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玉米秸秆发酵制酒精的初步研究


中国农业大学 硕士学位论文 玉米秸秆发酵制酒精的初步研究 姓名:江滔 申请学位级别:硕士 专业:环境工程 指导教师:李国学 20060601

摘要

本文研究了玉米秸秆发酵制酒精过程中稀酸水解的规律以及鲜秸秆和风干秸秆水解性的差 异,并通过正交试验确定了稀酸水解的最佳条件:对糠醛产生的规律进行了研究,找出影响水鳃 液中糠醛浓度的主要因素

:筛选出四株戊糖发酵菌,组成复合菌系,并进行了初步的发酵试验a 研究结果表明:

风干秸秆的水解主要是以半纤维素为主。在水解液中,戊糖在还原糖中的比例在70%以上,
随着温度和稀酸浓度的上升纤维素的水解有明显增加。温度和稀酸浓度对水解的影响最为显著,

其次为时间和圃含物,粒径在试验范围内没有明显影响。正交试验确定最佳水解条件为:温度。
120℃;时间,80min;稀酸浓度,1.5%;粒径,20目;固含物,10%。

与风干秸秆相比,鲜秸秆发酵产物水溶性糖含量更高(1.65倍),中性洗涤纤维含量低(0.80
倍)。在相同条件下,水解还原糖得率高出25%.60%,同时鲜秸秆在20.30min和1.0%酸浓度条 件下就能达到展佳水解效果。

影响水解液中糠醛浓度的主要因素是还原糖浓度、时间,而温度和固含物对其影响不大,稀
酸只对鲜秸秆水解有明显影响。本试验所得的糠醛浓度范围内,Triehosporonaquatile菌受抑制显
著。

在发酵前期(2天)复合菌系对还原糖基本利用完毕。发酵液的pH值先下降后上升,最后 保持在弱碱性。发酵产物主要是乙醇和甘油。浓度分别为:1.15mg/mL和0.81mg/mL。

关键词;稀酸水解,玉米秸秆,乙醇,发酵,产物

Abstract

The procedures for obtaining ethanol from com straw by fermentation were studied in this paper.

Different factors that influence hydrolysis

rate

of corn

straw,including hydrolyzing

temperature,

hydrolyzing time,concentration ofdilute sulfuric acid,granularity ofCOITI straw and solid concentration were studied.The experiments results showed that during the hydrolyzing process the hydrolysis of

hemicellulose is primary,and the cellulose would be hydrolyzed better in higher temperature and higher
acid concentration.The influences oftemperature,hydrolyzing time,concentration ofthe dilute sulfuric acid and the solid content in hydrolyziog process were all very prominence,especially the temperature and the concentration of the dilute sulfuric

acid.Tllrou曲the

orthogonal experiment WO obtained the

optimum hydrolysis conditions:120℃,80rain,10%solid concentration,1.5%sulfuric acid and the

granularity ofeom
Compared with

straw is 1.Omm.

air-dry
corn

straw,the

fresh corn

straw

had

more water—solubility

sugar

and less

lignocellulose.Fresh

straw could be hydrolyzed more easily.It need less hydrolyzing time,and

lower sulfuric acid concentration. The concentration offurfurai in the hydrolysate was determined by the concentration ofreductive sugar and hydrolysis time.The concentration of sulfuric acid only influenced the concentration of furfurai in fresh straw’s hydrolysate.The concentration of furfural al the experiment level restrained the zymogen Trichosporon aquatile significantly. During the fermentation the reductive sugar WOB utilized in first two days.The pH of the fermenting liquor Was declining in the beginning because the produce of

organic acid,and

it was dsing in the

coming days because the esterification of organic acid.The main productions of the ethanol

fermentation

were

and glycer01.Their

concentrations were 1.15mg/mL

and

O,81mg/mL respectively.

Key words:Dilute sulfuric acid hydrolysis

Corn straw

Ethanol

Fermentation

Productions

lI

图表目录
表1.1利用不同底物的乙醇发酵菌生物特性………………………………………………………10 表3-1单因素试验水平设置…………………………………………¨.…………………………….17 表3.2正交试验因素及水平设置……………………………………………………………………17 表3-3 表3-4 表3-5 NDF计算公式对照表………………………………………………………………………..20 ADF计算公式对照表…………………………………………………………………………..20 ADL计算公式对照表…………………………………………………………………………2l

表3-6正交试验表…………………………………………………………………………………….28 表3-7正交试验分析表………………………………………………………………………………..29 表3-8交互作用分析表…………………………………………………………………………………29 表4一l新鲜秸秆试验水平设置………………………………………………………………………30 表4.2玉米秸秆的组成……………………………………………………………………………….31 表4-3不同温度条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析………………………………………………3l 表4.4不同时间条件下鲜秸抒和风干秸秆方差分析…………………………………….…………33 表4-5不同稀酸浓度条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析…………………………………………35

表4-6不同固含物条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析………………………………一…………37
表5.1糠醛浓度同温度的偏相关分析………………………………………………………………41 表5-2糠醛浓度同时间的偏相关分析……………………………………………………………….42 表5.3糠醛浓度同稀酸浓度的偏相关分析…………………………………………………………43

表5-4糠醛浓度同固古物的偏相关分析……………………………………………………………..44
表6—1代谢产物的气相色谱数据…………………………………………………………………….50 图t.1木质纤维素材料发酵法生产乙醇的底物转化路线…………………………………………1 1 图2-1术质纤维素水解产物转化途径(生成的多种抑制物)……………………………………14 图3.1

DNS法(还骧糖测定)标准曲线……………………………………………………………2l

图3?2苔黑酚法(测戊糖)标准曲线………………………………………………………………22

图3—3水解温度对产糖率的影响……………………………………………………………………。23
图3-4残渣中性洗涤纤维成分随水解温度变化图…………………………………………………23

图3-5水解时间对产糖率的影响……………………………………………………………………24
图3-6残渣中性洗涤纤维成分随水解时间变化图…………………………………………………24 图3—7稀酸浓度对水解产糖率的影响………………………………………………………………25 图3—8残渣中性洗涤纤维成分随稀酸浓度变化图…………………………………………………25

图3-9固含物对水解产糖率的影响…………………………………………………………………26 图3—10残渣中性洗涤纤维成分随固含物变化图……………………………………………………27 图4?l水解温度对鲜秸秆水解得糖率的影响………………………………………………………32
图4-2不同温度条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异……………………………32 图4-3水解时间对鲜秸秆水解得糖率的影响……………………………………………………….33 图4—4不同水解时间条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异………………………34

图4-5稀酸浓度对鲜秸秆水解得糖率的影响………………………………………………………35
图4-6不同稀酸浓度条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异………………………35


图4—7固含物对鲜秸秆水解得糖率的影响…………………………………………………………36 图4—8不同固含物条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异…………………………37 图5.1 图5.2 紫外分光光度法测糠醛标准曲线…………………………………………………………….40
Trichosporon

aquattle菌体个数测定标准曲线………………………………………………40

图5.3水解液中糠醛浓度随温度变化曲线…………………………………………………………4l 图5-4水解液中糠醛浓度随时间变化曲线……………………………………………………………42 图5-5水解液中糠醛浓度随稀酸浓度变化曲线…………………………………………………….43 图5-6水解液中糠醛浓度随固含物变化曲线………………………………………………………44 图5—7发酵液菌体个数和菌体质量随糠醛浓度变化曲线…………………………………………45 图6-1经过6次继代后木糖培养基上芨酵菌系的生长情况………………………………………48 图6.2分离出的4株木糖发酵菌株…………………………………………………………………48 图6-3发酵液的残糖变化曲线……………………………………………………………………….49 图6.4发酵液的pH值变化曲线……………………………………………………………………..50 图6—5发酵代谢产物的气相色谱图………………………………………………………………….5l 图6-6发酵代谢产物的质谱分析……………………………………………………………………5 1

VI

独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明
确的说明并表示了谢意。

(日 研究生签名:、"12-了舀
研究生签名:、

时间:≥积年名月/歹日 时间:≥彳年g月/7日

关于论文使用授权的说明
本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、
传播学位论文的全部或部分内容。

(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)

研究生签名:

≯滔

时间:0妒;年3 B哆日
时同:岁固矗年6 B,缉

一名磊1帜

中国农业大学硕士学位论文

第一章文献综述

第一章文献综述
1.1研究背景
1.1.1世界能源危机
能源闷题是当今世界面临的最为重要的课题之一。根据1996年美国能源部的测算资料,世界 已探明的矿物燃料的可使用年限约为:煤221年,天然气80年,石油39年。而我国已探明的矿 物燃料使用年限却分别为煤85年,天然气62年,石油19年。中国作为石油消费大国,从1993 年起,已经成为石油净进口国。据估计到2010年时,我国的石油需求预计达到4.02亿吨。与我

国的“2010年远景目标纲要”中规划的1.55亿吨的目标产量相比,缺口达到2.44亿吨。能源问
题已成为制约我国经济持续发展的重要因素,能源安全已是当前决策层不得不面临的重大问题 (焦瑞身,2003)。许多国家都把寻找替代能源作为一项重要的战略目标。

1.1.2乙醇的化学性质和生产现状
交通能耗占世界能源消耗的40%以上。当今世界汽车大多使用石油天然气等化石燃料,它受到
储量的严重制约,同时汽车排放的尾气又成为大气环境污染的重要污染源。所以寻找可再生的清

洁的车用替代能源已是人们所面临的重要任务。从既具有工业基础又具有应用价值方面考虑.乙
醇汽油是一种较为理想的可再生的清洁能源。

乙醇是重要的化工原料。它是生产香料、染料、涂料、医药、合成橡胶、洗涤剂、农药等的
中间体,又是重要的有机溶剂.广泛用于医药、卫生用品、涂料、化妆品等各个领域;近年来,乙

醇在合成化工产品及中间体方面的应用范围逐步缩小。但许多精细化工产品,尤其是乙醇酯类, 仍要消耗大量乙醇。同时它在洗涤剂、液体去污剂以及化妆品方面的消费量也不断增加。 酒精的热值比汽油低(约为汽油的2/3),但是酒精分子中含有氧,燃烧过程中抗爆性能好。
当汽油中添加的酒精不超过15%的时候,对车辆的行驶性能没有任何影响,但尾气中的CO、Nox 化合物和CH化物的含量则明显降低,降幅可达30%--50%。汽车引擎稍加改造后,也可以完全 以酒精和含85%酒精的汽油为燃料。在汽油中添加10%一15%(巴西允许添}J/l至rJ26“)乙醇组成 的复合燃料,称为汽油醇(gasohol,加10%乙醇的汽油也称为EIO),为“无铅汽油”的一种。

将铅取出后汽油的燃烧不良,需要添加含氧化合物。甲基三丁基乙醚(MTBE)及其他醚类常做
此用。但最近发现MTBE有很强的毒性和致癌性,且容易渗漏入地下水。因此美国的加卅I和纽约 州已经禁止使用MTBE,美国国家环保局建议用可再生性的乙醇来代替。 乙醇的主要生产方法有化学合成法和生物发酵法。化学合成法:是以石油工业中石油裂解产

生的乙烯为原料加水合成乙醇。按生产工艺分为直接水合法、硫酸吸附法和乙炔法等,常用的方 法是乙烯直接水合法。生物发酵法:由于化学台成法乙醇含杂质较多,应用受到限制,因此发酵 法占有重要地位,尤其是随着石油储量的锐减,发酵工业日趋重要。发酵法生产乙醇的原料可以

是淀粉、糖蜜、纤维素、野生植物和亚硫酸造纸废液冯赞华2002]。
我国乙醇年产量为300多万吨,仅次于巴西、美国,列世界第三位。其中发酵法乙醇占绝对

优势,80%E右的乙醇用淀粉生产,约有10%的乙醇用废糖蜜生产,{三l亚硫酸盐纸浆废液等纤维 原料生产的乙醇约占2%左右(杜风光陈伟红2002)。为了提高乙醇的市场竞争力,许多发酵法 乙醇生产商借助于生物技术,分别从改变生产原料、改善生产工艺等方面着手,以降低乙醇的生 产成本(吕仪军,1999)。乙醇的发酵分为糖化和发酵两个生化过程。如果从产糖植物压榨出的 糖桨,则主要进行发酵过程(Rodrigus 甘蔗、甜高梁等。 燃料乙醇在巴西、美国、加拿大等国家已经有多年的使用历史,目前已经具有相当规模。目 前,生物法生产的乙醇还主要来自淀粉和糖类发酵。1999年巴西以甘蔗(甘蔗汁和糖蜜)为原料 生产了105亿升含水乙醇和65亿升无水乙醇。1998年美国的无水乙醇生产也达到T53亿升.95% 是用玉米生产的,其他为小麦和大麦(焦瑞身,2003)。
E,Danley A

s,Callieri,1986)。可利用产糖的经济作物有

1.1.3生物质资源
以乙醇作为石油的代用能源,其关键是降低酒精的生产成本。目前虽然能发酵制酒精的原材 料很多.但是大多为人类可食用的粮食。随着世界人口的快速增长以及耕地的锐减,在世界范围 内粮食供应仍然是一个问题。纤维素是地球上最丰富的有机物之一,它是一种可以再生的资源, 每年仅陆生植物就可以产生纤维素约500亿t。纤维素资源还是最主要的生物质资源,它占地球 生物总量的60—80%。从总量上来看,全球生物量的5%所含的能量即可与石油和天然气的需求量 相当。我国的纤维素原料非常丰富,仅农作物秸秆、皮壳一项,每年产量就达7亿多吨。其中 玉米秸(35%)、小麦秸(2l%)和稻草(19%)是我国的三大秸秆。林业副产品、城市垃圾和

工业废物数量也很可观。这些木质纤维素材料的组成变化很大(见表1),但是主要成分都是糖类
和芳香族类化合物。完全可以将它们转化为各种燃料和化工产品。 纤维素的组成十分简单.是由葡萄糖通过B(1,4)糖苷键串联而成的线形长链分子,聚合

度很火(通常由4000--8000个葡萄糖分子串联起来,分子量达到200.2000ku)。葡萄糖的p(1,4) 糖苷键连接方式使纤维素几乎所有的羟基及其他含氧基团,都同其分子内或相邻的含氧基团之间 形成分子内和分子链之间的氢键。这些氢键使很多纤维素分子共同组成结晶结构,并进而组成复 杂的基元纤维、微纤维、结晶区和无定形区等纤维索聚合物的超分子结构。结晶结构使纤维素聚 合物显示出刚性和高度水不溶性,抑制了糖苷键水解时所必需的分子弯曲,并有效阻止了纤维素 酶分子接触分子内部的糖营键。超分子纤维素总氢键能非常大,使纤维素的微晶结构很难被打开
(焦瑞身,2003)。 半纤维素的组成变化非常大,一般由较短的(聚合度小于200)、高度分支的杂多糖链组成。 常见的有:己糖(如D一半乳糖、L一半乳糖、D一甘露糖、L一鼠李糖、L一果糖)、戊糖(D一木糖、L一

阿拉伯糖)、耱醛酸(D一葡萄糖醛酸),多通过p(1,3)糖苷键连接。糖分子上的某些基团被乙酰
基高度取代。其分支结构使半纤维素无定形化,比较容易被水解为其他糖类。 木质素是苯丙烷衍生物交联聚合而成的化学构复杂的高聚物.非常难于被降解。木质素和半 纤维素包围在纤维素外面,明显阻碍了纤维素酶同纤维素分子的直接接触。



1.2国内外研究进展
1.2.1预处理技术的发展
在天然纤维素中,纤维素分子之间和纤维素微丝之间的空隙非常小,且常有伴生物质填充。 其毛细管直径小于纤维素酶分子直径,使得大分子的纤维素酶很难突破空间障碍,与纤维素进行 有效的接触与作用。由于这样的一些原因,使纤维素酶的分子转换率,要比同样是葡萄糖苛键水 解酶的淀粉酶分子转换率要低两个数量级。因而,影响植物纤维素资源充分利用的主要难题之一 就是木质纤维索通常难于被降解转化。这就需要采取预处理措施,使木质纤维素的结构能适于随 后的酶降解。有很多可以提高纤维素可降解率的物理、化学方法如:粉碎、热解、声波电子射线、 臭氧法、酸水解、碱水解、蒸汽破碎、液氨破碎、有机溶剂等。下面将逐一介绍。 1.2.1.1物理预处理法 物理预处理法包括机械粉碎、热解、声波电子射线等方法,这些方法均可使纤维素粉化、软 化,提高纤维素的酶解转化率。废弃纤维素原料通过切碎、粉碎、碾磨等物理方法可降低其结晶

性,经切碎处理后的原料大小通常为IO.30ram,而经粉碎、碾磨之后的原料颗粒大小一般为
0.2—2mm(YSun,JCheng,2002)。当新闻报纸磨粉细度在75“m以下时.其酶水解率可由25%提高 到84%以上,用其他磨(如胶体磨、双辊磨、锤击磨等)碾磨效果也较理想。 热解也可用于对纤维素原料的预处理。当加热到3∞℃以上时,纤维素迅速分解为气体和残 留的固体(KilzerF J,BroidoA,1965:ShafizadehF,BradburyAGW,1979.)。如果温度低一点的 话,分解速度就会减慢,还会产生低挥发性的副产品。在热解过程中加入氧将会加快反应的进程,

在反应过程中加入氯化锌和碳酸钠作催化剂,可以在较低温度下实现对纯纤维索的分解
(Shafizadeh
F,Lai Y Z,1975)。

声波电子射线法需要高能射流发生仪,设各成本高,能耗大,但是这种方法也有以下优点:
处理后的粉末纤维素类物质没有胀润性,且体积小,可以提高基质浓度,得到较高浓度的糖化液; 将原料粉碎成极小的颗粒,一方面使其表面积大大增加.另一方面破坏了其结晶性,使其在以后 要进行的糖化阶段更易于反应。 1.2.1.2化学预处理法 (1)臭氧法 臭氧可以用来分解木质纤维素原料中的木质素和半纤维素,例如麦秸(Ben.Ghedalia.D,Miron J.,1981.)、棉花秆(Ben-GhedaliaD,Sheet,G,1983.)、锯末(VidalPF,Molinier J,1988.)等。此法有

以下优点:可以有效地去除木质素,不产生对进一步反应起抑制作用的物质,反应在常温常压下 即可进行(SiversMV,ZacchiG,1995)。但由于需要的臭氧景比较大,整个过程成本较高。
(2)酸水解法

半纤维素和纤维素都能被强酸直接降解为单糖。德国、前苏联以及我国的黑龙汇南岔水解厂 都用木材酸水解法生产过酒精。美国、加拿大、瑞典等国近年来也对浓酸水解法和稀酸水解法进 行了大量的研究工作。纤维索酸水解的工艺比较简单,已有工业化经验。但是需要寝高的温度和
大量的酸,水解产生的单糖会进一步降解.产生对微生物有毒害作用的糠醛类物质。单糖的降解

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第一章文献综述

使产糖率下降,又会对随后的酒精发酵产生抑制。因此处理后的糖液需要中和、脱毒后才能用于 发酵。 稀酸水解工艺已经是一种比较成熟的水解工艺。通过稀硫酸的预处理可以明显的提高纤维素 原料的反应性和可水解性(Esteghlalian
A,Hashimoto A G,Fenske J J,et

d‘1997)。用稀硫酸在较低

温度之下处理植物纤维材料,只能降解其中的半纤维素。提高材料的纤维素酶可降解性。然而,
半纤维素上乙酰基脱出产生的乙酸和糖类降解产生的少量糠醛类物质仍有毒性,对后期的发酵有

一定的抑制作用。通常需要用过量的石灰中和、气提等措施解毒,或选育和使用能抗毒性的酒精
发酵菌。稀硫酸预处理设备需要非常昂贵的耐腐蚀材料、中和需要耗用大量的化学药品以及中和 反应产生的大量的石膏和其他盐类都增加了成本。

高浓度强酸(如硫酸、盐酸)也可以用来处理纤维素原料。这些酸可以有效地对纤维素进行
水解,但是这些酸具有腐蚀性,对人体有害,需要在耐腐蚀的反应器内进行反应。另外.反应完 成之后要对这些酸进行回收以降低成本(Sivers M V,Zaeehi G,1995)。 (3)碱水解法

许多碱也可以用于对木质纤维素原料的预处理。用热或冷碱液(氢氧化钠或液氨).使纤维
素膨胀,处理效果也较好。碱预处理的效果取决于原料中木质素的含量(Fan
Lee Y H,1987;McMillan J L T,Gharpuray

M M,

D。1994)。碱水解的机理可以被认为是对分子间交联木聚糖半纤维素和

其他组分的酯键的皂化作用。随着酯键的减少,纤维素原料的孔隙率随之增加(TarkowH,FeistW C,1969)。稀氢氧化钠溶液处理原料可以使之胀大,增加内表面积,聚合度减小,结晶度减小, 使木质素和碳水化合物之间的结合键分离,分裂木质素结构。 (4)其他脱木质素方法

H202可对木质索进行降解。H202对蔗渣的预处理可以大大增强酶催化水解的敏感度。用乙醇 也可以除去木质素。在180"C条件下.将木质素溶解在50%的乙醇水溶液中处理1h,分离回收后可
得到无定形的粉末。 用镉二乙胺(Cadoxen)水溶液能溶解纤维素,再用甲醇或水沉淀、过滤,得到絮状纤维素,

其结晶结构完全被破坏,几乎能完全被酶水解。Cadoxen为含5%.7%的镉二乙胺水溶液,但回收
镉和乙二胺成本较高。 1.2.1.3物理化学方法 (1)蒸汽爆破法 蒸汽爆法是最常见的用于预处理纤维紊的方法(McMillan


D.1994)。把片状的生物质置于高

压蒸汽中,随后迅速降低压力,使原料进行爆炸性分解。汽爆的开始温度一般为160.260"(3,相对

应压力为0.69-4.83Mpa。物料在此温度、压力下经过几秒到几分钟的时间,然后置于常压下。此 过程需要高温条件.使半纤维素降解,改变木质素结构,增加纤维素的水解能力。将碎木料加热 升压N0.4MPa左右,倒入常压下的容器中,木料爆破得到绒毛状的纤维,具有较好自勺处理效果。
例如阔叶木(白桦木)经纤维素酶处理。还原糖得率只有4%,经过蒸汽爆破处理(2.8Mpa,4rain)

还原糖得率可提高到68%。针叶木经蒸汽爆破后。还原糖得率可增加10倍。影响蒸汽爆破效果的
因素有停留时间、温度、碎片大小和水分含量等。高温、短停留时间(270"C,lmin)或者较低 温、长停留时间(190"(3,10rain)都可以优化半纤维素的增溶性和水解性(DuffS JB,1MurrayWD,


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1996)。而近年来的研究表明低温长时间的处理方法效果更为理想(FanLT,GharpumyMM,LeeY H.。1987.)。 汽爆过程中加入H2s04和C02可以有效促进水解,减少抑制产物的生成,使半纤维素去除量 增多(MorjanoffP J,GrayPP。1987)。甘蔗渣的汽爆处理最佳条件为:220"C,30mlm停留时间,液 (I%的稀硫酸)固比为2。最后得到的产糖效果为65.19(糖)/1009(干物质)。 汽爆预处理比机械粉碎需要的能量低,并且没有额外的费用(如用于环保的费用等)。若达 到同样的预处理效果,传统的机械方法要比汽爆法多消耗70%的能量(Holtzapple,M.T.,Humphrey.

A.E.,Taylor,J…D

1989)。对于硬木和农业残留物,汽爆法是最具性价比的一种预处理方法.但

对于软木,它的处理效果就要差一些了。汽爆法也具有一定的局限性,它破坏了木聚糖的结构,

还使木质素一碳水化台物基块不完全分裂,还可能积累对微生物组织生长起抑制作用的物质,在
降解产物的过程中对微生物生长、酶催化水解和发酵起抑制作用.所以要水洗预处理后的生物质。 以除去这些物质(McMillan,J D,1994.)。 (2)低温氨爆处理(AF既)

AFEX的原理与蒸汽爆破类似.一般的AFEX处理的液氨需求量为1--2Kg/Kg千物质,温度 为90"12.处理时间为30min。作为碱性物质,氨能破坏木质素结构。液氨处理同减压爆破结合在
一起,可以用于增加某些草类和农业残余物的可消化性。AFEX处理可以应用到许多生物质材料 上如:麦秸、玉米芯、苜蓿、稻草等(Duffs J B,Murray W D,1996)。

1.2.2纤维素水解糖化技术的运用与发展
1.2.2.1酸法糖化

在一般条件下,半纤维素很容易被稀酸水解,但如果要水解纤维素的话,条件要严格得多。
无机酸催化纤维索分解的机理是:酸在水中解离并产生氢离子,当纤维素链上的13.1,4葡萄糖

萤键和水合氢离子接触时,后者将一个氢离子交给8.1,4葡萄糖苷键上的氧,使这个氧变得不
稳定。当氧键断裂时,与水反应生成两个羟基,并重新放出氢离子,后者可再次参与催化水解反

应。在一定的酸浓度范围内。纤维素水解反应的速度与酸的浓度呈正比。温度增加酸水解反应的
速度也会加快,一般认为,温度增加10"C,水解速度提高1.2倍。

纤维素在浓酸中的水解是均相水解。是纤维素晶体结构在酸中润胀或溶解后,通过形成酸的
复合物,再水解成低聚糖和葡萄糖:

纤维素一一酸复合物一一低聚糖一一葡萄糖 在浓的无机酸,如41~42%HCI,65~70%H2S04或80~85%H3P04溶液中可进行纤维素水 解。Lee等用72%H2S04在3012下水解纤维素后,再于100"C或120℃下蒸汽加压,得到了不
完全解聚的多糖和部分单糖(Lee
J et,a1.1997)。

葡萄糖的回聚是纤维索水解的逆过程,水解溶液中单糖和酸的浓度越大,回聚程度越大。葡 萄糖回聚后可以生成二糖或三聚糖。因此为了提高葡萄糖的得率,在水解末期,必须将溶液稀释
和加热,使回聚的低聚糖再行水解。 稀酸水解屑多相水解,水解发生于固相纤维素和稀酸溶液之间。在高温高压下,稀酸可将纤 维素完全水解成葡萄糖:

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纤维索一一水解纤维索一一可溶性多糖一一葡萄糖 酸法糖化反应的产物有糖、醛、酚类物质,生产成本较高。该工艺对设备有腐蚀作用?所需
条件非常苛刻。利用该技术酸解木材生产葡萄糖的费用与水解淀粉生产葡萄糖的费用大体相同。 1,2.2.2酶法糖化 同植物纤维酸法水解工艺相比,酶水解具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、糖得率高、 设备投资低等优点。而妨碍木质纤维素资源酶法生物转化技术实用化的主要障碍,是纤维素酶的 生产效率低,成本较高。在目前的酶技术生产条件下,生产一加仑(1
usgal=3.78541

dm’)乙醇

所需用的纤维索酶的生产费用大约为30.50美分。这就影响了纤维素酶的广泛使用。目前的研究目 标是将纤维索酶的生产成本减少到每加仑5荚分(United Nations
Development Programme,2000)。

纤维素酶是降解纤维素为葡萄糖单体所需的一组酶的总称。一般认为主要包括3类酶组分 (Coughlan,M.P.。Ljungdahl,L.G.,1988): ①1,4-B—D-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4),也称为内切葡聚糖酶(EG),从分子内部随 机作用于可溶或不可溶的葡萄糖链,分解葡萄糖苷键; ②1,4一B—D-葡聚糖纤维=糖水解酶(EC 3.2.1.91),也称为外切葡聚糖酶或纤维二糖 水解酶(CBH),从纤维素的葡萄糖链膜端水解,释放纤维二糖: ③§-I,4-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21),水解纤维二糖和可溶性纤维寡糖,释放葡萄糖。 除了上述糖苷键水解酶组分外,还有~些微生物酶系成分或代谢产物能破坏纤维素结晶结

构。虽然现在对微生物破坏纤维素结晶结构的机理尚不清楚,但结晶纤维的解聚或解链可能是纤
维素酶解过程的限速反应步骤,有待进一步研究。

这些酶对结晶状的纤维素催化速度非常慢。酶解木质纤维素的阻力可能来源于其溶解度。糖 化过程中积累的许多可溶性产物(葡萄糖、纤维=糖、纤维三糖等)也抑制了各种酶的水解。 通过对GL产生菌黑曲霉3.350菌株的产酶条件的研究表明,酶活随麸皮量的增加而提高, 而温度也对酶活产生一定影响。当温度为30℃时,酶活最高,最适宜的培养温度为25℃一30℃。 当温度高于35℃时,酶活开始下降,45℃时酶活近乎为零。pH值为8.0时.酶活最高。微量金 属离子对酶活也有一定影响,除Mn2+外,Cu2+、zn2+、ca2+、Ba2+、M92+都可提高酶的活性,其 中以C一+和M92+特别明显。这是由于微量元素影响菌的生长繁殖及生理代谢,从而影响产酶能
力,起到了激活酶的活性或提高酶的产量的作用。在加入碳源后,GL活性也有提高,其中以纤维 二糖存在时酶活最高。纤维素分子是具有异体结构的聚合物.具有酶解困难的特点,酶解速度较

淀粉类物质慢,并且对纤维素酶有很强的吸附作用,对酶的重复利用及固定化技术难以应用,致
使酶解糖化工艺中酶的消耗量大,而纤维素酶的合成需要不溶性纤维素诱导,生产周期长,生产 效率低.因而纤维素酶的费用占糖化总成本的60%。

1.2.3发酵抑制物的影响及其去除 近年来各国科学家对纤维素稀酸水解发酵制乙醇的方法进行了大量的研究,但是乙醇的产量
和产率都不是太理想,究其原因是因为纤维素在稀酸水解的过程中产生了发酵抑制物质.如甲酸、 乙酸、糠醛、5-HMF(5-羧甲基糠醛)和苯系化合物(Larsson S,PalmqvistE,HahnHB,et.以1998)。



中国农业大学硕士学位论文

第一章文献综述

1.2.3.1主要抑制物对发酵的影响 植物纤维素原料水解液中的抑制物可以限制菌体对糖的消耗。降低其生长甚至阻碍发酵过程。 有时抑制是多种因素相互作用的结果。不经过处理直接利用中和的水解液通常会影响发酵菌株的 生长,降低发酵效率。Ferrari等人(Ferrari M D,Neirotti E,Albomoz
C,Saucedo E,1992;Roberto I

C,LacisLS,BarbosaMF s,1991)用桉木水解液进行发酵,抑制物的存在会明显降低菌体的生长

能力,产生延迟期。 乙酸是研究最多的发酵抑制物,其抑制活性同其浓度密切相关。在酸性条件下,乙酸可以扩 散到细胞质中,在细胞质中电离,降低细胞内的pH值,导致能量分解和阻碍营养物质的运输。 不同的发酵菌株对乙酸的耐受性有较大差异:Watson等的研究表明(Watson
N E,Prior B A,

LateganPM。1984),在乙酸浓度高于1.45mg/mL的条件下,尸tannophilus的生长完全受到抑制, 在低pH值条件下抑制作用更为明显:而对于P stipitis则在乙酸浓度超过2.7mg/mL的条件下其 利用木糖才受到抑制。van zyl等人(van
Zyl C,Prior B A,du Preez J

C,1991)的研究表明,通气

有利于P stipitis利用乙酸和木糖,厌氧条件会影响P sap#is的生长和对乙酸的利用导致发酵效率 降低。Ferrari等人(Ferrari M D,Neirotti
象。
E,Albomoz C,Saueedo

E,1992)的研究也发现了同一现

糠醛和羧甲基糠醛在被吸收和降解的时候,会使细胞在一段时间内生长停滞,延迟发酵。 Weigert等人的研究表明(Weigert
B,Klein C,Lauterbach C,Dellweg

H,1988).糠醛对只stipitis的

毒性作用涉及抑制呼吸和氧化磷酸化,并且其还原形式(糠醛醇)也会影响细胞生长。Robert等
人的研究表明。在糠醛浓度高于2.0mg/mL的条件下,菌株的生长被完全抑制。Delgenes等人发 现(Delgenes
J P,Moletta凡Navarro J M,1996)。P

stipitis受糠醛的影响比其他酵母更大。

1.2.3.2去除方法

抑制物的去除方法有很多种,从原理上我们可以把它们分为物理、化学和生物三大类(薛瑁,
蒲欢,孙春宝,2004)。 (1)物理去毒方法 ①旋转蒸发 在用P.stipitis发酵酸水解的白杨的研究中,发现与不含抑制物质的参比样相比,使用旋转蒸 发处理时,在几乎蒸干的情况下,再对残余物进行发酵,乙醇的产量从0%提高到了13%(Wilson


J,DesehateletsL,NishikawaNK,1989)。其抑制作用降低的原因被认为是,与原液相比,把乙

酸、糠醛和香草醛的浓度分别降低了54%、100%和29%。 ②萃取

用乙醚在pH为2的环境中,对具有强抑制作用的云杉水解产物进行24h的连续萃取后,其乙醇 产量据报道能够与含有葡萄糖和营养物质(0.409/g)的参比发酵样相比(ClarkT,MaekieKL, 1984)。乙醚萃取了乙酸、甲酸、菊芋糖酸、糠醛、HMF和苯系化合物。将萃取物重新分散在 发酵介质中后再进行发酵,与参比发酵样相比,乙醇的产量和产率分别下降到33%和16%。在使
用醋酸盐萃取时与上述报道保持一致,使用P stipitis发酵的水解液中,乙酸的去除率是56%,糠

醛、香草醛和4.羟基安息香酸被全部除去.乙醇产量从0提高N93%。在使用乙醚萃驭时发现.低



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第一章文献综述

分子量的苯系化合物的抑制作用最大。再用水三次洗涤用乙醚萃取过的云杉稀酸水解产物,叉在 水相中发现了发酵的抑制物质(Clark T,Mackie @树脂吸附 据文献(Well
J R,Dien B。Bothast R et K

L,1984),说明还有水溶性抑制物质存在。

at,2002)报道,通过聚合树脂)∽D.4的吸附后,用
coli

HPLC进行检测,糠醛的浓度从原来的1—5 g/L降到0.Ol g几。然后再使用基因重组过的E

KOll种进行发酵,这时糠醛在发酵过程中的抑制作用可以忽略。反应的速度和用同浓度的试剂 纯度的糖作为发酵物质进行发酵的速度差不多,而且乙醇产量达到了理论产量的90%。聚合树脂 XAD-4使用后再进行解吸.就能够重复使用。 ④木炭吸附 通过特制的木炭吸附(Hisashi M,Herbert D,Markus N,et以2003)也能大量除去发酵抑制物 质,杉木屑在氮气保护下。高温中加热l h,加热速率是2"C/rain,并且加热后要研磨成粉末状, 就制成了这种特制木屑。经过木炭吸附处理后的水解产物和未经处理的水解产物中各种糖含量是1

几乎一样的。在未经处理的水解产物中葡萄糖浓度、乳糖和阿拉伯糖的总浓度、木糖浓度、半乳
糖浓度分别是6.2,17.5,9.4和3.7 g/L,在经过400"C¥H1000℃下生产的木炭处理后,浓度分别为

6.1,17.3,9.3,3,697L和6.2,17.4,9.4.3.7班。进一步的实验表明,用经过高温(600"C或1000
℃)处理过的木炭处理水解产物,其开始发酵的时间要早于较低温度(400"(2)的木炭处理过的 水解产物。实验表明,在用经过高温(600"(2或10004C)处理过的木炭处理的水解产物中几乎没 有检测到呋喃和苯系化合物,这可能就是上述现象的原因。 ⑤其他物理方法 除了上述方法外,还有沸石处理(Eken
C S N,Arslan

Y,2000)、活性炭吸附(Gong

C S,Chen

S,ChenLF,1993)和阴离子交换(NilvebrantNO,ReinmannA,LarssonS,eta,2001)等方法,

但是这些方法在去除抑制物质的同时还会除去大量的可发酵糖,导致乙醇的产量大幅度降低,在
此不作介绍。 (2)化学去毒方法 ①过量碱法

通过碱处理纤维素水解产物来除去其中的抑制物质,例如,用Ca(OH)2调口H至钆10(过量 碱法ovefliming),再用I-I:S04调回5.5,这种方法在1945年已经被Leonard和Hajny报道。由于通 过Ca(OH)2调节pH值的水解产物比用NaOH调节pH值的水解产物具有更好的发酵性,因而被
多次报道,这可能是因为前者对抑制物质有沉淀作用(van zyl
C,Prior B A,du Preez,J C,1988)。

与此相符的是,用乙醚萃取过的云杉稀酸水解产物,再用Ca(OH)2调pH值至5.5与用NaOH调pH 值至5.5相比,经发酵后.能得到更高的乙醇产量和产率(Palmqvist
E,Galbe M。Hahn H B。1998)。

与只用NaOH调pH值到5.5时比较,各种物质对杉木的稀酸水解产物发酵的抑制作用明显减弱, 从而乙醇产量提高了2倍(Palmqvist E,Oalbe M,Hahn H B,1998)。但是这种方法的缺点是费用

太离。在过量碱化后(pH值到t0),大量沉淀形成,乙醇的产量因此得到进一步提高。过量碱化 能如此有效除去抑制物的原因在于其对有毒物质的沉淀作用和一些抑制物质在高pH值时的不稳
定。 ②亚硫酸盐和过量碱法联用 联合使用过碱化和加亚硫酸盐的方法经实验证实,对于除去要使用大肠杆菌Escherichiacoli


中国农业大学硕士学位论文

第一章文献综述
L,Hahn H B,Zacchi G,

发酵的柳树半纤维索的水解产物中的发酵抑制物是最有效的方法(Olsson

1995)。在未经处理的水解产物中,经过40h的发酵,只消耗了24%的木糖,然而在过碱化处理 过的水解产物中则全部消耗。当在水解产物中再加入0.1%的亚硫酸盐并在90"C自N热30 min,和只 经过过碱化处理的比较,发酵时间减少了30%。类似地,用KOH调pH值至10,再在室温下用 HCI和0.1%的亚硫酸钠的混合液调pH值至6.5,这种方法被认为是用P stipitis发酵甘蔗渣水解 后的半纤维素产物的最好方法(van Zyl
C,Prior B A,du Preez,J

C,1988)。这种联合处理的方法

会取得如此效果的原因可能是在于降低了Hibbert酮和乙醛的浓度,在加热时又将可挥发性物质 除去,从而大大减少了抑制物质的浓度。 (3)生物去毒方法 ①酶处理

由于酶具有专一性,所以酶处理也只能去除特定的抑制物质。经过过氧化物酶和漆酶处理后,
通过木腐菌(Trametes versicolor)发酵柳树的半纤维素水解产物,乙醇的产率能提高2~3倍(J6nsson


J,PalmqvistE,NilvebrantN0,etal,1998)。由于漆酶处理具有选择性,能够完全去除酚单体(原

水解物中含量为2.6 g/L)和石炭酸。在280 nm的吸收表明漆酶处理后仍然存在芳香化合物。而 且并没有减少。但是在全波欧扫描中却观察到,大分子苯系化合物转换成小分子苯系化合物因而

减少。根据这些观察结果,抑制发酵的原因被认为是低分子量的苯系化合物的大量存在。
②微生物处理 有的研究是把能够吸收苯系化合物的微生物作为发酵的菌种,丝状软腐菌Trichoderma
reesei

能够降解蒸汽预处理过的柳树半纤维素水解所产生的抑制物质,能够把乙醇的最大产率提高3倍. 最大产量提高4倍(PalmqvistE,HahnB,Szengyelz,etat,1997)。与用漆酶处理的相对比,用z

reesei处理的,在280hm处的吸收减少了30%,表明所去除的抑制物质是不同的。通过z reesei处
理,乙酸、糠醛和安息香酸衍生物被从水解产物中除去。

还有通过高接种量来提高乙醇产量的报道(潘进权,刘耘,2002),可能是因为水解液的这种
抑制作用主要存在于发酵的初期.随着发酵的进行.抑制作用逐渐减弱.依靠细胞的繁殖弥补死

亡或受到抑制的细胞的数量,从而维持一定的细胞浓度,一旦抑制物质的浓度很小后,抑制作用
消除活性细胞就大量增殖。使发酵恢复正常。

1.2.4发酵技术的发展现状
1.2.4.1发酵菌株的研究现状 长期以来,传统的乙醇生物发酵技术都采用真菌(即酵母菌),但近期人们对细菌乙醇发酵 产生了极大的兴趣。对能乙醇发酵的细菌研究的最多的是运动发酵单胞菌(Zymomonasmobills)[顾

其丰1986:陈驹声1990]。运动发酵单胞菌是按ED途径进行糖化代谢.在乙醇的产量、乙醇收 率系数、发酵效率、平均发酵速率、最大细胞浓度以及比生长速率等诸方面均优于酵母,但其碳 源利用范围较酵母狭窄,只能利用葡萄糖、果糖,当用蔗糖时易产生抑制物质[顾其丰1986】。 Rodrigues等从发酵甘蔗汁中分离出絮凝性发酵单胞菌菌株,它具有运动性和高乙醇耐性[Rodrigus
E.Danley A s.Callieri 19861。

热纤梭菌是喑热产芽孢的严格厌氧菌,革兰氏染色呈阳性(Weimer

P J.and ZeikuaJ G 1977)。



能发酵纤维素和纤维糊精产生乙醇、乙酸、乳酸、氢和二氧化碳,不能发酵戊糖和淀粉(Zeikus
G“口f 1981),有人把该菌不能在木糖上生长作为它的一个鉴别特性(BendgrJ.醇a1.1985)。

J.

1977年Zeikus等人发现热纤维菌(Clostridium thermocellum)具有降解纤维索、生产酒精能力 (Weimer
P J.and Zeikua J G

1977),在同一反应器中同时进行这两步反应,提出~步法”(SSF

法simultaneous sacchadfieafion and fermentation)生产酒精新工艺(Kundu S,1983),但该菌最大

的不足是乙醇产量较低(张毅赵海刘克鑫1998)。美国麻省理工学院最初利用热纤梭菌
(Ctostridium

thermoeellum)J盐行纤维素的直接乙醇发酵,后又把它同另一株耐热厌氧菌——热糖梭

茵(Clostridium thermosaecharolytium)混合培养,运用耐热糖梭菌来把前者不能代谢的戊糖转化为 乙醇,提高了乙醇的产率。上海交通大学利用上述两种细菌对造纸废水中的短小纤维进行直接发 酵生产乙醇的试验表明(刘大钧1992),混合培养确能大大提高乙醇的产量。Lynda等人发现的一 株极端嗜热的产乙醇细菌(Thermoanaerobacter ethanolieus)在68"C高温下采用连续培养法由木糖 获得0.449/g乙醇(Lynda
J S.Laeis

andHughGl988)。对于最难降解的木质素,可以采用白腐菌(Lee

1997)进行降解。国内有人研究水稻壳纤维素的利用,当采用多菌种复合处理时,纤维素酶活

大幅度提高,并且作用时间延长(Yang,2004)。

——
菌种 拉丁名

表卜1

利用不同底物的乙醇发酵菌生物特性

!!§坦!:!曼!翌磐堡垡垡璺i堑!!塑!地塑!!!!燮!燃坦堡!!墨量!!
底物 质量% 适温 氧

根据不同菌株对底物的利用差异,可以采取不同的发酵方式(图1.1)。 通过分子生物学方法将运动发酵单胞菌乙醇合成关键酶基因导入工程菌,是提高乙醇生物产

量的另一条途径(Takahashi,2000)。陈金风等利用PCR方法从运动发酵单胞菌染色体DNA扩
增出乙醇合成途径的关键酶基因pdc、adhB,分别用tac启动子控制表达。构建了可以在
Escherichia coil

JMl09中表达的重组质粒pKK.PA、pEtac.PA。

初步的乙醇发酵结果表明,在E.coli中只引入adhB基因不能拓宽其中的产乙醇途径.引入
pdc基因可以与宿主自身的ADH酶协同作用,使碳流导向产乙醇方向。同时引入pde、adhB基

因可以在宿主E.coil中成功建立产乙醇途径(孙金风徐敏等2004)。但乙醇的产率较低,发酵
5%葡萄糖36 h,最高仅产生1.8%(v/v)乙醇,距应用还有相当距离。经过基因重组的大肠杆菌 上,引入的基因存在于质粒上,经连续发酵后质粒容易丢失雨使发酵能力下降。为了保证质粒的
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第一章文献综述

存在,须向培养基中/JⅡZ.抗生素,增加环境的选择压力抑制质粒的丢失,这将大大提高发酵成本。

除大肠杆菌以外,人们还尝试了对产酸克雷伯氏菌晖WbsW|laox ytoca)和菊欧文氏菌(Erwinia
chrysanthemi)的改造。产酸克雷伯氏菌和菊欧文氏菌不但能够代谢广泛的碳源,而且还能产生 某些纤维素水解酶,有利于转化纤维素。与大肠杆菌相似,它们的乙醇发酵能力都很低,需要进 行改造才能用于乙醇的工业发酵生产(高卫华张敏华等2004)。 另外,还有人采用细胞融合的方式培育乙醇发酵高效菌株。但在实际应用上罕见报道。钟桂 芳等通过单倍体分离和诱变获得8株休哈塔假丝酵母1766和高温酿酒酵母G47的营养缺陷型突

变株。并通过聚7,--醇伊EG)和电诱导融合等方法,实现了能发酵木糖产生酒精的休哈塔假丝酵
母和高温酿酒酵母之问的融合。融合子经DNA含量、细胞体积测定和稳定性能试验证明为稳定的 融合予。F271融合子能在45℃下发酵木糖生产酒精,其在45℃发酵木糖所产酒精体积分数为1.675 %,其转化率为68.8%。且与亲株比较。F271的酒精耐受能力提高了1%(钟桂芳刘萍2004)。

同时保持了在高温下发酵的特性。该菌株所使用的目标底物是天然纤维素原料水解液。但所有的 融合子均不能发酵而只能同化纤维二糖,即只能利用纤维二糖生长而不能利用该底物产生乙醇。
在实际应用上存在着很大的限制。

图卜1
Fig.1-l

木质纤维素材料发酵法生产乙醇的底物转化路线

The ways oflignoce|lulose translalg into ethanol by fcrmentation

1.2.4.2发酵与提取工艺上的改进 传统的发酵法最典型的缺点为:①发酵液中酒精的浓度高,抑制了细胞活力, 使生产率降

低;②细胞浓度低,在CSTR发酵器(连续流搅拌槽式厌氧反应8)ee,稀释率受到限制,设备的
投资及操作费用高; ③分离和提纯过程中能耗大(杨斌吕燕萍1997)。

为提高乙醇的产量,就要一方面促进产物形成.另一方面减少抑制因子作用。这就存在着两
11

条技术路线:一是提高发酵过程中的菌体数量与代谢活性.促进产物浓度的提高:二是采用新的 分离方法,降低或减弱末端代谢产物的反馈抑制以及其它因子对发酵系统的影响。为了得到明显 的改进,常常是两种方式结合起来进行。 (1)固定化细胞发酵系统 即将细胞用载体固定。该法可使细胞浓度增加.不会引起细胞流失,易从发酵液中分离,而 且可以多次使用.减少酵母增殖消耗的糖分,从而既增加了发酵强度,又提高了底物的转化率。根 据固定原理可分为吸附法、包埋法和共价交联法3大类(章克昌1995)。 (2)细胞循环发酵系统 细胞循环是从发酵罐流出液中回收部分或全部细胞送回发酵罐。以提商发酵液中细胞浓度。 用细胞循环法可以得到相当于简单连续发酵3倍的细胞浓度和4倍的产率(Cysewski G&Wilke R.1977),这种方法的不足在于高的细胞循环速率增加了细胞循环的负担。 (3)固体发酵系统 低含水率的底物发酵称为固体发酵。固态底物含水量很少,减少了反应的体积;还可减少原 料的预处理的费用。扩大原料的范围。K.Sato等人(SatoK,NakamuraK,Satos.1985)用淀粉质 同体原料进行乙醇发酵,然后用循环惰性气将产生的乙醇移出,发酵效率达80%以上。


(4)耐高温酵母和细菌发酵的应用探索
高温发酵可利用酵母发酵反应所产生的热量.省去传统发酵所需要的大量冷却水.对于提高 发酵效率和乙醇的分离都是有利的。Mulholland(Mulholland,D L.1984)用酵母s cerevicae(ATCC4126、4132)在40℃进行了气提发酵研究。J.Christison等人(Christison
J,Hayes W

C.1984)对23种酵母进行了筛选,得到了4种较为理想的菌种。据报道。温度越高,酵母对酒 精越敏感,耐酒精度越低,但发酵速率却越高。在利用五碳糖的方面,有人已驯化出能够在37 ℃发酵乙醇的汉逊酵母(Olena B.Ryabova,Oksana M.2003)。 选择高温细菌的好处是它们分辨代谢能力强,发酵时间短,生产能力高,发酵液的粘度降低, 搅拌所需动力减少:发酵原料液在灭菌后冷至适当温度所需移走的能量少。同时细菌容易进行遗 传工程处理,可望得到耐高温、耐酒精、能利片j多种碳源的优良菌株(秦庆军贾鸿飞王宇新
1988)。

(5)乙醇分离技术与发酵过程耦台

从严格意义上讲乙醇的分离和回收不属于发酵技术,它对乙醇发酵的连续性产生重要影响.
并决定了连续发酵能否进行。

膜分离技术是一项近几年发展十分迅速的分离技术,它具有在常温下操作、能耗低等优点。
同时该项工艺与菌种特性关系密切,例如从葡萄糖发酵制乙醇,通常用的酵母为Saccharomyces cerevisiae,但也有其它菌种生产,如z mobilis但Khorakiwala等人在膜发酵制乙醇中,认为s cerevisiae更好,虽然z mobilis生长速度快,乙酵产率比Scerevisiae高,但它对温度和pH值更

敏感,而且相同的细胞浓度下,粘度更高,泡沫也更稳定,泵送和过滤都比较困难.而使用酵母就 容易多了。另外,NH4+对Zmobitis还有抑制作用。也就是说该项技术在实际运用时要求菌种对 温度和pH值变化有较大的宽容度。应用膜分离技术与乙醇连续发酵耦合,从理论上提供了改变
传统发酵缺陷的思路(杨斌吕燕萍1997,Kargupta,1998)。 气提发酵技术(GSEF)是通过泵入C02气,将发酵液中的乙醇带出系统(LiuHwai.shen,Hsu

中国农业丈学硕士学位论文
Hsien-Wen

第一章文献综述

1990)。国内学者(秦庆军贾鸿飞王宇新2002)做了气提发酵与载气蒸馏耦合的研

究,结果表明它可以维持发酵液中较低的乙醇浓度。当增加载气循环量,发酵原料液及产品中乙 醇浓度变化很小,但蒸馏塔顶产品流率显著增大,酵母细胞的乙醇生成速率随载气量的增大而提

高。耦合后减小了产物抑制,提高产物生成速率。该项技术所存在问题是:气提蒸馏温度与发酵
温度不匹配。只有釜温较高条件下。才可获得高的乙醇回收率。当温度过高时(超过40"(2)酵母 菌发酵明显被抑制。 为了在发酵过程对乙醇提取,还使用了真空发酵工艺(CysewskiGR,WilkeCR.1977)。

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第二章研究内容与技术路线

第二章研究内容与技术路线
2.1研究内容
目前影响纤维素材料转化为酒精最主要的困难有三个。 第一、预处理成本太高,前面已提到,由于纤维素原料本身结构的特点使它很难被微生物所 利用,或者说利用起来效率很低。因此必须通过预处理使其微晶结构被破坏。或者使用新鲜秸秆,

因为新鲜秸秆的木质素含量较低,更利于纤维素酶的作用。比如新鲜的牧草可以被牛羊吸收80%。
而干牧草则只能被吸收20%。 第二、纤维素材料水解过程中发酵抑制物的产生。当对木质纤维索物质(木块)采取高温蒸 汽预处理的[GalbeM andZacchil986;BrowelIH.etall986]过程中,温度往往维持在200"C左右, 水溶性的抑制因子如乙酸、糖衍生物和木质素降解产物形成。如图2所示乙酸、甲酸、康醛、羟 甲基康醛和乙酰丙酸都直接或间接来源于半纤维素的水解产物[Palmqvist,20001。
Hemicoflulose半纤维素 Cellulose纤维素Lignin术质索

cH3c。。I.::::::::;7j心.
Xiose


CHO
Phenoliccompounds

术糖

CH20H
MaRnose

CH20H
Galactose

CH20H Glucose

甘露糖




Fur~raI

\l/
半乳糖

葡萄糖



吒 竹

棘醛

/ 趴么羟

分黼

州醛

胁 \哥

㈣\譬,
Fig.2-1

∞m酸

/.‰





\0卜嘶 \洲岫
乙酰丙酸

CHz--COOH

图2—1木质纤维素水解产物转化途径(生成的多种抑制物)
The way ofLignoccllulosc translate into different Hydrolysates

第三、五碳糖和六碳糖的共发酵问题。因为纤维素水解后的产物是五碳糖和六碳糖的混合物,
而自然界中能够同时利用已糖,戊糖发酵乙醇的微生物很少。 本论文的研究内容就主要是从这三个方面入手,分别研究秸秆稀酸水解各影响因子对水解效


率的影响,鲜秸秆和风干秸秆降解性能的差异以及五碳糖和六碳糖共发酵菌系的构建。

2.2技术路线
出发菌种

f(采自桃园土壤)

出发菌种 (购自酒厂)

I 以无酸水解液为 f营养源培养(6代)


木糖培养基

l新乙醇发酵菌系

I(筛选高效菌株)



将两种不同功能的复合菌系组台

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第三章稀酸水解影响因子研究

第三章稀酸水解影响因子研究
3.1引言
在天然纤维素中,纤维索分子之间和纤维素微丝之间的空隙非常小,且常有伴生物质填充。 其毛细管直径小于纤维素酶分子直径,使得大分子的纤维素酶很难突破空间障碍,与纤维素进行

有效的接触与作用(焦瑞身,2003)。目前,纤维素生产乙醇的主要困难是纤维素物质中的单糖释
放的效率太低,采用纤维素酶直接水解天然纤维素材料只得到很低的水解率,约14%(Nikolov T, 2000),并且成本太高。由于这样的一些原因,就需要采取预处理措施,使木质纤维素的结构能 适于随后的酶降解。

有很多促进纤维素降解的物理、化学方法.如:粉碎、热解、声波电子射线、臭氧法、浓酸
水解、碱水解、蒸汽破碎、液氨破碎、超临界C02破碎等(SunY,2002;KimTH,2003;KimKH,2001; LawtherJM,1996)。但这些方法存在能耗大、成本高、催化剂不能循环利用、产生毒性副产品、 环境污染等问题,难以推广。近年来发展迅速的稀酸处理技术可以高效破坏植物纤维结构,提高 微生物降解转化速率(Soderstrom J,2003),处理成本相对较低。不仅可以用在对天然纤维素材料

的预处理过程,而且还可应用于报纸、书籍以及牛粪等含纤维素的固体废弃物预处理过程(Nikolov
T,2000;Liao

W,2004),稀酸处理法不仅是最便宜的预处理方式,而且可以大大加强半纤维素的

水解率.可望投入实际应用(Este曲lalianA,1997;HinmanND,1992;HinmanND,1992;LloydTA,
1967)。

3.2材料与仪器
材料:秸秆取自农大试验田。自然风干、粉碎、并按粒径大小差异分别放置。 仪器:721分光光度计、恒温水浴锅、灭菌锅。

3.3试验内容与方法
首先,通过单因素试验得出各因素(温度、时间、稀酸浓度、固含物)对水解还原糖得率和 水解戊糖得率的影响。结合纤维素成分的变化,研究稀酸水解的机理。然后通过正交试验来研究
单因素对试验结果影响的大小,以及各因素之间的交互作用,得出最佳水解条件。

3.3.1秸秆成分的测定 测定风干秸秆的还原糖、戊糖含量,含水率以及纤维素材料中纤维素、半纤维素、木质素所
占比例含量。

3.3.2单因素试验方法
分别研究温度、时间、稀酸浓度、固含物对水解还原糖含量、木糖含量的影响。试验水平设
16

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第三章稀酸水解影响因子研究

置见表3.1。
表3-1 水平设置 试验因素
l 2 3 4 5 6 7

单因素试验水平设置 试验条件 水解温 度(℃) 水解时间 (rain) 稀酸浓度 (%) 周含物 (%)

!!!丝:!!!!!笪i婴!!!!!£!!!!!!坚!!121:i!!生!

3.3.3正交试验方法
在单因素实验的基础上,为更准确的了解各因素及其交互作用对水解得糖率的影响,得到最 优化的水解方案,进行正交试验。 选取时间、温度、稀酸浓度、固含物、粒径等五个因素,以及温度与时间、温度与稀酸浓度、 温度与粒径等三个交互作用作为研究对象。参考单因素试验结果,各因素的水平设置如表2所示。 由于有五个三水平的因子.以及三组交互作用需要考察,因此试验的自由度总计有:5×(3--1)
+3

X(3—1)x(3一1)=22个。因此查表选取L273。该表有27—1=26个自由度,能够满足试验
表3-2正交试验因素及水平设置

需求。表头设计见表3-2

!!幽盟:呈!!壁殳堡望塑i鲤韭!盟!!趔!!坚P!!!巴!匹
,k卓 …’

A:温度

B:时问

(℃)(rain)

c:稀酸浓 度(%)

D:粒径
(目)

E:固含物
(%)

3.3.4测定方法
3.3.4.1还原糖含量的溯定(DNS法) (1)原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是 还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖.蔗糖和淀粉是非还原糖。利 用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和

多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含
量(还原糖以葡萄糖含量计)。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5.二硝基水杨酸则被还原为棕红色的

3一氨基-5一硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分

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第三章稀酸水解影响因子研究

光光度计,在540ran波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算。便可求出样品中还原糖的含量。 (2)试剂的配制 ①lmg/oL葡萄糖标准液 准确称取80"(2烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移 到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL。混匀,4"C冰箱中保存备用。 ②3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂 将6.39 DNS和262mL
2M

NaOH溶液,加到500mL含有1859酒石酸钾钠的热水溶液中,再加

59结晶酚和59亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL.贮于棕色瓶中备用。 (3)操作步骤

①标准曲线的制作

取5支试管,分别加入1nag/ml的标准葡萄溶液1、2、4、6、8毫升,

以蒸馏水补体积到toml。得到~系列不同浓度的标准葡萄糖溶液,他们的浓度各是100、200、 400、600、800微克,毫升。 分别吸取上述不同浓度葡萄糖溶液2mI于5支试管,另取一支试管加2ml蒸馏水,于上述6 支试管内各加入2mlDNS溶液,摇匀。沸水浴加热5分钟,取出后流水冷却,定容到20ml,摇 匀,在分光光度计上于540nm处比色,读取吸光值。 ②样品测定 将待测液稀释到合适浓度,按上述操作测定吸光值。根据测定的吸光值,

结合标准曲线计算出含糖量。 (4)计算公式

还原糖浓度(mg/mL卜测定还原糖浓度(mg/m£)×稀释倍数

水解还原糖得率%=孟采嘉薹薯雾雩肴兰箸i;;;i≥两一本底还原糖含量%
3.3.4.2五碳糖的测定(苔黑酚比色法) (1)原理

五碳糖如木糖在浓盐酸和三氯化铁存在的条件下与苔黑酚煮沸时呈蓝绿反应。在一定的范围
内显色程度与糖浓度呈正比,所以可以进行比色测定。

本法对木糖的测定范围在10--100微克之间。测定时要严格控制反应条件,特别是反应时间,
才能取得比较满意的效果。 (2)试剂的配制 ①0.1%三氯化铁盐酸溶液:100毫升36%浓盐酸溶液加入0.1克三氯化铁。

②苔黑酚乙醇溶液:O.1克苔黑酚加入10毫升95%7--,醇溶液。
③木糖标准溶液(100微克/毫升):0.I克木糖溶于少量蒸馏水,定容100毫升。取上述溶液 1毫升稀释至10毫升。 (3)操作步骤 ①标准曲线的制作 吸取100微克/毫升木糖标准溶液0、o.t、0.2、0,3、0.4、0.6、0.8、

1.0毫升,分别加入各试管中,用蒸馏水补足到每管3毫升,使各管的木糖浓度分别为0、10、20、 30,40、60、80、100微克。各管分别加入0。1%三氯化铁溶液3毫升,再加入苔黑酚乙醇溶液
18

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第三章稀酸水解影响园子研究

0.3毫升,混合后放入沸水浴加热20分钟,立即放入流水中冷却。在670毫微米波长处测定吸光 值。以木糖含量为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。 ②样品测定 取3毫升代测样品(糖浓度控制在40.80Itg),其余操作与上相同,根据测定

的吸光值结合标准曲线计算出含糖量。 (4)计算公式

水解戊糖得率%=i采矗耋薯熹娄妄孑譬鬈‰一本底戊糖含量%
戊糖糖浓度(,增ImL卜测定还戊糖浓度(愕/mL)x稀释倍数
3.3.4.3纤维素、半纤维素、木质素含量的测定 (1)试剂配制 a.中性洗涤液:称取18.619 7,_--胺四乙酸二钠和6.819四硼酸钠(Na28407*10H20)同时放入 1000mL烧杯中,加少量水溶解后,再加入30.og十二烷基硫酸钠和10.OraL三甘醇和乙二醇 乙醚。称取4.659无水磷酸氢二钠.置于另一烧杯中,加少量水,微微加热溶解后倾入第一 个烧杯中,用蒸馏水稀释至1000mL。pH在6.9.7.1之间。 b.酸性洗涤溶液:称取209十六烷基三甲基溴化胺(CTAB).溶于1000mL已标定过的0.50mol/L 的硫酸溶液中,加热搅拌使之溶解。

c.0.50mol/L硫酸溶液:取499(约27mL)浓硫酸.慢慢加入已装有500mL水的烧杯中,冷却
后注入1000mL容量瓶中,加水至刻度,标定。 d.72%硫酸:取734,69mL浓硫酸,加入200mL水中,冷却后稀释到1000mL。 e.无水亚硫酸钠 f.丙酮(无色,无挥发残余物) (2)专用仪器 a.ANKOM220纤维分析仪 b.F57专用滤袋 c.封口机 d.马福炉 (j)测定步骤 ①中性洗涤纤维(NDF)的测定
a.

装袋 称取滤袋质量(m r),称取(O.5±0.05)g风干样品(过1mm筛)(m),装入滤袋;同时 称取空白滤袋质量(C1)。距滤袋边缘0.5cm处封口。 消煮 加入1900-2000mL中性洗涤液于消煮罐中,加入209无水亚硫酸钠。将样品置于消煮罐中, 缩紧上盖。按下加热和搅拌按钮,定时75rain,待温度上升到100℃的时候,启动定时器, 倒计时。 水洗

b.

c.

19

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第三章稀酸水解影响因子研究

待时间到后,停止搅拌和加热,打开排液阀将酸液排出(注意:一定先排液后开盖)。 关闭排液阀,打开上盖,加入1900-2000raL热蒸馏水(90.100"(2)。锁好上盖,搅拌3-5rain. 排液。重复洗涤两次以上。
d.

丙酮洗 取出样品,轻轻挤压使水流出,置样品于250raL烧杯中,加入丙酮没过样品,浸泡2.3min, 取出,轻轻挤压出丙酮,风干样品。

e.

烘干称重 将风干后的样品置于105"C的烘箱中干燥2-4h,取出置于干燥器中,降至室温后称重(m2)。 结果计算
表3-3 NDF计算公式对照表
...—..——Table 3-3 Calculate formula

f.

corresponding table o——f—N—D——F—.....———

测定步骤 样品编号 样品 空白 滤袋质量
ml

装样 样品质量


煮后干燥 滤袋+样品质量

c2

。l

NDF%(原样基础):』竺二!1 2=!鱼二!1 2×100


②酸性洗涤纤维(ADF)的测定 a'装样(每批24个)

称取滤袋质量(“1),称取(015±0。05)g风于样品(过lmm筛)(m),装入滤袋;同
时称取空白滤袋质量(C1)。距滤袋边缘0.Scm处封口。 b.酸洗 加入1900-2000mL酸性洗涤液于消煮罐中,加入209无水亚硫酸钠。将样品置于消煮罐

中,缩紧上盖。按下加热和搅拌按钮,定时75rain,待温度上升到100℃的时候,启动定
时器,倒计时。 c.水洗(同上) d.丙酮洗(同上) e.烘干称重(同上) £结果计算
表3-4 ADF计算公式对照表
———.——Table 3-4 Calculate

测定步骤 样品崭号 样品 空白 滤袋质量
ml

formula eorrespondin[table f—o—A—D——F——.——— 装样 煮后干燥 样品质量


滤袋+样品质量
Ⅲ2

。l

02

ADF%(原样基础)=尘必2二!垒二!!k100

20

蔓舅量■皇量曾曼曼鼍墨■曼曼曼皇!詈舅量_曹曼曼兰曼曼舅舅■皇曼曼皇鼍曼曼曼量__■量鼍釜;;;;;一;:二::;:::::
⑧酸性洗涤木质素(ADL)的测定 a.酸泡 测完ADF后,将干的滤袋放入3000mL的烧杯中,加72%硫酸没过样品,放一个2000mL 的烧杯与其中.上下搅动30min.浸泡3h。 b.水洗 用90-100℃的蒸馏水水洗至中性。

d.烘干称重(m3)(同上)

将样品至于坩锅中,525"C,灰化3h,冷却称重(m。) £结果计算

_忑=善——型芝錾剑型生塑唑竖婴唑幽!!£塑! 矍孝耋譬—=i::墅善::l=。塑塑亘王堡垂至二二二二
表3-5 ADL计算公式对照表 样品编号 样品 滤袋质量
ml

样品质量


残渣+滤袋质量


坩丽赢i——勇蕊再习再而ij三一
J11.



——兰旦———上————一一!! ADL%(原样基础)=地坠二堕上』堕=生£垃坠!二(刍二鱼塑。100
:: !!


3.4结果与讨论
3.4.1标准曲线的绘制和回归方程的确定
3.4.1.1

DNS法标准曲线

根据上述方法得出DNS法标准曲线如下:
● 2 l 0



O 6 n 4

一_【Ⅲ/∞占删帮舡
n 2 0 0 0.5 1 1.5 2

吸光值
囤3-1



DNS法(还原糖测定)标准曲线


图3-I The criterion CUI'Ve ofDNS method

回归方程为:Y=0.6715x+0.0323,R2=0.9997. 式qh:Y为含糖量: x为吸光值: R。为相关系数。

3.4.1.2苔黑酚比色法标准曲线 根据上述方法得出苔黑酚法标准曲线如下:

一∞三删姆姐

∞如∞叻∞们∞0∞ 吸光值 图3-2苔黑酚法(测戊糖)标准曲线 图3-1 Criterion curve ofmensurating xyIose

o.8

回归方程为:Y=183.06x-0.1479,Rz=0,9997, 式中:Y为含糖量; x为吸光值: R2为相关系数。

3.4.2秸秆成分测定结果 经测定,秸秆的含水率为:5.01%:还原糖含量为:6.63%。中性洗涤纤维组成中:半纤维
素%=37.27%,纤维素%=53.82%,木质索%=8.02%。

3.4.3单因素实验结果分析

3.4.3.1温度对水解得糖率的影响 如图3-3所示.玉米秸秆的水解还原糖得率和水解戊糖得率均随温度的上升而增加。当温度 在100"C以下时,水解还原糖得率和水解戊糖得率都非常低,还不到4%。而温度超过100"C以后,

水解还原糖得率和水解戊糖得率迅速上升,到125℃时.水解还原糖得率和水解戊糖得率分别达
到18.3%和14.0%。图3_4是秸秆残渣中的中性洗涤纤维在不同温度条件下的组成图。如图所示, 当水解温度由100℃上升到110"C后半纤维素在中性洗涤纤维中所占的比例由27.08%迅速下降到

16.48%。面纤维素所占比例则由57.05%上升到65,02%(其原因是因为总中性洗涤纤维的重量减
小)。当温度从1lOT上升到125℃的时候,半纤维素所占比例则由16.48%下降到7.40%.纤维

素所占比例基本保持在64%左右,而木质素所占比例则由16.83%上升到25.62%(本质索基本不
降解,其所占比例上升原因是因为总中性洗涤纤维的重量减小)。 通过计算.在水解液中戊糖得率占水解还原糖得率的比值基本保持在82%左右,当温度上升

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第三章稀酸水解影响因子研究

到125"(2时,该值下降到最低76.3%。这说明在试验条件下玉米秸秆的水解部分主要是半纤维素。 而纤维素的水解随着温度的上升,逐渐增加。同半纤维素相比,纤维素的水解需要更高的温度, 在稀酸条件下需要1lO℃以上的温度。该结论同Esteghlalian等的结论一致(Esteghlalian,A., Hashimoto,A.0.,Fenske,J.J.,PermegM.H.,1997)。而残渣中中性洗涤纤维组成的变化也能很好的 证实这个结论:纤维素在中性洗涤纤维中所占比例从由90℃的57.05%上升到110℃的65.02%后 就基本稳定在64%左右,这表示在下面这段温差内(110"C.125℃),纤维素的降解率同纤维素材 料的降解速率基本是相同的,而在1lO'C-125"C这段温差内,纤维素材料的降解率呈上升趋势。



褂 勰 贮

琏 ∞协嵋H挖如8 * 6
4 2 O 90 95 100 105 110 115 120 125

温度(℃)

——还原糖
Fig.3-3Influence ofthe

??-.-戊糖

图3-3水解温度对产糖率的影响
hydrolyzingtemperature onhydrolysis result

邑 删 缸

∞5}∞加∞翮∞ 加 0
90 i00 1lO

温度(℃) 口半纤维萦 B纤维索 口木质素

图3-4残渣中性洗涤纤维成分随水解温度变化图
Fig.3—4 The NDF components ofhydrolysed residues in different temperamres

3.4.3.2时间对水解得糖率的影响





一%)瓣锯莒}齄*



7 10 20 30 40 50 60 70 80 90

时间(rain)

——还原糖
Fig.3-5 Influence ofhydrolyzing dme

。。。一戊糖
On

图3-5水解时间对产糖率的影响
hydrolysis result






∞∞∞伯∞∞如∞∞m
0 0 10 20 30 40 60 90

水解时间(min)
团半纤维索

日纤维索

口木质素

图3-6残渣中性洗涤纤维成分随水解时间变化图
residues in different times Fig.3-6 The NDF components ofhydrolysed

如图3.5所示,水解还原糖得率和水解戊糖得率都随着水解时间的延长有明显增加。在水解

前60min内,水解还原糖得率增加非常迅速(增长76%),而当水解时间超过60分钟后水解还原 糖得率的增长速率减缓(30min仅增长9%),并逐渐趋向某一极限值。而水解戊糖得率的增长同
水解还原糖得率相比则较为缓慢,尤其是水解的后期(最后60而n内其增长率仅有18%)。在中 性洗涤纤维组成方面(如图3-6所示)。在水解的前10rain半纤维素占中性洗涤纤维的比例由37.27 %迅速下降到20.34%,到20min的时候继续下降到16.60%,而20min到90rain的70min时间内 只下降了不到8%。纤维素所占的比例则在由原来的53.82%上升到十分钟后的63.37%以后就基 本稳定在63%-65%之间。 通过计算发现,在水解lOmin后水解液的还原糖中,戊糖所占比重高达96%,到20min的

时候该比值迅速下降到86%.60min后基本稳定在75%左右。这表明,在水解前期被水解的部分 几乎全是半纤维素,纤维素的水解是在半纤维素被破坏以后才开始逐渐增加。中性洗涤纤维成分

的变化也能很好的证明这一观点。其原因可能是,木质素和半纤维素包围在纤维素外面,阻碍了 H+离子同纤维素分子的直接接触。 3.4.3.3稀酸浓度对水解得糖率的影响

z5

20



篓15

譬10

5 0 0.5 1 1.5 2

稀酸浓度(%)

图3-7稀酸浓度对水解产糖率的影响
Fig.3?7 Influence ofacid concentration
oft

hyOrolysis result

苣 豳|



∞善:舳孢∞ 蚰∞加m
0 0 5 1.0 1.5 2.0

稀酸浓度“) 日半纤维素 日纤维素 口木质素

图3-8残渣中性洗涤纤维成分随稀酸浓度变化图
Fig.3—8 The NDF components ofhydrolysed

residues in different acid content

图3.7是水解得糖率随水解稀酸浓度变化的曲线图。从图中可以看出,稀酸浓度对水解还原 糖得率和水解戊糖得率的影响都非常显著。在不加酸的条件下,水解还原糖得率几乎为零。随着
稀酸浓度得增加,水解还原糖得率迅速上升.当稀酸浓度达到1.5%时,得糖率达到最高24.3%,

并且始终保持在24.2%左右。水解戊糖得率得变化趋势同水解还原糖得率得大体趋势一致,区别 在于水解戊糖得率在达到最高值以后,随着稀酸浓度的继续增加,开始逐渐下降。其原因是稀酸 浓度的增加,加速了木糖转化为糠醛的速度(见第五章)。在中性洗涤纤维的组成方面如图3-8 所示,半纤维素所占比例随着稀酸浓度的增加迅速下降,当稀酸浓度超过1.5%后下降的速度减

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第三章稀酸水解影响因子研究

缓。而纤维素的比例则由0.0%时的54.48%迅速上升到0.5%时的65.43%此后纤维素所占比例基 本上保持在68%左右。 从戊糖、还原糖两条曲线的对比可以看出,在低酸条件下(<0.5%)水解产物中戊糖所占比

例高达95.8%,结果与Mosier等在无酸条件下的结果很一致.他们的研究表明在低于200"(2的条 件下(没有稀酸作用),纤维素材料的水解主要是木糖、半乳糖及嗣拉伯糖的低聚物的溶解,而
葡萄糖及其低聚物在水解得糖中所占比例还不到6%(Mosier N,2005)。随着稀酸浓度的增加戊

糖的含量逐渐下降.最后稳定在72%左右。所以认为。只有在高于0.5%的稀酸浓度下,一才能 有效的作用于纤维素材料。对水解残渣进行成分分析的结果同样支持这一结论:在无酸条件下,
只有很少的半纤维素被水解(与秸秆原样的对比),当稀酸浓度上升到0.50%时,半纤维素占水 解中性洗涤纤维的成分由34.86%下降到21.37%,而纤维素和木质素所占比例分别上升到65.43 %和12.01%。而当稀酸浓度上升到1.0%后纤维素和木质素所占比例分别为66.93%和18.98%,

这表示同稀酸浓度为0.5%时相比,在酸浓度为1.o%的条件下纤维素有较大一部分被分解。而当 稀酸浓度超过1.50%以后,纤维素和木质素所占比例变化都不大,这说明,当稀酸浓度超过一定
值以后,增加稀酸浓度并不能更有效的水解纤维索。 3.4.3.4固含物对水解得糖率的影响

从图3-9可以看出,固含物对水解得糖率的影响为线性关系,随着固含物的增加.水解还原 糖得率和水解戊糖得率都逐渐下降。当固含物从5%增加到15%的时候,水解还原糖得率下降了
41%,而水解戊糖得率则下降了33%。水解还原糖得率下降的速度大于水解戊糖得率的速度,戊

糖所占比例由73%上升到83%。这说明,在固含物低的时候(5.0%一7.5%),纤维素水解加快。通
过对纤维素成分的分析发现,在固含物为15%的时候在试验条件下(120"C、1.0K稀酸浓度、 60min)半纤维素占中性洗涤纤维的比例高达17.51%,这说明高固含物不仅不利于纤维素的水解,

而且也大大减少了半纤维索的水解率。其原因可能是随着圃含物的增加,溶液的黏度上升,H+
的活性下降。

20



篓16 难
琏 《12

8 5.0 7 5 lO.0 12.5 15.0

一还原糖
Fig.3-9

固台物(%)

图3-9固含物对水解产糖率的影响
Influence ofsolid content
on

hydrolysis result


Ⅷ删



∞蚰 %∞ 蚰∞ m
0 5.0 7.5 10 0 12.5

筒台物(%) 口半纤维索 日纤维素 口木质素

图3-10残渣中性洗涤纤维成分随固台物变化图
Fig.3-10 The NDF components

ofhydrolysed

residues

in different solid content

3.4.3正交试验结果
正交试验结果见表3-6。对正交试验进行方差分析(见表3.7)结果显示:影响水解还原糖得 率最大的因子是温度和酸浓度,F比分别为305.1和241.08。水解时间和固含物对产糖率的影响 也很显著,F值分别为41.23和34.03。而粒径的影响不显著,F值仅为0.73,可能是实验水平范 围选择不合适。 在交互作用方面,温度和酸浓度的交互作用(即Axe)对产糖率的影响极显著,F值为31.44。

温度和时间的交互作用(即AxB)对产糖率的影响显著。F值为6.45。而温度和粒径的交互作用 (即AxD)对水解产糖率的影响不显著,F值仅为o.84.按照惯例把它归入误差。对于显著的交
互作用AxB、A×C做交互作用分析表3-8如下:

通过方差分析得到最优结果:120"(2,时间:80min.稀酸浓度:1.5%,粒径:20目,固含 物:10%。

1 2 3 4 5 6 7 B 9 10 11 l2 l3 14 15 1 6 17 18 l 9 20 21 22 23 24 25 26 27

÷圭三巫兰兰兰基j兰主兰三三鳘=::=:.
l 1 1 1 l 1 I 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 I 1 l 2 2 2 3 3 3 1 1 l 2 2 2 3 3 3 1 l 1 2 2 2 3 3 3 1 I 1 2 2 2 3 3 3 2 2 2 3 3 3 I I 1 3 3 3 l 1 1 2 2 2 I I l 2 2 2 3 3 3 3 3 3 1 l 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 I 1
1 l l’u3

2 3 1 2 3 I 2 3 l 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

2 3 i 2 3 1 2 3 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 1 2 3 1 2 3 1 2

2 3 1 2 3 1 2 3 3 I 2 3 1 2 3 1 2 2 3 1 2 3 1 2 3 1

2 3 2 3 1 3 1 2 l 2 3 2 3 1 3 1 2 I 2 3 2 3 1 3 1 2

2 3 2 3 1 3 l 2 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 l 2 1 2 3 2 3 1

2 3 2 3 1 3 l 2 3 1 2 1 2 3 2 3 l 2 3 1 3 1 2 l 2 3

2 3 3 1 2 2 3 l 1 2 3 3 I 2 2 3 I 1 2 3 3 1 2 2 3 1

2 3 3 1 2 2 3 1 2

2 3 3 1 2 2 3 1 3 I 2 2 3 1 1 2 3 2 3 1 1 2 3 3 1 2

2-48 4 1



0.85 5.34 7.95 1 54

3.52 1 0.65 3.1 2


1 l 2 3 3 1 2 3 t 2 2 3 1 1 2 3

7.63
12.71 1.9B I 8.49 22.63 3.21 9.76 24.4 5 7.1 9 18,06 24.0I 3.69 28.19 31.65 12.5 5 27 81


3 3 1 1 1


3 3

39 60

I 1I. III.
S。 F.

34.3 104 192.7 1_40l 305.1

77.4 120.5 133.1 189.4

105.7 117.3 108.1

127.8 100.5

34.9 121.3 174.8

137 114.9 79.1

134.3 94.6 102.2

114.7 109.1 107.2 3.3

108.3 114 108.8

111.3 114.8 104.9

138.1 107.8 85.2 156.3 34
++

103.8 113.5 113.7

106 111.4 113.6 10.6) 1-2

t02.7 )

(59.3)L107 (6.5
?

(288.8)
?+

(7.8 (0.8 0

) )

( (

显著性
SE=18.4



41.2 ¨

241.1
?+

(31.4)0.7 o



注:Fom(2,8卜8

65

F。m,(2,8—46

凡1(2。8)-3

tl

¨表祟躐霉‘嚎票答18’=03,8袁4示有型壶铲叭。表示不显著

采3-7正交试验分析表
Table 3-7 The analysis ofoT'thogonaI emperiment

方差来源 A(温度)
B(时间)

偏差平方和
SA=S1=1401.53 SB=¥2=189 39 SC=S5=110749 SI)=¥8=3.45 SE=S11=156.33 SAxB=¥3+¥4=59.29 SA×C=S6+S7-288.82

自由度
2 2 2 2 2 4 4 8

平均偏差平方和
700.77 94.7 553.72 1.67 78 17 14 82 72.2

F比
305.I

显著性
十+

41,23木|B 241 08∞# 0.73 34.03 6.45 31.44

c(稀酸浓度) 0(粒径) E(固含物)
A×B A×C




} {}

误差
??表示高度显著

Se=S9+SIo+S1 l+S12=18.37 ?表示显著 O表示有一定影响

0表示不显著

褒3-8交互作用分析表
Tahie 3-8 B1 Interaction analysis oforthogonal B2 B3 Cl

experiment
C2 C3

?表示该两种囡幕水平之婀具有最强曲交互作用

3.5小结
温度对水解还原糖得率和水解戊糖得率都有显著影响,随着温度的上升,水解还原糖得率和
水解戊糖得率均迅速上升,在水解还原糖中,戊糖所占比例在80%以上。通过对纤维素成分分析 得出一下结论:在试验的温度区间内,风干秸秆的水解主要是以半纤维素为主。

时间对水解还原糖得率和水解戊糖得率的影响也非常显著,在水解的前30min水解还原糖得
率和水解戊糖得率的增欧非常迅速,而30min以后的增长速度变缓,可以说在前30rain是水解产

糖的主要时期。通过对残渣的成分分析得出,在水解的过程中主要是以半纤维素的水解为主,随
着时间的增加,纤维素的水解逐步增加。

稀酸浓度对水解效果有着巨大影响,在低酸条件下(锄.5%),水解主要是半纤维素,水解液 中戊糖含量占95%以上{当稀酸浓度上升到1.5%以后,纤维素的水解开始增加,水解还原糖中
戊糖所占的比例下降到72%。

在试验的范围内,固含物同水解还原糖得率和水解戊糖得率的关系部为线形关系,随着固含
物的增加,水解得糖率下降。 在试验的范围内,粒径对水解效果没有显著影响。而交互作用方面,温度和时间的交互作用

对试验结果的影响为显著。温度和稀酸浓度对结果的影响为高度显著。通过对正交试验的分析,
结合实际情况.得到晟优水解条件: 温度:120℃,时间:80mln,稀酸浓度:1.5%,粒径:20目,固含物:10%

第四章鲜秸秆和风干秸秆在稀酸水解的差异性
4.1引言

鲜秸秆同风干秸秆相比,由于木质化程度相对较低,水溶性糖含量较高。相对而言更容易被 降解。例如新鲜的牧草可以被牛利用80%左右,而干牧草则只能被利用20%。因此如果能够利 用鲜秸秆做水解原材料,对降低水解成本,提高水解效率有着重要意义。本章内容就是研究鲜秸 秆在稀酸水解过程中受温度、时间、稀酸浓度和固含物影响的规律。以及同风干秸秆的差异。

4.2试验材料与仪器
材料:新鲜秸秆取自农大试验田。收集后立即杀青、烘干、粉碎。 仪器;721分光光度计、恒温水浴锅、灭菌锅。

4.3试验设计与测定方法
4.3.1纤维素材料组成的差异
测定新鲜秸秆的含糖量、中性洗涤纤维的含量(以原样为基础)以及在中性洗涤中半纤维素、 纤维素、木质素所占百分比。比较鲜秸秆和风干秸秆在组成上的差异。

4.3.2试验设计
在与3,2.2.1单因素试验同等的条件下,分别研究温度、时间、稀酸浓度、固含物对新鲜秸

秆水解还原糖得率、水解戊糖得率的影响,测定水解残渣的成分。试验水平设置见表4-1。分析 新鲜秸秆与老秸秆降解性的差异,研究利用新鲜秸秆的可行性。风干秸秆试验方案见表3-1
表4—1 新鲜秸秆试验水平设置

!生!!!:!!盥!!!i鲤!!!!!些坐!!!翌旦!坐坐
水平设置 试验因素 水解温 度(℃) 试验条件 水解时 间(rain) 稀酸浓 度r%) 固吉物
(%)

4.3.3测定方法
4,3.3.1还原糖含量的测定(DNS法)
同33.4.1

4.3.3.2五碳糖的测定(苔黑酚比色法)
同3.3.4.2

4.2.3.3纤维素、半纤维素、木质素含量的测定
同3.3.4.3

4.4试验结果与讨论
4.4.1鲜秸秆和风干秸秆组成的差异
表4-2玉米秸秆的组成

!!坐!:!!!!!!业!!!坐匹!!坐壁垡旦



襟糊



嘴罂

衡黼

艨娑黜

燃嚣

从表4-2看出,鲜秸秆的还原糖含量和戊糖含量均比风干秸秆高出65%左右.而鲜秸秆的中 性洗涤纤维的含量则比风干秸秆低20%,在中性洗涤纤维的组成中,同风干秸秆相比,鲜秸秆的 半纤维素含量更高,而纤维素和木质素的含量则较低。鲜秸秆的这些性质都有利于酸水解的进行。 对于这一点将在下面的内容里进行详细的论证。

4.4.2鲜秸秆与风干秸秆在稀酸水解过程中的差异
4.4.2.1温度的影响
衰4-3不同温度条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析
Table4—3Univariateanalysis ofvariancebefweenfresh and air-dry
eol'n

strawin differenttemperatures

30

25




20

藿15 冀10
5 0 90 100 110 120

水解温度(℃)

—扣还原糖(鲜)—扣戊糖(鲜)??.△-?还原糖(干)’’-日_’’戊糖(于)
固4-I水解温度对鲜秸秆水解得糖率盼影响
Fig.4-1 The influence ofhydrolyzing temperature on flesh
COrD

straw

宗 目吲



∞加∞∞蚰∞∞加0
90 95 100 105 llO 115 120 125

温度(℃)

——◆一(鲜)半纤维素——-一(鲜)纤维索——▲一(鲜)木质素
-??o???(干)半纤维素?--自?-?(干)纤维素

--心一(千)木质索

图4—2不局温度条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异
The varlance ofhydroIyscd residues’NDF components Fig.4-2 between fi'esh and Mr-dry COrn straw in different temperatures

从圈4-1可以看出鲜秸秆的水解还原糖得率和水解戊糖得率随温度的变化规律与风干秸秆大

致相同,在温度超过100"(3以后随着温度的上升,水解还原糖得率和水解戊糖得率均迅速上升。 鲜秸秆的还原糖得率明显高于风干秸秆,而鲜秸秆的水解戊糖得率曲线则和风干秸秆几乎一致。
将水解残渣成分进行测定(见图4-2),分析残渣中纤维素的组成(以中性洗涤纤维为基础)。结 果显示,在不同温度下经过60min水解后,鲜秸秆和风干秸秆水解残渣的成分基本一致。这说明,

经过60rain的水解后,在相同酸条件下,鲜秸秆不能被水解的成分同风干秸秆基本一致。 为了找出鲜秸秆同风干秸秆在稀酸水解方面的差异,以秸秆的种类为因变量,水解还原糖得
率和水解戊糖得率为自变量。温度为随机变量,对试验结果进行方差分析。结果显示,在90"C.100

℃这个温度区间内,秸秆的种类对水解还原糖得率具有显著影响(P=0.047).而对水解戊糖得率
的影响则不显著(P=O.091):温度对水解还原糖得率和水解戊糖得率的影响姗分别为不显著

32

中国农业大学硕士学位论文

第四章鲜秸秆和风干秸秆在水解的差异性

(P卸.144)和显著(P;0.046)。这表明,在这个温度区间内,影响水解还原糖得率的因素是秸秆
的种类,而对水解戊糖得率的影响主要是温度。而在110"(2.125"C这个温度范围内,秸秆种类对 水解戊糖得率的影响同样不显著(P=O.073),温度对水解还原糖得率和水解戊糖得率均有显著影
响。

从以上结果可以得出,在不同温度梯度下,秸秆的种类对水解还原糖得率有明显影响,而对 水解戊糖得率的影响则不显著。 鲜秸秆的水解还原糖得率明显高于风干秸秆,且高出部分主要是己糖。残渣的分析结果显示, 在低温和水解的最初10分钟内(见4.4.2.2),纤维素并没有得到有效水解,其原因是在鲜秸秆的 植物体内含有大量的蔗糖。由于蔗糖是植物体内糖份运输的主要形式和暂时储存的主要形式,所 以在植物的有大景的蔗糖存在.而这一部分蔗糖在秸秆风干过程中.在蔗糖转化酶的作用下逐渐 转化为植物的营养器官如细胞壁等。 4.4.2.2时问的影响

30

25




20

器15 冀10
5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

水解时同抽in>

——?一还原糖(鲜)——-一戊糖(鲜)---△…还原糖(干)-一-13?-?戊糖(干)
图4-3水解时间对鲜秸秆水解得糖率的影响
Fig 4-3 The influence ofhydrolyzing time
on

fresh

corn straw

表4-4不同时间条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析
Table 4-4 Unlvarlate

anal),sis ofvariance between fr—es—h and air-dry

corn

straw

in—d—iffe—r—e—n——t

times

时间

参 数
F P F P
4.J}

秸秆——百而_—磊雨_———丽
.q

还原糖

戊糖

188 72l 0.005

130 585 0.008 199.853 0.005

126164 0.008 55.314 0.018

"吼盯




112.030 0.009

似咖Ⅲ蚴

.:星垒些奎茎望圭茎堡兰耋。,。。,,,。,,,,。,,。,,』鲨呈耋』堑霍至暨錾譬誉叠三::j譬!鎏:鲨
80 70 60



50

蚓40 扣30
20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

时间(min)

——?一(鲜)半纤维素——-一(鲜)纤维素——?一(鲜)木质素
???寺---(干)半纤维索??‘日‘?-(干)纤维素 。一。^?‘?(干)木质素 图4"4不茼水解时间条件下两神秸轩水解残渣中性洗涤纤维组戍的差异
Fig.4-4 The Variance

ofhydrolysed residues’NDF components
corn

between fresh and air-dry

straw in differont times

图4.3是鲜秸秆的水解得糖率随水解时间的变化规律图。从图中可以看出,随着时间的增加, 鲜秸秆的水解还原糖得率和水解戊糖得率均有明显增加,其变化趋势同风干秸秆基本一致,区别 在于鲜秸秆的增加趋势更为明显,还原糖得率更高。而对残渣的分析结果(见图4-4)显示.鲜

秸秆的各成分变化趋势同风干秸秆基本一致,半纤维素所占比例随着水解时间的增加丽减少;木 质素所占比例随着水解时间的增加而增加;而纤维素所占比例则是由前20mln的迅速增加,到
20.60min的基本保持不变。再到90rain时有所减少。

通过对数据的分析发现,在水解进行到第10分钟的时候。新鲜秸秆的水解戊糖得率和水解
还原糖得率分别为90分钟时的69.6%和68.9%。而风干秸秆的这一比值分别为68.1%和52%。当 水解进行到20分钟的时候新鲜秸秆的这一比值更是达到了79.7%和79.0%。因此可以得出结论:

稀酸(1.O%)条件下半纤维素的水解非常迅速,在很短的时间内就可以达到理想的水解效率;相
对于风干秸秆而言,新鲜秸秆水解所需时间可以大大缩短.降解更为容易。 鲜秸秆的纤维素含量同风干秸秆的残渣组成在总体趋势一致的同时.也有较大的差异.表现

在鲜秸秆残渣中纤维素的含量同风干秸秆相比,在开始阶段上升的速率更大,在最后的下降速率 也更大。差异说明:鲜秸秆在水解前期半纤维素的降解更为迅速。从而导致纤维素含量上升更快:
水解后期,鲜秸秆的纤维素更多水解,导致其含量下降。 以秸秆的种类为因变量,水解还原糖得率和水解戊糖得率为白变量,水解时间为随机变量,

对试验结果进行方差分析。结果显示,秸秆的种类在任何时间段内对水解还原糖得率和水解戊糖 得率的影响都非常显著(P值均小于O.01)。从以上结果认为,同风干秸秆相比,鲜秸秆半纤维素
水解所需时间更短;纤维素水解的效果更加明显。 4,4.2.3稀酸浓度的影响

% ∞ 踮


锝 鞲 难 堪
?祷 m





0 0 0 5 1 L 5 2 2.5 3

稀酸浓度(吣

——★一还原塘(鲜)——-一戊糖(鲜)-一△_-还原糖(干)--a--戊糖(干)
Fig.4-5 The influence ofacid

图4-5稀酸浓度对鲜秸秆水解得糖率的影响 concentrationto flesh eofll Straw

表4-5不同稀酸浓度条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析
Table 4-5 Urtivarlak Analysis ofVariance between fbSh and air-dry corn straw in

differant acid concentration

80 70 60

誊50
删40 扣30
20 10 0 0.0 0.5 l’0 1.5 2.0

稀酸浓度(%)

——◆一(鲜)半纤维素
-‘。々‘??(千)半纤维素

-.--41----.-(鲜)纤维素 --?自--?(干)纤维索

—?●r一(鲜)术质素
??-△。。。(干)木质素

圈4-6不同稀酸浓度条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异 The Variance ofhydrolysed residues’NDF eompon%ts Fig.4-6
between fresh and air-dry eom
shaw

in different acid

concentration

图4-5是鲜秸秆的水解得糖率和水解戊糖得率随稀酸浓度变化的曲线圈,从图中可以看出
35

鲜秸秆和风干秸秆的水解得糖率随稀酸浓度的增加而变化的趋势大致相同:都是随着稀酸浓度的 增加而迅速上升,并且在稀酸浓度增加到一定的时候,水解还原糖得率保持在一定水平,而水解 戊糖得率有小幅下降。区别在于新鲜秸秆的还原糖得率和戊糖得率在稀酸浓度达到1%的时候就 已经达到最佳效果,而风干秸秆则是1.5%。水解液的残渣分析结果显示(见图4-6),鲜秸秆水

解液残渣中中性洗涤纤维的组成变化趋势也同风干秸秆基本一致。尤其是在低酸条件下。两种秸
秆的半纤维素所占比例的差异不大,主要的差异表现在纤维素和木质素上。 以秸秆的种类为因变量,水解还原糖得率和水解戊糖得率为自变量,稀酸浓度为随机变量, 对试验结果进行方差分析。结果显示,在稀酸浓度为O.0%.1.O%的范围内,秸秆对水解还原糖得 率的影响为非常显著(P--0.008)。而对水解戊糖得率的影响则不显著(P=-0.205),这表明在低酸 条件下,鲜秸秆和风干秸秆的半纤维素水解并无显著差异。而稀酸浓度对于两者的影响均为显著

(P值分别为0.05和O.012)。在稀酸浓度为1.5%.3.0%的范围内,稀酸浓度对水解还原糖得率和
水解戊糖得率的影响均为不显著(P值分别为O.462和0.603)可见,对于水解而言,过分提高稀 酸浓度对水解效果并没有显著影响。而秸秆种类在这个区间内,对水解还原糖得率的影响非常显 著(P=o.002)。而对水解戊糖得率,则没有显著影响。 上面结果的分析表明,鲜秸秆同风干秸秆相比,达到水解最佳效果所需的酸浓度更低。鲜秸 秆中的纤维素更容易被水解。

鲜秸秆和风干秸秆的水解还原糖得率和水解戊糖得率在达到一定极值后均有所下降,而通过 对水解液残渣的中性洗涤纤维组成分析,发现在这段酸浓度区阈内,纤维素、半纤维素的降解继 续进行。造成这种差异的原因可能是稀酸浓度的增加,加速了还原糖向糠醛等抑制物转化的速度
(见第五章)。 4.4.2.4固含物的影响

拿 斛 糖 姑 鞋 *

固含物

——卜还原糖(鲜)——-~戊糖(鲜)。。-△.。。还原糖(干)?-?日?-?戊糖(千)
凰4-'I
Fig.4-7

固台物对鲜秸秆水解得糖率的影响
ofsolid content
on

The influence

f把sII

corn

straw

量曼皇詈暑量墨墨—■■—■墨■曼墨量■璺皇篁邕■■邕皇邕皇皇邕曼—————————————————————一 耋耋璧堂呈童鎏翟誊警翟釜三。。。。。。。。。,。。一iiiii——耋晋耋譬鏊至耋坌茎篁至窑查壁盟ili蝥II
表4-6不同固含物条件下鲜秸秆和风干秸秆方差分析
Table 4-6 Univariate Analysis ofVariance between fresh and alr-dry tom straw in different solid c:ontenl

80 70 60

窑50
删40 奇Ⅱ30
20 10 0 7.5 10.O 12.5 15.0

固含物“)

——?一(鲜)半纤维素——l一(鲜)纤维素——?一(鲜)木质素
?。?争?-(于)半纤维素?一-日‘‘‘(于)纤维素 ‘。。6。?’(干)木质素 图4-8不同固含物条件下两种秸秆水解残渣中性洗涤纤维组成的差异 The Variance ofhydrolysed residues’NDFcomponents Fig.4-8
between fresh

and air-dry tortl straw in different solid content

如图44所示,固含物对鲜秸秆水解得糖率的影响与对风干秸秆的影响趋势大概一致,随着 固含物的增加水解还原糖得率和水解戊糖得率均成下降趋势,不同在于新鲜秸秆的水解还原糖得 率和水解戊糖得率相对较高。方差分析结果显示,秸秆种类和固含物对水解效果均有非常显著的 影响。而对残渣的成分分析结果显示,在低固含物条件下,鲜秸秆半纤维索的水解效果要远好于
风干秸秆,而在高固含物的条件下,两者相差不大。

4.5小结
同风干秸秆相比,鲜秸秆更容易被稀酸水解。这主要表现在:
(1)

同风干秸秆相比,鲜秸秆的水溶性舍糖量更高(高出60%以上),木质素、纤维素的

含量更低。
(2)

相同水解条件下,鲜秸秆的水解还原糖得率明显高于风干秸秆:1.0%稀酸条件下高 同风干秸秆相比,鲜秸秆需要得水解时间明显减少,水解10min就能完成70%左右。 鲜秸秆水解时所需酸浓度更低,在1.0%得酸浓度条件下就能达到水解最佳状态,而

出60%左右,1.5%稀酸条件下高出25%左右。
(3)

而风干秸秆则只有52%。
(4)

风干秸秆则需要1.5%的酸浓度。

37

第五章水解液中糠醛类物质的产生规律 及其对发酵菌株的抑制作用

5.1前言
近年来各国科学家对纤维素稀酸水解发酵制乙醇的方法进行了大量的研究,但是乙醇的产景 和产率都不是太理想,究其原因是因为纤维素在稀酸水解的过程中产生了发酵抑制物质,如甲酸、 乙酸、糠醛、5-HMF(5-羧甲基糠醛)和苯系化合物(Larsson
a1.,1998)。
S,PalmqvistE,Hahn-H_ligerdalB,el

糠醛(furfural)是呋喃2位上的氢原子被醛基取代的衍生物,分子式为c5H402,又称2一呋喃甲

醛.学名为呋喃甲醛。糠醛是目前世界上还不能用人工合成方法生产的一种基本有机工业原料,
因其结构内有一个呋哺环和一个醛基,呋喃环又含二个双键和一个环醚键,因此化学性质活泼,

能进行氧化、缩合等反应,生成众多的衍生产品。从而使它能在塑料、橡胶、纤维、涂料、树脂、
染料、医药等方面得到广泛应用。但是糠醛亦对许多生物有害,能抑制酵母菌的生长与活动。本 章以糠醛为抑制物代表,研究水解条件与糠醛产生量之间的关系。并且以Trichosporon aquatile菌 为代表研究了糠醛对发酵菌株的抑制作用。

5.2试验材料与仪器

5.2.1材料与仪器
试验仪器:722分光光度计、恒温水浴锅、灭菌锅。

5.3试验设计与方法
5.3.1稀酸水解过程中糠醛产生的规律 分别测定前面鲜秸秆和风干秸秆水解液中的糠醛含量,研究水解温度、时问、稀酸浓度和固
含物对糠醛产生的影响。分析糠醛产生与糖浓度之间的关系。

5.3.2糠醛对发酵菌株的抑制作用
分别配置糠醛浓度为O.Omg/mL、0.25 mg/mL、0.50
mg/mL、1.5 rag/mE、0.75 mg/mL、1.0 mg/mL、1.25

mg/mL,葡萄糖浓度为5%的溶液,接入Trichosporonaquatile菌液2.0mL,在29"C、

140r/min的条件下培养。测定不同糠醛浓度下发酵菌的菌落数和菌体重量。

主望窑些奎茎彗占兰堡耋耋。。,。。。,茎三耋垒塑雪墼塑辇呈塑堡堑堡:耋量窒望型窒塑堡塑型:!!i!丝坠
5.3.3测定方法
5.3.3.1

糠醛的测定方法(紫外分光光度法) 测定原理

(I)

糠醛、羧甲基糠醛在272nm处紫外吸收无杂峰,吸收强度与其浓度成正比,不必加入任何显 色剂和对其它试剂作处理,就能取得较理想的结果。
(2)

标准曲线的绘制 分别取Oral、1.OraL、2.OmL、3 OmL、4.OraL、5.OmL的糠醛标准使用液(浓度为10.OI_tg/mL

的糠醛溶液)于lOmL比色管中,然后用去离子水补足,则比色管中糠醛浓度分别为01.tg/mL、
1.Op.g/mL、2.0p,g/mL、3.0

1.坦ffmL、4.009/mL、5.0¨g/mL,于250am处测定吸光度,绘制标准曲线。

(3)

计算方法

糠醛浓庄缸熠/m上户测定糠醛浓压珏庙/厅也)×稀释倍数
5.3.3.2 Trichosporon

aquallle菌体个数的测定方法

(1)

测定原理 同一种菌,其菌数量在一定范围之内与吸光值(在一定波长条件下)成正比。

(2)

标准曲线的绘制 取Trichosporonaquatile的菌液,用生理盐水稀释104.105倍,然后在菌落计数器上数出细菌

数量。分别取原菌液O.25mL、O.50mL、0.75mL、1.Oral、1.25mL、l,50raL、1.75mL、2.OraL稀 释到lOmL,于600nm处比色。然后将菌液体积(mL)换算成菌体数(个,mL)。绘制标准曲线。
(3)

计算方法

菌体个娄《令/秕,净测定菌体个娄价,mL)×稀释倍数
5.4结果与讨论
5.4.1标准曲线的绘制
5.4.1.1

(糠醛测定)紫外分光光度法标准曲线绘制结果

根据上述方法得出紫外分光光度法标准曲线如下:







{4



涵3
蛏 镒2




0 0 0.2 0.4 0.6 0.8

吸光值 囝5—1紫外分光光度法测糠醛标准曲钱
Fig 5-I
Criterion curve ofdetermining furfural

回归方程为:y=6.5366x.0.0591,R2=0.999 式中:Y为含糖量; x为吸光值; R2为相关系数。
5.4.1.2 Trichosporon

aquatlle菌体数测定标准曲线



2.5

T-2


聂1?5





O?5

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8

吸光值 图5-2
Fig.5-2

Trichosporon

aquati

e菌体个数测定标准曲线
ofTrichosporonaquatile

Criterion Curve ofdeterminingthe number

回归方程为:y=4.0452X.0.1254,R2=0.9913, 式中;Y为B菌菌体数(107个): x为吸光值;

R2为相关系数。 5.4.2糠醛产生规律
5.4.2.1温度的影响

1.2 1


O.8


曼 毯
蠖 糊 璐

0.6 0,4

—JⅢ,o邑越璐据鹾亚}

拍柏拍∞拍∞侣佃5
o 90 100
110

0.2


120

125

温度(℃)

——卜还原糖(鲜)—+一还原糖(干)??6…裱醛(鲜)‘’’x-‘‘糠醛(千)
图5-3水解液中糠醛浓度随温度变化曲线
Fig,5-3 Influence oftemperature to the concentration

offurfural in the hydrolysate

表5—1糠醛浓度同温度的偏相关分析
Table 5-l Partial

correlation analysis between the concentration offurfural and temperature

图5.3是鲜秸秆和风干秸秆水解液中糠醛浓度随温度变化的曲线圈。从图中可以看出,无论是
鲜秸秆还是风干秸秆,其水解液中的糠醛浓度都随着温度的上升而增加。这种上升的趋势与还原 糖浓度随温度的变化趋势很一致:当温度低于100"C的时候糠醛浓度增长较为缓慢,当温度超过 100"C后糠醛浓度迅速上升。鲜秸秆水解液中的糠醛浓度同风干秸秆相比,其浓度要明显更高, 上升速率也更快。

对水解液中的糠醛浓度和温度、还原糖浓度分别作相关性分析(见表5-1),发现鲜秸秆和风
干秸秆水解液中糠醛浓度和温度、还原糖浓度的相关性均为显著相关,其P值均为0(保留小数点 为两位,下同)。

但是,糠醛是由还原糖转化而来的,而还原糖则同水解温度显著相关,那么导致糠醛浓度上
升的最重要的原因究竟是温度还是还原糖浓度昵?为了进一步明确导致糠醛浓度上升的因素,分

别以温度和还原糖浓度作为控制变量,对结果进行偏相关分析。结果发现当以还原糖作为控制变 量的时候,无论是鲜秸秆还是风干秸秆,其水解液中糠醛浓度与温度的相关性系数都很小,P值 均大于0.05。而当以温度作为控制变量的时候,鲜秸秆和风千秸秆的糠醛浓度和其还原糖浓度的 相关性均为非常显著.P值均为0。所以可以认为。在试验条件下.影响糠醛浓度变化的主要原因 是水解液中还原糖浓度的变化;而温度在试验的范围以内对糠醛浓度的变化影响不天。

41

中国农业大学硕士学位论文

第五章水解液中糠醛娄物质的产生规律及其对发酵菌株的抑制作用

5.4.2.2时间的影响

3 乓


(1山,口邑避蟥姆噬域 惦加∞∞巧∞佰竹5


蜊 蠖 创 器

的∞们∞吣¨∞姑¨∞
10
20 30

40

60

90

时间(rain)

—{一还原糖(鲜)—+一还原糖(干)…▲???糠醛(鲜)‘。...??糠醛(干)
圈5-4水解液中糠醛浓度随时问变化曲线
Fig.5-4 Influence

oftime

to

the concentration offurfural in the hydrolysate

表5-2糠醛浓度同耐间的偏相关分析
Table 5-2Partial correlation analysis between the concentration offurfi2ral and tlme

图5.4是鲜秸秆和风干秸秆水解液中糠醛浓度随时间变化的曲线图。从图中可以看出,随着时
间的增加,鲜秸秆和风干秸秆水解液中糠醛浓度也都逐步升高。区别在于新鲜秸秆的增长速率要 明显高于风干秸秆。 与图5-3一样。风干秸秆和鲜秸秆的糠醛浓度变化趋势与还原糖的变化趋势相似,将糠醛浓度

同还原糖浓度和时间做相关性分析。结果显示:鲜秸秆和风干秸秆水解液中的糠醛浓度同还原糖
浓度和时间之间的相关性都为显著相关(结果见表2)。 同上一小节一样,为了进一步明确水解液中糠醛浓度同还原糖浓度、时间的关系,对试验结

果进行偏相关分析。当以还原糖作为控制变量做时间和糠醛浓度的相关性分析时。结果显示:无
论是鲜秸秆还是风干秸秆,二者的相关性均为显著相关,P值均小于0.I。而与前面结论相反,当 以时间作为控制变量时.糠醛浓度和还原糖浓度之间的相关性为不显著。其原因可能是在不同时

间条件下.水解液中还原糖浓度的差异不大,导致难以形成有效的浓度梯度,对糠醛浓度造成显 著影响。而时问则是能够显著影响水解液中的糠醛浓度,减少水解时间能够有效减少水解液中抑
制物的形成。

5.4.2.3稀酸浓度的影响

1?4
12 ,



0.8呈
一-1山,。E)|越袋鞋肾亚f

0.6篓 04鬻
牾柏∞∞弱∞12伯5
o 0 0.5 1 1.5 2 2

02 0 5


稀酸浓度(%)

——-一还原糖(鲜)—??一还原糖(千)?-_△-?糠醛(鲜)???静??糠醛(干)
田5-5水解液中糠醛浓度随稀酸浓度变化曲线
Fig.5-5

Influence

ofacid concentration to the

concentration offurfural in the hydrolysate

表5-3糠醛浓度同稀酸浓度的偏相关分析
Table 5-1 Partial correlation analysis between the

concenMion

offurfural and the concentration ofacid

图5—5是水解液中糠醛浓与稀酸浓度的关系图。从图中可以看出,随着稀酸浓度的增加,水解 液中糠醛的浓度也迅速上升,当稀酸浓度超过1.5%后,糠醛的浓度基本保持在一个圃定的水平。

这种变化趋势与还原糖随温度变化的趋势很类似。不同的是对于鲜秸秆,其还原糖浓度在稀酸浓 度为1.0%的时候就达到稳定水平,而其糠醛浓度则要到1.5%的时候才能达到这一水平。 对糠醛浓度和还原糖浓度、稀酸浓度做相关性分析,同上面两组试验一样,四组相关性都很
好,P值均为0(见表5.3)。

偏相关分析结果显示,当以稀酸浓度为控制变量,做糠醛浓度和还原糖浓度的相关性分析,
结果同温度处理一样,无论是鲜秸秆还是风干秸秆,其相关性均为高度相关。而当以还原糖为控 制变量.做糠醛浓度和稀酸浓度的偏相关分析时得到的结果则不一样:对于鲜秸秆.相关系数

r:0.72,P=O.00,显著相关;而对于风干秸秆FO.33,P=0.15,不相关。其原因是鲜秸秆的水解还
原糖中己糖所占比例更高,而己糖所产生的羧甲基糠醛的化学性质比糠醛要稳定。

l塞l星童些奎茎堡圭兰皇鎏兰!,。,,,』篓呈茎垒塑窑墼蛰墼彗馨型彗垩羔耋墼圣圣圣蝥耋鳘耋篓童::!i!堡坠
5.4.2.4固含物的影响 ∞ ∞ 加 ∞ 加
一-lⅢ,口邑巡璐躲隧增 ∞

5.0 7.5 1 0 1

0.9 08
0.7 06 0

3 乓




划 蛏 始 蜒

014

0.3 0.2
O.1

0 12,5 15.0

同含物(%1

---,It----还原糖(鲜)—卜还原糖(干)

?,-△---糠醛(鲜)

‘‘’舯。‘糠醛(干)

圈5-6水解液中耱醛浓度随固含物变化曲线
in the hydrolysate Fig.5-6 Influence ofsolid concentration to the concentration offurfural

表5-4糠醛浓度同固含物的偏相关分析
Table 5-4 partial correlation analysis between the concentration offurfural and the solid concentration

图3是水解液中糠醛浓度与固含物的关系图。从图中可以看出,随着固含物的增加-水解液

中糠醛浓度也迅速上升,但是鲜秸秆和风干秸秆的上升趋势有所区别:鲜秸秆的上升趋势一直保 持在一个比较高的水平.而风干秸秆水解液中糠醛的含量则在固含物超过10%后,基本不再上升,
仅从10%时候的305.4(/ag/mL)上升到15%时候的316.8(ptg/mL)。上升幅度不到3%a 相关性分析结果显示,鲜秸秆和风干秸秆水解液中糠醛含量同同含物、还原糖含量的相关性 均为显著相关。 以固含物为控制变量,进行糠醛浓度同还原糖含量的偏相关分析,结果同5.4.2.1、5.4.2.3结 论相同,鲜秸秆和风干秸秆的糠醛浓度和其还原糖浓度的相关性均为非常显著,P值均为oe

而在以还原糖浓度为控制变量的条件下,做糠醛浓度与固含物的偏相关分析,结果显示无论是鲜
秸秆还是风干秸秆其r值均小于o,即固含物同糠醛含量之间的关系为负相关,当然,由于P值均

犬于o.05所以,其负相关性并不显著。这一结果显示,固含物的增加可能减缓糠醛形成的速率。
而固形物的增加同样会减小秸秆的水解得糖率。其原因可能是在高固含物的条件下,水解液中的 H+的活性降低。

土星奎些盔兰塑圭兰竺耋耋l。。。。。,茎茎耋』坠至墼型墼墼茎丝里墼耋耋堡堡垒董垩耋螫墓篓耋!垩!!堡星
5.4.3糠醛对发酵菌株的抑制作用
O 1 35

1 2

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0 8 0 0.25 0.5

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0.095

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1.25

糠醛浓度

——-一菌体个数

?--..-?lOml发酵液菌体重

圈5-7发酵液菌体个数和菌体质量随糠醛浓度变化曲线
Fig.5-7 Influenceofthe concentrationoffurfuraltothenumber andweightofthezymogen+

如图5.7所示,糠醛对发酵菌株的抑制作用非常明显:随着糠醛浓度的不断增加,单位体积

菌液内所含菌体个数也随之下降。当糠醛浓度在O.25.0.5mg/mL的时候(风干秸秆水解液的糠醛 浓度范围),菌体个数为对照试验的88%一90%左右,而菌体重量也为对照的88%左右。面当糠
醛浓度大于0.75mg/mL(新秸秆水解液中糠醛浓度)的时候,菌体个数为对照试验的75%左右,

菌体的重量为对照的82%左右。因此当利用稀酸水鹪底物(尤其是鲜秸秆)进行发酵试验的时候,
最好对其抑制物进行去除。

5.5小结
水解液中糠醛的含量主要受还原糖浓度、时间的影响,而水解温度、固含物对糠醛浓度的影
响并不显著。稀酸浓度对鲜秸秆水解液中糠醛浓度的有显著影响,而对风干秸秆则没有显著影响。

在水解液所含糠醛浓度条件下。糠醛对B菌有明显的抑制作用,所以应当对水解液进行抑制物去


第六章戊糖发酵菌株的选育及复合菌系 酸水解底物的初步发酵试验
6.1前言
纤维素材料水解后得到的糖液是由葡萄糖、术糖、阿拉伯糖等等多糖菇存的混合液。据已

有的文献,对戊糖、己糖混合糖发酵主要有两种方法,一种是采用基因工程手段。将发酵不同糖
的基因转入同一种微生物体内.使之表达,从而达到利用混合糖发酵乙醇的目的。另一种是将利 用戊糖、己糖的不同微生物共培养。本章内容就是通过培养桃园土壤中的能够利用木糖的微生物, 选育出能够发酵木糖的菌株,构建复合菌系。

6.2材料与方法
6.2.1仪器和试剂
HORIBA--212型酸度计; 岛津GCMS--QP2010型气质联机 722分光光度计; 超静工作台。

6.2.2出发菌种
戊糖发酵菌:取自桃源土壤,分离 己糖发酵菌:购自酒厂。

6.2.3培养基
(1)木糖培养基:木糖2.o%.蛋自胨O.5%,酵母粉O.5%,琼脂1.5%,pH值5.0 (2)酵母培养基:葡萄糖1.o%,蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,琼脂2.o% (3)水解液:戊糖发酵菌种选育用水解液为:风干秸秆在120"C、不加酸条件下,水解60min 所得水解液。 复合菌系发酵用水解液为:110"C、120"C处理.稀酸水解条件是1.5%稀酸浓 度、10%固含物,水解90min。

6.2.4戊糖发酵菌株的选育
试验步骤为:
(1)

将19选取的桃园土样加入100mL无菌水中,充分混匀

(2)
(3)

取上述菌波lmL加入到50mL的水解液中,29。C、70r/rain,条件下培养。 观察培养液的混浊度,在菌系的活动旺盛时期,取5mL菌液转接到新的培养液中? 如此进行6.7代,每代时间大约在3-5天。

(4) (5)

将上述菌液转接到木糖培养基上,培养、继代。比较分离长势良好的菌株。 对分离出来的菌株进行菌种鉴定。

6.2.5复合菌系的发酵特性研究
6,2.5.1复合菌系发酵过程中pH值的变化 向1IO'C、120"(2处理,稀酸水解条件是1.5%稀酸浓度、10%固含物,水解90min所得水解 滚中按体积比1/50接种混合菌液。测定发酵液中的pH值变化。 6.2.5.2复合菌系发酵过程中残糖浓度的变化 向110"C、120"C处理,稀酸水解条件是t.5%稀酸浓度、10%固含物,水解90rain所得水解 液中按体积比1/50接种混合菌液。测定发酵液中的残糖浓度变化。 6.2.5.3测定复合菌系发酵产物的组成 在酸系列水解液发酵进行到9天的时候取1IO'C处理的发酵液,用气质联仪测定发酵液成分 和浓度。

6.2.6测定方法
6.2.6.1

pH值的测定方法

用日本产HORIBA--212型酸度计测定。 6,2。6.2还原糖的测定方法
见3.3.4.1

6.2.6.3产物的测定方法 待测样品用0.2um孔径的过滤膜过滤。测定条件如下:

日本岛津公司GCMS--QP2010型气质联机和RT--pDEXSM毛细管柱:柱箱温度50℃ (1min.)_÷100℃,5。C/min,一195℃,16"Clmin,(o.5rain.);迸样口温度190"C;检测器温度230"C:载
气He(60kPa);流量31mL/min;分流比1/20;监测器电压0.75kv,进样量1


l。对测定结果的

峰用NIST数据库分析进行定性,并将相应的商品化合物稀释液作为标准物进样,对部分样品进
行定量分析。

47

6.3结果与讨论
6.3.1戊糖发酵菌株选育结果
通过上述试验步骤I、2、3得到一组能够在混合糖液条件下生长的菌系,分别将茵液接种到 葡萄糖培养基和木糖培养基上进行纯化培养。图6-I是经过6次继代以后木糖培养基上菌落的生 长情况。

图6_l经过6玫继代后木糖培养基上发酵菌系的生长情况
Fig 6-l

The袖generation xylose码,IⅡog∞s

in the xylose

subsU'ate

固6-2分离出的4株木糖发酵菌株 Fig 6-2 Lastfourxylose zynlogons

土星奎当奎耋要圭茎竺兰耋。。。。,,,,,尘耋耋2塑墼鐾墼墼墼窑耋暨耋耋墼茎璧查堡量丝垫垄i:鐾薹譬
将木糖培养基上的菌株进行继代培养,选取、分离发酵活性强的菌株进行分离-得到四株菌 (见图6.2)。经过鉴定这四株菌均为酵母,分别为: A(红色):Rhodotorula B(灰色):Trichosporon
mucUaginosa; aquatile?


C(黄色):Cryptococcusflavescens D(白色);Saccharomyceskluyveri.

6.3,2复合菌系稀酸水解底物发酵试验
6.3.2.1复合菌系发酵中残糖的变化

一迫粤毯避帮避吲
∞驰∞∞如∞0
0 3 4 5 6 7

时间(d)

——e一110"(2处理
Fig.6-3 The
curve

--?---?120℃处理

围6—3发酵液的残糖变化曲线
ofresidual glucose ofthe fermentation

图6-3是风干秸秆分别是110"C、120"(2处理的发酵物残糖变化图。稀酸水解条件是1.5%稀
酸浓度、10%固含物,水解90min。水解后加适量的ca(oH)2,调节pH值到4.5左右。通过图6-3

可以看出。水解液中的还原糖在很快的时间内就被微生物所利用,从第三天开始发酵液中的残糖
含量就趋于稳定。这些残糖应该是不能被现阶段复合菌系所能利用的,这些残糖占总还原糖浓度

的20%左右。所以在下阶段的工作中可以以发酵液为营养源,培养能够利用这部分残糖的菌株。
6.3.2.2复合菌系发酵过程中pH值的变化

ij
|| || || || || || || || || || || -' ||























10

时间(d)

——?一IIO'C处理pH值
Fig.6-4

‘‘’?。’’120"C处理pH值

图6-4发酵液的pH值变化蓝线
The pH“rve ofthe fermentation

图6-4是上述发酵液的pH值变化曲线图。从图中可以看出,随着时间的增加,发酵液的pH 值逐步下降,到第三天的时候达到摄低值,随后pH值叉开始逐步回升,到最后达到6.0左右。

其原因是因为在发酵前期,产生甲酸、乙酸等酸类物质.所以pH下降:而后期发酵液上升的原
因是这些酸类物质,开始同乙醇作用转变为酯类物质。 6.3.2.3复合菌系发酵产物分析

选取酸处理系列中O.5%处理在发酵第13天时候的发酵液,用气质联仪进行产物种类和浓度 分析(见表6.1)。结果显示发酵的主要产物为乙醇和甘油,这两种产物占总的发酵代谢物峰面积
的97.17%。其他代谢产物还主要有甲胺、甲酰胺和丙酸。虽后发酵液中乙醇和甘油浓度分别为:
1.15mg/mL和O.81mg/mL。 表6-1 代谢产物的气相色谱数据 峰面积 峰面积% 峰高 峰高%

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项目

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保留时间

图6-5、图6-6分别是是发酵产物的气相色谱图和质谱分析图。

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图6-5发酵代谢产物的气相色谱固
Fig.6-5 The gas chromatography picture offermentmion outcomes

囤6-6发酵代{身}产物的质谱分析
Fig.6-6 The mass spectrum analysis picture offermentation outcomes

6.4小结

在复台菌系的发酵过程中,pH值先下降后上升。其主要原因是在发酵过程中产生低分子有机
酸,然后同乙醇作用生成酯类物质。发酵液中的还原糖在头两天就基本被利用完毕。复合菌系的

发酵产物主要为乙醇和甘油,其浓度分别为1.15mg/mL和O.81mg/mL。造成甘油浓度过高的原因 可能是筛选的某些术糖利用菌株的发酵产物就是甘油;还有可能秸秆中的粗蛋白含量较高,导致
发酵液中含氮量过高。

第七章总结与建议
通过试验得到以下结果:

(1)温度对秸秆的水解效果有非常显著的影响。当温度超过100"C后,随着温度的增加,水
解还原糖得率迅速上升:而在100℃一下,温度的变化对水解结果没有显著影响。水解时间对水 解效果亦有显著影响,尤其是在水解的前30mln水解还原糖得率的增长速度非常迅速。30min以后, 水解还原糖得率的上升速度变缓慢。稀酸浓度对水解效果的影响也非常显著,在120"12、无酸条 件下风干秸秆几乎不能被水解。随着稀酸浓度的增加,水解还原糖得率迅速上升:而当稀酸浓度 超过I.5%后,水解还原糖得率基本保持在一个稳定的水平。固含物对水解效果的影响也是非常显 著:在高固含物的条件下,半纤维素的水解受到抑制。粒径在试验的范围内对试验结果没有显著 影响 (2)在交互作用方面温度和时间的交互作用对试验结果的影响为显著,温度和稀酸浓度对

结果的影响为非常显著。通过正交试验得到最优水解条件:120"(2,时间;80rain,稀酸浓度:1.5
%.粒径:20目.固含物:10%。 (3)试验条件范围内,玉米秸秆的水解主要以半纤维素为主。纤维素的水解率随着稀酸浓 度和水解时间的增加有明显上升。

(4)鲜秸秆同风干秸秆相比,水溶性糖含量更高(1.65倍),中性洗涤纤维含量更低(O.80 倍)。在相同试验条件下,水解还原糖得率高出25%.60%。同风干秸秆相比,鲜秸秆在较短的时
间(20min-30min),较低的酸浓度(1.0%)条件下就能达到最佳水解效果。

(5)影响水解液中糠醛浓度的主要因素是还原糖浓度、时间。而温度和固含物对其影响并 不显著。而稀酸浓度则只对鲜秸秆水解液中的糠醛浓度有明显影响。在试验所得的糠醛浓度范围
内,Trichosporon aquatile菌受抑制显著。

(6)复合菌系在发酵过程中还原糖在前两天就基本被利用完毕,发酵液的pH值先下降后上
升,最后保持在弱碱性。发酵产物主要是乙醇和甘油,浓度分别为:1.15mg/mL}rlO.81mg/mL

建议如下: (1)使用鲜秸秆作为水解原料,水解的条件为:120'(2、1.0%稀酸浓度、lo%固含物、水解 时间20min。

(2)在使用风干秸秆作为水解原料的时候,可以将水解时间缩短i为40min。这样既可以节约
能源,又可以减少抑制物的产生。 (3)对水解液进行抑制物去除,减少抑制作用。 (4)选育能够有效分解水解残渣的菌株,提高秸秆的利用效率。 (5)将水解发酵残液进行浓缩,利用残糖进行菌株选育,建立利用率更高的复合菌系。 (6)继续研究甘油产量过高的原因,减少发酵产物中的甘油含量。

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中国农业大学

致谢

致谢
本文是在李国学教授的精心指导下完成的。从论文的选题、试验设计、试验实施到论文撰写, 都倾注了恩师大量的心血。两年中李老师渊博的学识、创造性的思维和严谨的治学态度,常常给 我很深的启发.让我感受到了科研工作的乐趣和魅力。在科研工作之外,李老师在学习生活上给 予我以莫大的关心和帮助,使我顺利完成硕士研究生阶段的学业。在此论文完成之际,向恩师多 年来为我付出的心血与辛勤劳动表示由衷的敬意和诚挚的感谢。 特别感谢路鹏师兄在试验和论文的工作中给予我的帮助和指导,本论文许多试验都是在他的 帮助和指导下完成的。感谢李燃师妹在试验中给予我的帮助。 在多年的求学历程,得到了环境工程专业张宝莉、夏立江、刘英、陈京生、李花粉、盂凡乔

等老师的热情指点与无私帮助,在生活上的关心和鼓励。在此向他们表示衷心的感谢l
感谢李彦明师兄,秦莉、王丽莉师姐,及孙昊、尹莉、涂淑兰、徐鹏翔等同学在学习和生活 上对我的热情帮助。同时,向论文所引用文献的作者也一并表示诚挚的谢意j

感谢99环境工程的兄弟姐妹们在生活和学习中对我真诚的鼓励和无私的帮助,值此论文完成
之际,谨向他们致以我最诚挚的感谢{ 最后,特别感谢我的父母、向方桃以及家中长辈对我一如既往的的支持、关心和爱护,是他 们的理解和支持使我顺利地完成了多年的求学生涯。

江滔 2006年6月

中国农业大学

作者简介

作者简介
作者姓名 民族:汉 毕业院校 研究方向 江滔 性别;男 籍贯:四川省广汉市 年龄:25岁 政治面貌:中共党员 专业:环境工程

中国农业大学 固体废弃物处理与资源化

2004年9月--2006年7月

中国农业大学资源与环境学院环境工程专业硕士研究生 2003年8月一2004年8月
内蒙古磴口县西部计划志愿者 1999年9月--2003年7月

中国农业大学资源与环境学院环境工程专业本科生


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