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黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性


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应用与环境生物学报

20 ,1 5 :1 6 2 0 5 1 ( )6 8~ 2 

Ch nJ Ap   i  plEnvr n Bil=I N 0 6-87 io   o SS 1 0 6 X 

黑 曲霉 Ap riu ie S 2 1 

se l sn r L —1  gl g     1 所 产 酸 性 蛋 白酶 的 分 离 纯 化 及 酶 学 特 性 
谢必峰   曹治云 郑 腾2 王水顺4   ,    
福州 福州 南京
广州

( 建 师 范大 学 生 物 工 程 学 院  福 (福 建 出入 境 检 验 检 疫 局   ( 京 农 业 大学 动 物 医学 院  南
( 砝玛西亚( 国) 限公 司  安 中 有

3 00   5 07) 20 9 ) 10 5 
500   10 0)

3 00 ) 5 0 1 





采 用 硫 酸 铵 盐 析 、ehd xG2 Spa e  .5柱 脱 盐 、 E E—SpaoeF s Fo DA eh r   at lw离 子交 换 层 析 、e hc l -0 s   Sp ar  2 0分 子 筛 层  yS

析和高效液相色谱等方法 , 从黑 曲霉 菌株 Apriu  i rS 21 1的发酵曲中提取 了一种酸性蛋 白酶 , S S—P G   se l sn e L —1 gl g   经 D A E 验证 , 酶纯化水平已达到电泳 纯. 该 该酶 的表观分子 量 ( ) M  约为 4 7×1  最 适 p 0, H值为 3 0 p . ,H稳定 性范 围为 2 5— .   6 0 最适温度为 5 ., 0℃ , 温度稳定性范 围为 3 6 0— 0℃ ; u 、 n 对 其有激活作 用 , g 、 g 其则有 轻度 的抑 制作  C“ M  H “ A  对 用; 该酶的氨基酸组成为 : 中极性酸性氨基酸 占 1.9 , 7 2 % 极性碱性氨基酸 占4 5 % , .0 极性 中性氨基 酸 占 3 .0 , 8 5 % 其它  为非极性氨基酸 ; N端氨基酸序列为 S G A q Q, K S V TP 经序列 同源性 比对 , 表明该 酶与其 它曲霉酸性 蛋 白酶具有极 高 的 
同源 性 .图 4 表 5参 1  5 关键 词 黑 曲霉 ; 性 蛋 白酶 ;分 离 纯 化 ; 学 特 性  酸 酶
C C Q 5 . :Q 4 .2 .0  L   56 9 9 9 3 7 16

PURI CATI N  o AND  CHARACTERI STI   F  CS o ACI PRo TEAS D  E  FRoM   A  愀 G儿  【 Ⅳ    R  L2. 1   S 1  1

XI   f n  ~ 。CAO  iun E Bi g e Zh y  .ZH ENG  n   & W ANG  h s un Te g '   S uih  
( ol eo ieh o g ,Fj nN r a  nvrt,F zo 5 0 7 hn )  C lg  Bo cnl y ua   om lU i s) uhu3 00 ,C ia  e f t o i e i  ( n et nadQ aa t eTcnqeC ne o uin uhu30 0 , hn )  Is c o n   u rni  eh iu  et  Fj ,F zo 50 1 C ia  p i n rf a ( oeeo e r ayMei n , aj gA r utr U i rt, aj g 10 5 hn )  C lg  Vti r  dc e N n n gi l e nv sy N ni   0 9 ,C ia  l f en i i c u   ei n2
( A esa P a m c   it h C . t . Gu n z o   1 0 0,C i )   m r m  h r a i B o c  o ,Ld , a gh u5 0 0 h a e hn   a
Absr t Acd pr ta e prud e   y A e茸 t ac  i   oe s   o uc d b     r   nge  sp i e  o ee r p rtc h mo e e t  y t e meho so   i rwa  urf d t  lc o hoe i  o g n iy b  h   t d   fammo i  i n—

u s lae p e i tto m  uf t  r cpi in,DEAE — S ph r s   a tF o c l mn hrm ao r p y,Se a r lS 2 0  oumn c r mao a hy a d a e a o e F s  l w  o u  c o tg a h ph c y  - 0 c l  h o tg p   n   r h g  p ro ma e lq d c o i h e r nc   iui  hrmatg a y. Is p iy wa   h k  t  e a o ta sn l  n   y SDS — PAGE. Th   lc a   f o rph t  urt  s c ec ed o b   b u    ig e ba d b   e mo e ulr

w ih ( )o L -1  cdpo a e a a o t 7×1  te pi u   H 3 0 a do t u   m ea r 5 eg t M  f 2 1 1ai rt s  s b u 4 S       e w     0 , h   t m p   .  n  pi m t p r u e 0℃ .T ee z m   o m m e t   h  n y e
a t i   sv r  tb e u d r h   H a gn   e w e   . —6 0 a d u d rtmp rt r a gn   ew e   0 —6 ℃ .C “ a d ci t wa   ey s l  n e  e p rn ig b t e n 2 5 vy a t .   n   n e e e a u e rn ig b t e n 3 0 u n 
Mn   s o d a   bvo s a tv to  o t e acd pr ta e.whie h we   n o i u   cia in t  h   i  oe s l Hg a dAg sih l nh btd is a tvt . Th   c d c a n     n     lg ty i i i   t  c iiy e e a i i  mi o

a i  o t n  f h   n y   a   7. 9 , l ai e a n   cd4. 0 a d n u rla n   cd 3 . 0 ,a do h r  r  o p — cd c n e t   ee z me w s1 2 % ak l   mio a i  5 % n   e ta mio a i  8 5 % ot n n   te swee n n o 

l  mn cd.T eN t i l at l eunew sS G A q P r a a i ais h  - r n   ra sq ec  a  K S V T Q,w i   dctdahg  o o g  i  t r rt ss o e m a p i  hc i ia    i h m l ywt o e  oe e  hn e h o h h p a
prdu e   y A p r lu . F g4,Tab5 ,Re   5 o c d b   s egils i   f1   Ke w o d   A  e茸 y rs r  nie ;a i   oe s g r c d prt a e;pu iiai n;c a a trsi  rfc to h r ce itc

C C Q 5 . : Q 4 .2 .0  L   56 9 9 9 3 7 16

曲霉 酸 性 蛋 白酶 ( C34 2 .8 E   ..3 1 ) 一 类 适  E  . .3 1 , C3 4 2 .9 是

用最广泛的饲料酶制剂. 外 , 此 曲霉 酸 性 蛋 白酶 还 广 泛 应 用 于 

合在酸性环境 中( H 2 0— . ) p  . 5 0 分解蛋 白质的酶类  , 括曲  包 霉 胃蛋 白酶 I( se ioes  ) 曲霉胃 蛋 白酶 I ap ri  ap r lp pi I 和 gl n I seg— ( l l es   ) o pi I 两大类 , p nI 由于能够提高单 胃动物 ( 特别是幼龄动物 )  
对 饲料 中蛋 白成 分 的 消 化 吸 收 率 , 进 其 生 长 发 育 , 促 已成 为 应 
收稿 1期 : o 40 _2 3 2 o _70  接受 日期 : 0 4 1.2 20 .01  ?福 建省 重 大科 技 项 目 (00 Z 3   S p ot  yteK ySinead 2 0 -00) u pr db    e cec n   e h
T cn l yPo c f ui , hn  ehoo  r et   j n C ia g j oF a

酿造工业 、 制革工业 、 临床医学 、 白的酶解等方 面, 蛋 是一 类具 
有 巨大 工 业 应 用 潜 力 的酶 . 关 曲 霉 酸 性 蛋 白酶 的 分 离 纯 化 和  有

酶学特性方面的研究 , 早在 2 0世纪 7 0年代 就 开始 了, 主要 是 
围绕 该 酶 的 一 些 基 本 性 质 例 如 氨 基 酸 组 成 、 子 量 、 分 N端 和 C  

端序列 、 最适反应 条件等展开的 , 大量 的研究结果 表明 , 曲霉产  酸性蛋 白酶 的最适作 用 p H值为 3 0 在 5 . , 0℃ 以下较 为稳定 ,   A  对 曲霉产酸性蛋 白酶有轻度 抑制作 用 , u 、  对 其有  g c “ Mn 激活作 用 , u 、 “ 和 A ” 同 时 添 加 时 , 酶 有 协 同 作  c “ Mn 1 对

?? 系作者  C r so dn uhr( - i fi ju eu C ) 联 or pn i ato Ema :bx @f .d .B  e g l e n

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5期 

谢必峰 等:黑曲霉 Ap riu n e L —1 所产酸性蛋 白酶的分离纯化及酶学特性  segls i rS 21 1 l  g

69 l 

用 “] 目前对于 曲霉酸性蛋 白酶的研究侧重于工业应用价值  .
方 面 的探 讨 , 特别 是 在 饲 料 工 业 上 , 国学 者 在 这 方 面 进 行 了  我

S p arl -0 析柱 ( .  ehcy S20层    16i 0c , 同样的缓 冲液洗  n×7 m) 用
脱 , 步收集并测定蛋 白含量 和酶 活力 , 分 冻干成酶粉备用. 取分  布收集所得较高的活力组 分在 p  . H 5 4的醋酸- 醋酸钠 缓 冲液 

大量 的研究 . 费笛 波等  对黑 曲霉 变异菌株 6 4 02产生 的酸性  蛋 白酶 的性质及其作 为饲 料添加剂 的应用进 行了研究 , 结果表  明, 酶作用条件基 本与 动物 消化 道生 理条 件相 适应 , 适 p   最 H
3 0— . , 适 温 度 为 4 5   在 最 佳 作 用 条 件 下 , 酵 母  . 35最 0— 0o C; 对

中于 4℃透 析过夜 , 1m 取   L样 品加 到预先用 同种缓 冲液平衡 
过的高效液相色谱 H Q阴离子柱 , 用含 0 8m lLN C 的醋酸  .  o   a 1 /


醋酸钠缓 冲液进行 0—10 0 %梯度洗脱 , 收集 洗脱组分 , 检测 

和鱼粉具有 明显 的降解 作用 ; 动物饲 养结果 表明 , 该酶是 一种  较 理想 的饲用酶制 剂. 王淑军等  对 肉桂 色 曲酶 9 2 84菌株 酸  性蛋白酶的酶学性质和断奶 仔猪的喂养效 果进行 了研究 , 结果  表明 , 该酶最适 p H为 3 0 最适作用温度 为 4 ., 0℃ , 具有 较好 的  热稳定 性 , 0 1 添加 到断奶 仔猪 日粮 中 , 以 .% 日增重 和饲料 转  化率都表明该 酶是一种有 效的添加剂 , 并有效地控制 了腹泻 .   黑曲霉是 目前工业应 用最广泛的酸性蛋 白酶生产菌种 , 本 

蛋 白含 量 和 酶 活 力 .  

1 7 酶 学特性  .
17 1 酶的分子量  ..  收集液相色谱 H Q阴离子柱 的酶 活峰 
进 行 1. % S S一聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 , 马 斯 亮 兰 染 色 1  25 D 考 0 a , r n 再 经 0 5m lL N C 脱 色 2—3h i .  o   a 1 /  .  

1 72 酶反应 的最 适 p .. H值及稳定性 范围 

确定该酶 的最 

适p H值 时 , 使用纯化的酶液 , 在温度 4 0℃下 , 分别在 p   .   H 10、 2 0、. 、. 、. 6 0的柠檬 酸 一N 2 O . 3 0 4 0 50、. aHP  缓 冲液中保 温 1  0
an测 ri, 定 酶 活 力 .  

研究是在选育一株产酸性 蛋 白酶 活力较 高 的黑 曲霉变 异菌株 
Apriu   rS 2l 1 的基础 上 , se l sn  L -1 gl   对其 所产 的酸 性蛋 白酶  进行 了分离纯化 , 并进一步 对其 酶学特性进 行 了研 究 , 为探讨  该菌株产生的酸性蛋 白酶用作 饲料添 加剂 的可能性提 供理论  依据. 该酶 的氨基 酸组成和 N端的部分序 列 的测定 , 为分子水  平研究工作奠定 初步的实验基础.  

确定该 酶的 p H稳定 性 范 围 时 , 将纯 化 的酶液 分别 置 于  p   . 、. 、. 、. 、 . 、 . H 102 0 3 0 4 0 5 0 6 0的柠檬 酸 一N 2 P  缓 冲液  aH O 中, 室温下放置 2 . p  . 4h 用 H 3 0的乳酸 一乳酸钠缓 冲液稀释一  定 的倍数 ,| 4 D℃下保温 1  i, 0mn 测定剩余酶 活力.  
173 酶 反应 的 最 适 温 度 及 稳 定 性 范 围  . .  确 定 该 酶 的 最 适  温度 时 , 纯化 的酶 液 , p  . 将 在 H 3 0的 条 件 下 , 2 的 酪 蛋 白  以 % 为底 物 , 别 在 3 分 0℃ 、o℃ 、 ℃ 、5℃ 、0 、5℃ 、0℃ 、 4 5 0 5 6  6 7   8 O℃ 下 保 温 1  n 测 定 酶 活 力 . 0mi,  

1 材料 与 方法 
1 1 菌 种  . 
黑 曲霉菌株 A / r L —1 .n e  21  g S  1由福建 师范 大学生物工程学 
院微生物工程研究所提供.  

确定该酶的温度稳定性 范围时 , p  . 在 H 5 0的条件 下 , 酶  将
液置于 4 0℃ 、0℃ 、5℃ 、0℃ 、 5 5 6 7 0℃ 水浴 中保 温 处理 , 隔 加  每 m n取 1m i   L酶 液 , 定 酶 活力 , 测 以未 保 温 的 酶 活力 作 为 对 照 .   174 金 属 离 子 对 酶 活 性 的 影 响  .. 在 各 组 纯 化 的 酶 液 中分  

12 主 要生化 试剂  .
DE   e h d x F s F o S p a e   2 S p a r l - 0   AE S p a e   a t lw、 e h d x G- 5、 e h c y  2 0:   S

安砝玛西亚公司 ;A B C蛋 白检 测 试 剂 盒 、rdod试 剂 、 Bafr 牛血 清  

白蛋 白( S : IR E公 司 ; 烯酰胺 ( C 、 B A) PE C 丙 A R) 甲叉 双丙烯 酰 
胺 ( I) 双 甲 基 乙 胺 ( E D 、R S Ti碱 、D 、 硫 酸 铵 、 BS 、 T ME ) T I 、r s S S过  


别 添加 金属离子盐类母液 ( 2 , 其终浓 度为 5m o L 室  表 )使  m l , / 温 下静 置 3   i, 0 mn 测定 酶活. 以未添 加金属 离子酶 液的酶 活  并
力 为 10 , 定 各 组 的 相 对 酶 活 力 . 0% 测  

巯基 乙醇 、T 、 D Y 考马斯亮蓝 R 20: -5 上海生物工程公 司.  
按 Fl o n法 , 活 定 义 为 : 4 ℃ 和 p   . 件 下 , 分   i 酶 在 0 H 3 5条 每

13 酸 性蛋 白酶 酶活测 定  .
钟水解酪蛋 白生成 1p  , g酪氨酸 所需 的酶 量为 一个 酶 活力 单 
位 , U表 示 . 以  

1 8 N端 部分 氨基 酸序 列测 定  . 
取 纯化 后 的 酶 样 品 , 用 P 采 E公 司 的 46型 测 序 仪 进 行 N 7   端 测序.  

19 氨基 酸组 分分析  .
取 纯 化 后 的 酶 样 品 在 10—10 o , 6mo L的 H 1 0 2  C下 用   l / C  溶 液 真 空 水 解 2  4h后 , 用 日立 L80 采 -80型 氨 基 酸 分 析 仪 进 行 
检测,  

14 蛋 白质 含量测 定  .
参 考 Lwye a.(9 1 的 方 法 J o r   1 15 ) t .  

15 粗 酶的 制备  .
在 以麸皮为主 的培养基 中, 黑曲霉菌株 S2 11经 固体 发  L —1     酵 4  8h获得含 酶发酵物 , 1 N C 溶液 以 1 :1体积比浸  用 % a1 0
提得粗酶液.  

2 结 果 
2 1 酸性 蛋 白酶 的分 离纯化  .
将 浸 提 后 的 粗 酶 液 用 4 % 一8 % 的硫 酸 铵 饱 和 度 进 行 分  0 0 级 沉 淀 , 沉 淀 悬 浮 于 p   . 0 0  o L N   P  一0 0   将 H 5 4、. m l   a H O 4 / . 2

16 酶的分 离与纯 化 【m  . 9】 ’
将浸提液用纱布挤滤 , 除去 菌体 , 向滤液 中加入 固体硫 酸 

铵进行分级沉淀 , 收集 4 % 一 0 的硫 酸铵饱 和度沉 淀组分 , 0 8%  
将其悬浮于 p   . 0 0   o L N 2 P  0 0  o L柠檬 酸  H 54、. m l   a H O -.2 m l 4 / / 缓 冲液 中 , 制成酶液. 1  将 5mL酶液 加到 预先用上述缓 冲液平  衡 的 D A -ehrs at l E ES p a eF   o o s F w层析 柱 ( 16 i 0c ,   .  n×2  m) 用  含 0— .  o LN C 梯度 的上 述缓 冲液进行线 性洗脱 , 集  0 8m l   a 1 / 收 活力组分 , 检测蛋 白含量和酶活力 , 冻干备用. 将上 述酶粉用 少  量 p  . 0 0   o LN 2 P   . 2m lL柠 檬酸缓 冲液 溶  H 54、. m l   aH O 0   o 4 / / 解 , 2m 取   L加到预先用该缓 冲液 ( 0 0 % 的 N N )平衡 的  含 .1 a 

m lL柠檬 酸缓 冲液 中. 用离 子交 换 D A o / 使 E E—Sp aoeF s ehrs  at   Fo l w层 析柱分别收集含有 酶活 的洗脱峰 1 图 1a , ( .) 再用分 子  筛 Sp ar -0 eh c l 20层析柱 分离 , yS 得到 含有酶 活 的洗脱 峰 2 图  ( 1b , 一 ) 最后使 用 高效液 相色谱 的 H Q阴离 子柱分 离 , 洗脱 峰 3  
为 活 力 组 分 ( 1C . 得 样 品 经 S SP G 图 -)所 D —A E检 测 呈 现 一 条 清 

晰的条带 ( 2 . 图 ) 酸性蛋 白酶的纯化 倍数 为 4 . , 6 7 酶的 比活力  由 1  / g提高到 4 4 1U mg 回收率为 1. % ( 1 . 0U m 6 .  / , 23 表 )  

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5期 

谢 必 峰 等 :黑 曲 霉 Apriu ie L —1 产 酸 性 蛋 白酶 的 分 离 纯化 及 酶学 特 性  seglz. rS 211所 l g

6l 2 

10 2  10 2 
1   00

10 0  3  O 8  O 6  O 4  0 5  O
‘ 

8  O 6  O 4  O 2  O O   3  5

6  0 7  0

4  O 2  O 0   4  O 4  5 5  O 日 ℃  / 5  5 6  O 6  5 0   2  O 4  O 6  O 8  0 10 2  ,m i  / n

8  0

图 4 酸 性 蛋 白 酶纯 化 酶 的 反 应 最 适 温 度 ( ) 热 稳 定 性 ( ) a和 b 
Fg 4 E e t f e p rtr  na t i a n  tbly( i.  f c o  m eaueo  ci t   t v y( )a d s it b)o c   r es  a i f i po ae ad t

2 2 4 金 属 离 子对 酸性 蛋 白 酶活 性 的 影 响  ..

金 属 离 子 对 酸 

性 蛋 白酶 活性 的 影 响试 验 结 果 表 明 ,u 、 n 的 添 加 使 酸 性  c“ M “ 蛋 白酶 的 相 对 酶 活 力 明 显 提 高 , 别 为 17 6 和 180 , 分 3.% 4 .% 而 
Hg  2


2 3 酸性 蛋 白酶 的 N端序 列  .
取提纯后 的酶液于 P E公 司生 产的 46型的测序 仪上进行  7 N端测序 , 其前 l 0个氨基酸序列见表 3 与其它菌株 的 N端 序  ,
列 同源 性 比对 结 果 见 表 4  . 表 3 酸 性 蛋 白酶 N 端 部 分 氨 基 酸 序 列 
Ta e 3 Amio a is o   t r i ls qu n e bl   n   cd   fN—em na  e e c  

A  的添加 使酶 相对 活 力略 有 降低 , 别 为 8 . % 和  S 分 49

8 .% . 15 因此 c “ 、 “对 该酶 具 有激 活作 用 , H “ 、 g u Mn 而 g A  则对该酶有轻度的抑制作用 , 试验 中的其余金属离 子对酶液的  酶活力乎没有影响 ( 2 . 表 )  
表 2 金 属 离 子 对 酶 活 性 的影 响 
金 属 离 子 Me los t   n  ai 对 照 C nrl ot   o
  1 KC1  
L2 o   is ,

A %  / 10 0 0 . 
1 3.   0 2
9 4 7.  

金 属 离子 Me los t  n  ai Mn 1 C,  
Cu O4 S  
Mg O4 S  

A %  / 17 6 3 . 
1 8.   4 0
9 6 4.  

2 4 酸性 蛋 白酶的 氨基酸 组成  .
取提纯 后的酶液于 日立 L80 一80型氨基酸分析仪 上进行氨  基酸组成的测定 , 结果表 明, 该酶的氨基酸组成中 , 中极性酸性  氨基酸 占 l .9 , 7 2 % 极性 碱性 氨基 酸 占 4 5 % , 性 中性 氨基  .0 极
酸 占 3 .0 , 它 为非 极 性 氨 基 酸 ( 5 . 85% 其 表 )  

AN   g O3 ( H )S   N 4 2o ,
Ca , Cl  

8 .  49 17 6 0 . 
9 2 8.  

ZS 4 n O  FS 4 e O 
Pb AC.  

9 .  12 9 .  08
93 8 . 

H c2 g1  

8 .  15

E T  DA

l4 6 0 . 

表 4 N端 序 列 同源 性 比对   
Ta l    N— r n l e u n e o  u f d a i  r ta e a d c mp r o   i   t e   n y s be 4 t mi a  q e c   fp r e   cd p o e s   n   o a s n w t oh re z me   e s i i i h

表 5 酸 性 蛋 白酶 的氨 基酸 组成 
氨基 酸 A n cd mi ai o   p I L /x m   g 氨 基 酸 A n cd mioai   p I    / gmL x

天 冬 氨 酸 ( s) A p  苏氨酸(h) Tr   丝 氨 酸 (e) Sr   谷氨 酸 ( l) Gu  甘 氨 酸 ( l) G y  丙 氨 酸 ( l) Aa  胱 氨 酸 ( y) C s  缬 氨 酸 (a) v   1 蛋氨 酸 ( t  Me)

34 9   1 .7 2 55   5 .0 3 12   4 .4 25 0   7 .7 27 0   6 .0 l1 5  1.9 9.2 2 3  3 6 6  7.1 /  

异亮 氨 酸 (i) 1   e 亮氨酸(e ) L u  - 酪氨 酸 ( y) Tr 苯丙氨酸( h) Pe 赖 氨 酸 ( y) Ls  组 氨酸 ( s  Hi) 色氨 酸 ( r ) Tp  精 氨 酸 ( r) Ag  脯 氨 酸 ( r) Po 

1 10  0 .9 2 0 9  5 .6 42 1 0 .1   4 0 0  2. 4 l4 9  3.0 9 1  .2 /   9 6  .7 5 .2 0 3 

3 讨 论 
3 1 作者在完成复合酶优质高产菌株选育及其发酵工艺研究  . 的基础上 川 , 进一步对其 中的酸性蛋 白酶采 用硫 酸铵盐 析、  

离子交换层析 、 分子筛层 析 、 高效液 相色谱 的方法进 行 了分离 
纯 化 , 果 表 明 , 酶 已达 电 泳 纯 程 度 . 结 该 由纯 化 总 表 可看 出 , 虽 

然纯化收率较低 , 但达到 了纯化 的 目的.  

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应 用 与 环 境 生 物 学 报 

C i  p l n i nBo  hnJA p  v o   il E r

1 卷  1

3 2 对 提 纯 后 的 酸 性 蛋 白 酶 进 行 了 酶 学 特 性 研 究 . 得 其 表  . 测 观分子量约为 4 7×1  该 酶 最 适 作 用 p 为 3 0, p   .   0. H . 在 H 2 5~ 6 0范 围 内具 有 活 力 稳 定 性 ; 适 作 用 温 度 为 5 ℃ , 度 稳 定  . 最 0 温 性 范 围 为 3 6 ℃ , 酶 具 有 良好 的热 稳 定 性 ; u 、 “ 对  0~ 0 该 C “ Mn 酸 性 蛋 白酶 有 激 活 作 用 , g 、 g 对 酶 有 轻 度 的抑 制 作 用 , H“ A  该 

4 Rec a d U,Ei e t H, R c e    ih r  f r   u h l R. P rf a i n a d c a a t r a in o   u i t   n   h ce i t   f i c o r z o

a xrcl l   prcpoens o  seglsu g ts   dVt net el a a at rti e rmApriuf mi u.JMe e a u rs i a f l a  
My o ,19 3 6 : 2 4 6 cl 9 4, 2( ) 4 7~ 3  

5 Fi   e DB ( 笛 波 )   费 ,Qi   Y ( 玉 英 ) eL ( 玲 玲 ) X   X aY n 钱 ,Y   L 叶 ,uY   ( 尧 兴 ) Fn  Q ( 观 泉 ) tdso h h at sc f ed 许 ,e gG 冯 .Suy ntecac e tso fe  r i ri  
a i  r t i a e b   p r l s n g rsr i   0   n  t  p l ai n c d p o en s   yAs egi u   i e  t n 6 42 a d i a p i t .A t   l a s c o ca

酶的酶学特性基本符合 曲霉产酸性蛋 白酶的酶学特征. 畜禽 主  要消化部位的温度 、H值等条件 决定 了其是否适 合作 为饲料  p 添加剂 , 消化 道 的温度 大 约为 4 0℃ , 胃部 的 p H值 为 15~ .  
3 5 小肠 的 p 值 为 5~ , 该 酶 在 4 .、 H 7而 0℃ 时 几 乎 可 以 保 持 酶  活不变 , 作用 p 值 稳 定 范 围 使 其 既 能 经 受 胃 部 酸 性 环 境 而 不  H

A rZ eagni 浙 江 农 业 学 报 ), 9 7, ( ) 30~ 0   gi hj nes   i s( 19 9 6 : 0 3 4

6 WagS 王淑军)   n J( ,WagY ( n  K 王永坤) a  K ( ,G oH 高和坤 ) ag ,Y n  C 扬从 发) h nJ( F( ,C e  陈静) tde npout n h at ii   .Su i o rd co ,ca ce sc s i r r ts
a d a p i ai n o   e d a i  r t i a e p o c d b   o r i u  cn a   n   p l t   f f e   c d p oe n s   rdu e   y As eg l s i n — c o l

m t u t i 92 .J C i Cra o ̄ 3 r n 84   hn eel i sa     s& Ol As ( 国 粮 油 学 报 )  i  s 中 s ,
2 0 l ( : 3~6   0 2, 7 4) 6 6

失活 , 又能在 小肠 中发挥 降解蛋 白的作 用 , 促进 营养物 质的 消 
化吸收 , 因此 该 酶 是 一 类 比较 适 合 作 为 饲 料 添 加 剂 的 酶 制 剂 .  

7 WagS 王水 顺 ) LnJ ( 近 哲 ) Z ag W (   n S( , i  林 Z , hn  J 张金 玮 ) S i Q , hQ    

但其最适作用温度 (0℃ ) 5 比畜禽 消化道 内 的温 度略高 , 以  难 达到最大 的催化效力 , 因而应对其 进行 分子改性 方面 的研 究 ,   以期使其最适温度与作用环境温度一致. 上述酶学特性 资料 为 
该 酶 在 饲 料 上 的 应 用 以及 进 一 步 的 分 子 生 物 学 研 究 提 供 重 要 

( 施巧琴) i B 谢必 峰 ) cenn f se iu  ie L 1 1 ,Xe F(   .S r igo Apr l sNgrS 2 1  e gl
wt hg il m hcm o et ny s h ra   ieh o 药 物 生  i  i y d u io p nn  zm .P am cBo cnl( h h e  E t 物 技 术 ) 0 1 8( ) 3 7~3 1 ,20 , 6 : 1 2 
8 L w yOH ,Ro mu hNJ,F r    o r   ̄b s  arAL.P oenme eme tw t h   o  rti   ̄ur n  ihteF —
l   h n e g n . BilCh m,1 5 i p e ra e t n o  e 9 2,1 3:2 5 ~2 5 9 6 7 

的参考数据.   33 经查询  . , 氨基酸 序列 的同源性 对 比结果表 明 , N端  

9 汪 家 政 ,范 明.蛋 白质技 术 手册 .北 京 : 学 出 版 社 , 0 0 8   科 2 0 .19~
1 7 ,2 2 ~21   9 1 9

作者所纯 化 的酶 与 A i rA at 、 .a anF、.fmi 一 .ng 、.si iA w l iA u g   e o o a


A /u n 等菌种所产 酸性 蛋白酶具 有极 高 的同源性 .通  .nd / s a

l 苏拔贤.生物化学制备技术.北京 :科学出版社 , 9 4 9~1 1 O 19 .9 1  1  WagS 王水顺 ) unC( 1 n S( ,Y a  袁彩 ) C e R( , hnJ 陈静蓉 ) aHM ,M    
( 马宏 敏 ) h  Q ( 巧 琴 ) i B ( 必 峰 ) ,Si Q 施 ,Xe F 谢   ,WuS ( 松   G 吴
刚 ) oi f me t in o  segl sng rS 一1  rd c g mut  .S l  e na o   f pr iu  ie L 1 1 po u i   l— d r t A l       n i

过 N末端 氨基 酸序 列的同源性 分析 , 得如下结 论 : 作者筛  可 与
选 的菌 种 所 产 酸 性 蛋 白酶 具 有 10 同 源 性 的有 3种 曲 酶 ,   0% 具

10 同源性 的序列位点分别位于 7 7 0% 0~ 9位和 l 0位 , ~l 氨基  酸总数分别为 34个和 30个 , 9 2 多数酶 具有前 体 , 分子 量都小 
于4 2×1  与 A f mg ts A n 0 , . u iau 和 .   所 产蛋 白酶具 有 1  

ezm s n  coi 工 业微 生 物 ) 2 0 , 1( : 6~ 0 ny e.1dMi b l( r o , 0 1 3 4) 2 3  
1   Bek   2 ra RM ,W ad M ,W io   J,Ha e g   J,Ko a   r  l nL s y n aK d maKH.Calm— ro  
a n   P,Th mp o   A. Moe u a   ln n   n   e ei n o   h   e e goL o snS l c l co i g a d d lt   f t e g n   r o e c i g a p r ilp n o n   s e g l e—p i   fo A p r i u   wa n.Ge e 1 9 , d o s n A r m  s e g l sa mo l n 9 0 


个和 3 氨基酸的差异. 个 而作者所纯化的酸性蛋 白酶的准确分  子量为多大 , 有无 前体 , 的氨基 酸组 或是 否具 有特 异性 ( 酶 因  为酶活高 ) 此酶与 其它酸性 蛋 白酶全 序列 的 同源性 有 多高 , ,   差别在哪里等一 系列 的问题都 有待 于通 过正在 进行 的 c N   DA

8 6:1 3 5  1   Oso l v k y  VI 3 tsa s a a ,Re i a L vn   P,Ko l v   t a EK o


S r v   A。 L v n D 。 uo a I e i E  

T mo — h n   i k i a EA, S e a o  VM . T e p ma y sr cu e o  s e g l tp n v h   r r   tu t r   f a p ri— i   lp p i   o e s n A, a p ri  r t i a e fo As egi u   wa r V :a n   s a t p e n s   r m  p r l s a mo i c u l  I mi o a i   e u n e o  h   n y .Bio g K i ,1 8 c d s q e c   f te e z me o r  h m 9 6 1 2:1 3 ~1 7 00 4 0  


克隆得到其全长氨基酸序列后再进行分析.  
R eb e e   fr nc s

l   L   F,lo e H,Ki r  4 uJ nu  muaT,Ma a   kbeO.T k a h  a a s iK. Moe ua l— b lc l co  r
n n   fa c ig o    DNA fr p o ts     r m  s e g l s nge  a   o   re a e B f o A p r i u   i rv l r
. .

l 张 树政 .酶 制 剂 工 业 .北 京 : 学 出版 社 ,18 .6 6 科 94 4 
2 T ui   E d   .P r ct n a dc aatr ai  f h   omo c .   sj aY, n o A u f ai   n   h rce z t n o  et   l u  t i i o i o t w e
1 rf r   fme mn   cd p o e s   rm  p r i u   ,  a   mso   mb o e a i  r ta e fo Ase g l s 0) ∞ l :


ma m s o u    ̄ p rs

a d s qu n e c mp rs n w t  t e   s e gl p p i sI Bis i o eh   n   e e c   o a o   ih o h ra p r il e sn   i o o c  tc — Bi n lBic e ,1 9 o  o h m 9 5,5 9:9 4~9 5 5 5   1   S i tniT,I h s i   5 hna   c ih ma E. P ma   t c u e o   s e g l p p i    e   i y r r sr t r  f a p r i o e sn I d — u l d c d f m  u l o ie s q e c   ft e g n   n   s a t   c d 7  s a   u e  r o n ce t   e u n e o  h   e e a d a p ri a i - 6 i  n d c e s n i la t e s t  ft e e z me f r t p io e   c ia in s e t   c i   i o  h   n y     r s n g n a t t a v e o y v o B o h sAca,1 9 ,1 0 ip y  t 9 4 2 4:2 7~2   5 4 6


Eu    o  rJ Bi.

ce h m,1 7 . 4 ( ) 3 7~3 3 98 8 2 : 4 5 

3 Tui  E d  .P r ct nadc aatrai  fh  omo c—   sjaY, noA u f ai    h ceztno  et   l u  t i i o n r i o t w e
l r fr  o   s e g l s r z e a i p e a  o ms f A p r i u  o y a   c d mt  ̄e l


B o hi i c m B o h s Aca ip y   t

B o hi i c m 

,  

1 7 , 4 1 :1 4—2 4 9 6 4 5( ) 9 0 


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