基线稳定。 5. 为了获得更好的精确度和准确度,建议在此条件下过夜。

四.数据采集:
1. 建立一个序列对每个样品各进样一次,进样量为50uL 2. 检查基线稳定性并运行序列。 3. 使用HPLC级THF为流动相和样品溶剂的典型色谱图如下所示:

4

标准谱图前四个峰为窄标聚苯乙烯随分子量降低的顺序流出。 在最后一个 标准峰流出后的单体峰是由于溶剂不纯所致,如果你使用含有稳定剂的

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THF,你会看到一个大的稳定剂负峰。其他的负峰主要由于进样期间的压 力降所致。 注意这些单体和压力降造成的峰会因仪器以及流动相和所使用 的样品溶剂不同而不同。

上图为典型的聚苯乙烯(宽标)测试样品谱图(黄色瓶)

五. GPC系统的校正与样品分析:
? 如何做窄标校正
1. 切换到或开启化学工作站并进入到"Data Analysis"画面。 2. 从 DATA\GPC_DEMO 子目录调入数据文件 002-0201 ,此数据含有使用 RI 检测器检测的聚苯乙烯标样混合物。 3. 通过 GPC | GPC-Settings...检查并修改 GPC 设置 参照下图:

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4. 从 GPC 菜单选择“Calculate GPC-Results”,GPC-Addon 软件将打 开并已经设置好基线,缺省的 default.cal 校正曲线用于产生分子量数 据。但是,这些分子量肯定不对,因为缺省的数据还没有与实际数据相关 联。 现在我们可以根据峰保留体积和已知的摩尔质量建立校正表: 1. 单击 Window |Calibration 并在 GPC-Addon 软件菜单栏使用 File| New 产生新的校正文件。 2. 激活 elugram window 在最左侧第一个峰 x-轴下右键单击并选择 find maximum

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3. 按照下面表格输入相应摩尔质量并选择添加到校正表 “Add to

calibration”
TABLE 1
Sample Data file Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 PS ReadyCal grn 002-0201 2180000 246000 32500 3420

分子量信息
PS ReadyCal red 003-0301 1000000 128000 18100 1620 PS ReadyCal wht 001-0101 659000 67500 9130 374

4. 对于峰 2 到 4 重复此步骤。. 5. 切换回化学工作站并调入下一个校正文件 (003-0301), GPC 菜单选 从 择计算 GPC 结果 “Calculate GPC-Results” 。(在计算机屏幕底部有缩 小的图标,单击即可) 6. 我们继续在 X 轴下面左数第一个峰的位置下单击右键并选择 find maximum ,在 GPC Addon elugram window 从表 1 输入相应摩尔质量并选 择添加到校正表 “Add to calibration”。 7. 使用数据文件 001-0101 重复步骤 4 到 6。 8. 当所有 12 个校正标准都已经添加到校正表后, 激活 Calibration 窗口, 使用 “PSS Poly 5" 来拟合数据,曲线的质量通过选择 Compare 下拉菜 单的 Deviation 来观察, 理想的曲线拟和应该是偏差点随机分布在标准曲 线的两侧,然后从菜单中选择 File | Save As 以“ps_thf” 作为文件名 存盘(使用 HPCHEM\GPC\目录来存储校正文件)。

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? 如何分析实际样品
1. 切换到或开启化学工作站并进入数据分析画面"Data Analysis" 。 2. 从 DATA\GPC_DEMO 子目录调入数据文件 049-0401(假设此数据文件 为实际分析样品且设置了正确的积分设置) ,此数据是用 RI 检测器检测 的聚苯乙烯宽标标样。 3. 通过 GPC | GPC-Settings...检查并修改 GPC 设置,参照下图: 点击…Browse,选择刚刚做好的标准曲线文件 ps-thf.CAL,在右侧 Report Settings 处选中 Print results,还可以在 Configure Print 处选择缺 省打印机以及文本文件,并输入要报告的文本文件名。然后选择 OK.

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4. 从 GPC 菜单选择“Calculate GPC-Results”GPC-Addon 软件将打开 并已经设置好基线,使用新得到的校正曲线 ps-thf.cal 对数据进行计 算。打印预览结果会显示在计算机屏幕上,但可能不清楚。要想仔细查看 结果,请在设置中选中打印机或通过文本文件来浏览。

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5. 浏览文本文件结果,使用搜索功能,输入 aaa.txt 进行搜索,找到打 开即可,结果如下:

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? 如何做宽带校正(高级操作)
窄标校正的适用范围最广, 其缺点是对于许多高聚物来说很难找到其自身 的窄标标样。因此由GPC得到的分子量数据(例如碳酸酯)是相对于标样 (例如聚苯乙烯) 为克服许多高聚物窄标难以得到的缺点, 的。 我们在GPC 软件中可以使用宽标或者普适校正来完成, 宽标校正需要使用一系列的 窄标标样(例如聚苯乙烯)为基础并使用样品自身的宽标标样(Mw和 Mn 已知)(普适校正则需要高聚物样品的Mark-Houwink常数),通过数学上 的迭代运算将窄标的校正曲线转换为所测实际样品的校正曲线。步骤如 下: 1. 切换到或开启化学工作站并进入到"Data Analysis"画面。 2. 激活 Calibration 窗口, 选择File 然后Open, 在CALIB子目录中选择 demo_gpc.cal并打开。

3. 在菜单工具栏选择 Calibration ,接下来选择 Guided Broad Calibration。

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      在所显示的窗口,阅读相关信息,然后选择 OK.

  

在 Guided broad calibration: Step 1 窗口选择Open stored overlay (请 参见后面的如何建立Overlay部分)

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在 gpc_demo子目录打开overlay文件Broad_add.ADD(请参见如何建立 Overlay文件部分)

  在 Guided Broad Calibration:Step 2 窗口选择Mn和Mw。指定Mn为100000 且Mw值为260000(此参数已知)。在 weight 栏均设为1。

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按OK离开此窗口

在 Guided Broad Calibration Step 3 窗口改变参数 Grid Eval.
为32(为节约时间, 拟和参数 A 和B 不要改变。若想获得详尽解释请参照 GPC 数据分析软件参考手册, p/n G2182-90001, Basic Theory of GPC一 章。)

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按开始计算 Start Calculation ,软件开始将基本曲线 demo_gpc.cal转换 为样品的校正曲线。 此转换基于 Mn-, Mw-的值和存储在.add文件中的流 出曲线轮廓图来进行。 Broad_add.ADD 含有一个流出曲线, 一个.add-文件最多可包含8个流出曲 线。转换精度随此数目增加而增加。

正在计算中

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计算完毕,在 Guided Broad Calibration Step 4 窗口显示出原先和新计 算出 (基于实际样品) 的 Mark-Houwink 常数 计算出的 Mark-Houwink常数可以和高聚物物性手册中的常数值进行比较 从而控制曲线转换的质量 。

按 OK 得到下一个窗口并询问是否产生新的校正曲线表 “Create new calibration table”。 按 Yes 并观察标记为摩尔质量一列的变化。 在tool工具栏(在菜单下) 单击 Overlay button

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(右数第三个图标) 获得基于校正曲线 (demo_gpc.cal)与经过反复迭代运算 获得的宽标校正曲线的重叠图。

  单击File| Save as将此校正曲线存名。

? 如何做普适校正
激活校正窗口 Calibration window 并调入文件demo_gpc.cal. 在校正 Calibration 菜单下选择普适校正 Universal Calibration.

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在普适校正窗口选中计算转换对话框Calculate tranformation。这将打开 另外两个对话框,再此对话框你可以输入基准化合物(聚苯乙烯)和所分 析高聚物的Mark-Houwink 常数,假定我们所测定的高聚物使聚氯乙烯 (PVC),其常数为a = 0.770 K = 0.0150 ml/g (参见 Polymer Handbook, 4th edition,John Wiley&Sons, New York,

Weinheim):

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在相应单元输入新的常数,按 OK 然后 Yes。 观察校正表中摩尔质量一列的变化,校正窗口的上部显示基准校正曲线 demo_gpc.cal 和由普适校正转换计算出的 PVC 校正曲线的叠加谱图。

单击File| Save as将此校正曲线存名。

? 如何建立Overlay
在使用宽标校正时需要首先建立宽标谱图的Overlay文件,这需要分析不 同分布的待测物质的宽标标样: 1. 切换到或开启化学工作站并进入到"Data Analysis"画面。 2. 切换到 GPC 画面,激活 Elugram 窗口, 选择 File 然后 Open(或打开 文件图标),在 gpc_demo 子目录中双击 049-0401 文件,然后选择 rid1A.CH 并打开。 3. 选择 Window| Elugram,到 Elugram 窗口, 选择 Overlay| Include curve 如下图:

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4. 重复步骤 1-3,依次打开 gpc_demo 子目录中 049-0402 文件,然后选 择 rid1A.CH 并打开。对于 049-0403;049-0404;049-0405 三个文件, 依次类推。(得到的不同宽标谱图数目越多,计算误差越小)。 5. 选择 Overlay|Overlay,然后选择 Option|Stacked Plot。

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6. 选择 File|Save as,以后缀.ADD 存名(以后用于宽标校正)。

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?

GPC 操作注意事项:

1. 由于几乎所有的 GPC 柱都不能耐受骤然的压力变化, 最好在 Pump 的设 置画面,将每分钟流量的增加速度设置为低于 10mL/min。 2. 在有机相 GPC 的使用中经常会使用到 THF,由于在空气中 THF 非常易于 氧化产生过氧化物,因而导致 RID 的基线连续向下漂移。而如果使用 N2 封的 THF 又会因有气泡而产生噪声。 建议采用含有 BHT 抗氧剂的 THF. 如果方法不允许,最好使用 N2 封的 THF 并配以在线脱气机。 3. 对窄标标样的分析,积分参数的设置并不重要,但是对实际样品的分 析则需要对积分参数进行优化,或者在 GPC 软件 GPC Settings 画面点 击 More GPC Settins 手动指定积分的起点和终点。

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