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苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定


苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定
09 级园林工程系生物技术及应用班级 (制作人—王珏 指导教师—韩磊) 内容提要 本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、 接种等无菌操作技术, 掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的 应用和发展前景前景。 关键词 苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定;明胶酶;明胶的液化;精氨酸脱羧酶

;尿素酶

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 玻璃器皿
烧杯;三角瓶;量筒;玻璃棒;培养皿;试管;移液管;涂布棒;酒精灯;胶头滴管等

1.1.2 实验仪器
超净工作台;光照培养箱;水浴锅;摇床;电子天平等

1.1.3 其他用具
研钵;纱布;吸耳球;八层纱布;剪刀;棉塞;pH 试纸;胶头滴管;牛皮纸;麻线; 喷壶等

1.1.4 实验材料
土壤表层土样;叶片;苏云金芽孢杆菌菌粉

1.2 方法与步骤
1.2.1 选择性培养及扩大培养
1.2.1.1 灭菌前准备 1)PBA 培养基的制备
PBA 培养基配方(1L)

配方 用量

蛋白胨

牛肉膏 5g

醋酸钠 34g

PH 7.0-7.2

10g

配置 750mL 的 PBA 搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内, 随后用棉塞及牛皮纸封口包 扎;以备灭菌(121℃,20min) 。

注(制备的培养基中有 500mL 中不含有醋酸钠)

2)灭菌器材的准备 将需要灭菌的三角瓶、 纱布、 搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭 菌(121℃,20min) 。 1.2.1.2 灭菌 1、注水:往灭菌锅内注入适量的蒸馏水; 2、 预热: 放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟; 3、 加热升温过程: 将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖 好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→ 待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀;此后是升压的 过程; 4、升压、降压过程:开始升温后压强随之升高,待到压 强为 0.05mpa 时关掉电源;此后为降压过程,当压强降到 0mpa 时打开放气阀放气。 放完气后关掉放气阀接通电源, 再 次升温、降温后打开放气阀放气,放完气之后关掉放气阀接 通电源;此后为升压保压的过程; 5、升压保压过程:当压强从 0mpa 升到 1.1mpa 时开始计时;当压强升到 1.13mpa 时关 掉电源,待压强降到约 1.1mpa 时再接通电源;再次升压至 1.13mpa 时关掉电源开始降压, 当降到 1.1mpa 时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作,使此过程保持 20 分钟。此后 为降压出锅过程; 6、降压出锅过程:保压 20 分钟后关掉电源等待降压至 0mpa 时打开放气阀放气;用抹 布打开灭菌锅的锅盖,然后将灭完菌的器具和培养基取出; 1.2.1.3 样品的预处理 三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共 5 份→土壤研磨、 叶片剪碎→每份样品称取 5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于 75℃的水浴锅中保温 10min→静置 1.2.1.4 超净工作台的准备 接通电源后打开紫外灯,30 分钟后关掉紫外灯打开风机约 20 分钟;然后用肥皂洗手后 进行无菌操作。 1.2.1.5 无菌操作 1)培养基的完善及分装(对照试验 对照试验) 对照试验

第二、 三小组往各组的 PBA 培养基内分别加放适量的青霉素和庆大霉素, 随后每 40mL 分装到无菌的小三角瓶内。
注 (待无菌的培养基稍冷后进行操作; 在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用 75%酒精进行表面灭菌。 )

2)接种 各组将适量的样液过滤液过滤到搖瓶培养基内, 然后在搖瓶外壁上标明样品名称、 接种 时间及小组序号;最后将所有的搖瓶包扎好进行培养。 1.2.1.6 培养 在所有搖瓶的外壁上标明样品名称、接种时间及小组 号,随后将搖瓶置于 200r、min 的摇床上进行培养。培养 24h 后下摇床并置于冰箱内保存,等待菌种分离

1.2.2 菌种分离及纯化
1.2.2.1 灭菌前准备 1)BP 培养基的制备
BP 培养基配方(1L)

配方 用量

牛肉膏 5g

蛋白胨 10g

氯化钠 5g

琼脂 20g

PH 7.0-7.2

配置 900mL 的 BP 固体培养基后分装于三个大三角瓶内,随后用棉塞及牛皮纸封口包 扎;以备灭菌(121℃,20min) 。
注(制备的培养基中有 600mL 不含氯化钠)

2)灭菌器材的准备 将需要灭菌的培养皿、涂布棒、移液管、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式 高压灭菌器进行灭菌(121℃,20min) 。 1.2.2.2 灭菌 准备就绪后利用手提式灭菌锅进行灭菌(121℃,20min) 。 1.2.2.3 超净工作台的准备 接通电源后打开紫外灯,30 分钟后关掉紫外灯打开风机约 20 分钟;然后用肥皂洗手后 进行无菌操作。 1.2.2.4 无菌操作 1)培养基的完善及分装(对照试验 对照试验) 对照试验

第二、三小组往各组的 BP 培养基内分别加放适量的青霉素和庆大霉素,随后每 20mL 倾注到无菌的培养皿内。
注 (待无菌的培养基稍冷后进行操作; 在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用 75%酒精进行表面灭菌。 )

2)涂布接种 平板培养基的凝固→用无菌的移液管从搖瓶内吸取 1-2mL 的菌液→涂布平板 1.2.2.5 培养 在所有平板的外壁上标明样品名称、接种时间及小 组号,随后将搖瓶置于 30℃的光照培养基内进行培养, 三天后观察并记录结果。 1.2.2.6 菌种的分离及纯化 观察菌种在不同平板培养基中的长势并对其进行分 析,然后挑选出长势较好的平板菌种进行纯化,对个别菌种进行分离。 1)BP 固体培养基的制备 制备 400mL 的 BP 固体培养基→分装出十三只试管 (每管大约 10mL 培养基, 用于菌种 分离)→将所剩的培养基装于三角瓶内→分别对试管、三角瓶封口并包扎→灭菌 (121℃,20min) 2)灭菌器才的准备 将实验所需的搁置架、纱布、培养皿接种环进行分别包扎后用手提式灭菌器进行灭菌 (121℃,20min) 。 3)无菌操作(即:菌种的分离及纯化) 超净工作台准备就绪后事先将灭菌的培养基倒平板, 然后在酒精灯火焰附近将长势较好 的平板菌种进行纯化;纯化后再将挑选出的个别单菌落进行分离。 4)培养 将纯化的平板菌种和分离出的试管菌种置于 36℃的光照培养箱内进行培养。

1.2.3 菌种的鉴定
由于第一次进行分离时菌种长势不好所以利用的是补救实验中再次分离出的四种不同 的菌种以及从菌粉中分离出的六个菌种进行了鉴定。

1.2.3.1 菌种的分离 1)BP 固体培养基的制备 制备 500mL 的 BP 固体培养基后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管进行封口、包扎,等待 灭菌(121℃,20min) 。 2)灭菌器才的准备 将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环进行分别包扎后进行灭菌(121℃,20min) 。 3)灭菌 准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌(121℃,20min) 。 4)菌种的分离 超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近将挑选出的四种平板菌种分离到试管斜面上。 5)培养 标记好分离菌种的形态及代号后将菌种置于 36℃的光照培养箱内进行培养,三天后观 察结果。 另外从购买的苏云金芽孢杆菌纯菌粉中分离出菌种 1)BP 固体培养基的制备 制备 500mL 的 BP 固体培养基后事先分装出 200mL 试管培养基;随后将剩余的培养基 置于大三角瓶内,随后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管和三角瓶进行封口、包扎,等待灭菌 (121℃,20min) 。 2)无菌水的制备 分别向五个小三角瓶内加放 10mL、9mL、9 mL 、9 mL 、9 mL 的蒸馏水;随后用棉 塞和牛皮纸进行包扎,以备灭菌(121℃,20min) 。 3)其他灭菌器才的准备 将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环、涂布棒进行分别包扎后进行灭菌 (121℃,20min) 。 4)灭菌 准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌(121℃,20min) 。 5)菌种的分离 超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近进行无菌操作。操作流程如下:

倒平板→平板培养基的凝固→菌悬液的制备 (称取 0.0001g 菌粉溶于 10mL 的无菌水中) →摇匀→菌悬液的梯度稀释(利用其他四瓶无菌水完成负一至负四梯度的稀释, )→摇匀稀 释液→徒步接种(每梯度的稀释液重复两个平板)→培养→适时转接试管斜面→培养
注(每次在用移液管和涂布棒的前后务在酒精灯火焰处进行灭菌,且在其温度降下后再使用为的是其避免 烫死菌体)

1.2.3.2 菌种的鉴定 一、明胶液化实验 1)实验原理: 有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶(即:类蛋白水解酶) 。明胶酶能将明胶水解为 多肽,进一步水解为氨基酸,使得明胶失去凝胶性质而液化。 又明胶在 20℃的温度下开始液化且培养温度却高于 20℃,所以让培养后的平板和试管 菌种经过低温处理或者利用倾注酸性升汞法来验证该菌是否产生明胶酶即: 是否为阳性, 从 而排除温度对明胶液化的因素。 2)操作步骤:
明胶培养基配方(1L) 成分

牛肉膏 5g

蛋白胨 1g

葡萄糖 1g

明胶 4g

氯化钠

KH2PiO4

K2HPiO4 0.5g

琼脂 20g

用量

5g

0.5g

按照培养基配方配置 1400 固体培养基 ↓ 分装试管(800mL) (每支斜面培养基高度约为试管的 1/2) ↓ 灭菌器才的封口及包扎 ↓ 灭菌(121℃,20min) ↓ 超净工作台的准备及表面消毒 ↓ 平板培养基的分装及冷凝



穿刺接种及点植 (对 4-10 号菌种进行穿刺及点植) ↓ 标记 ↓ 培养 (将平板、试管菌种置于 36℃的光照培养箱昂内进行培养,三天后观察结果) 3)鉴定过程 挑选出每种菌体经点植后长势较好的平板菌种→40ml 酸性升汞的配置→滴加升汞→静 置→与没有滴加升汞的菌种进行对比,观察现象。

滴加升汞的过程

对照试验: 成分 用量 明胶 4g 琼脂 5g 蒸馏水 1000mL

按照上述配方配置 500mL 的培养基 ↓ 倒平板 ↓ 培养基的凝固 ↓ 滴加升汞 ↓ 静置 ↓

与空白最对照,观察现象 二、精氨酸脱羧酶试验 1)实验原理: 有的菌体能产生脱羧酶, 令氨基酸发生脱羧反应生成胺和二氧化碳, 从而使得培养基的 PH 发生变化。利用该原理使分离出的菌落在加放精氨酸的培养基上进行生长,让溴甲酚紫 作指示剂,来验证菌体的特性。 补充:溴甲酚紫显色原理 其变色范围为 pH(5.2-6.8) ;当 pH 为 5.2 时显黄色,当 pH 为 6.8 时显紫红色。

2)方法与步骤 (1)培养基的制备
精氨酸培养基配方

配方

磷酸 氢二 钾 1g

硫酸镁

氯化 铵 1g

酵母膏

葡萄 糖 1g

DL-精 氨酸 2g

溴甲 酚紫 1g

蒸馏水

PH

用量

0.2g

0.3g

1000mL

6.8

制备 500mL 的精氨酸液体培养基(不含 DL-精氨酸)后分装至 31 个试管内,随后往 21 个试管内滴加适量的石蜡封口;最后用牛皮纸和麻线对试管进行封口、包扎,等待灭菌 (121℃,20min) 。
注(因 DL-精氨酸不能高温加热,所以在培养基灭菌之后再向各个管中滴加 DL-精氨酸; )

(2)灭菌器才的准备 将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种针、镊子、棉花以及盛有 20mL 蒸馏水的三 角瓶进行分别包扎后进行灭菌(121℃,20min) 。 (3)灭菌 准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌(121℃,20min) 。 (4)培养基的完善 称取 0.5g 精氨酸→溶于无菌水中→摇匀→置于无菌的培养皿内→无菌针头内无菌棉的 加放→药品的吸取→加放精氨酸(每支管加放 0.4mL)→摇匀培养基→接种(每个菌种取三 次样分别置于两个滴加精氨酸的培养内和一个不加精氨酸的培养基内) →摇匀→标记→培养 →观察管内变化 注(在使用接种针的前后都要对其进行灼烧即:灭菌,且灭菌之后必须将其降温再使用, 避免烫死菌落) 对照试验 接种之前事先留出一只不加精氨酸和一只加放精氨酸的培养基, 随后不加放菌落随同接 种的菌管进行培养。 (5)培养 标记好分离菌种的代码后将菌种置于 36℃的光照培养箱内进行培养,三天后观察结果 并得出结论。

保种 为了以后生化实验对菌种的供应, 所以对各个 菌种进行保存; 转接前剔去不知菌种来源以及不能 再使用的试管菌种。操作过程: 200mLBP 培养基的制备→分装试管→接种环 及灭菌器材的包扎→灭菌(121℃,20min)→超净 工作台的准备→转接→培养(将菌种置于 36℃的 光照培养箱内进行培养) 三、尿素酶试验 1)实验原理: 有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解成二分子的氨,使得培养基呈碱性;再利用酚红作 为指示剂,来鉴定菌种的阴阳性,即:当培养基呈粉红色时证明菌种为阳性。 又尿素酶不是诱导酶,即无论底物是否有尿素的存在,细菌均能产生尿素酶;所以在培 养菌体前后加放尿素都不会影响试验结果。 补充:酚红的显色原理 酚红的显示为范围为 5.8-6.4。当 PH 为 5.8 时为酸性呈黄色,当 PH 为 6.4 时为碱呈粉 红色。 2)方法步骤
尿素酶培养基配方

配方

蛋白 胨 1g

氯化 钠 5g

葡萄 糖 1g

磷酸 二氢 钾 2g

0.4% 酚红溶 液 3mL

20%尿 素溶液 100mL

琼脂

PH

蒸馏水

用量

20g

6.8

1000mL

按照培养基配方配置 500mL 的平板培养基 ↓ 培养皿、接种器具及其他灭菌器材的包扎 ↓ 灭菌(121℃,20min) ↓

超净工作台的准备 ↓ 倒平板及培养基的冷凝 ↓ 三点式点植 (每菌种重复两个平板) ↓ 标明菌种代码及接种日期 ↓ 培养 (将平板菌种置于试验台上进行培养,三天后观察结果并鉴定) 3)鉴定过程 配置 300mL, 20%的尿素→挑选出每个菌种的平板平放于试验台面上→均匀的往每个平 板内加放尿素→静置 30min→观察结果,得出结论

平放 ↓

滴加尿素



静置

2 实验结果及讨论
2.1 试验结果
2.1.1 菌种的分离
1)从搖瓶中分离的菌种长势: 菌种在加放醋酸钠的 BP 平板培养基中生长状况明显比加放青霉素和庆大霉素的平板 好,菌体长满整个平板且没有沾染杂菌。

平板菌种的形态

在加放醋酸钠的平板内又由于样品不同菌种的长势也显然不同。 从土壤中提取的菌数要 比从叶片上提取的多。 2)平板培养菌种时出现的其他现象: 少数培养基表面颜色不一;有一个平板沾染了真菌。

菌体在分离平板内的长势

长有杂菌的平板

2.1.2 菌种的纯化
纯化后的菌种长势较好且平板内没有沾染杂菌,只是平板内非划线的部位也长有菌体。

纯化后的平板

2.1.3 菌种的鉴定
1)菌种的分离 从补救实验的补救实验中和菌粉中分离出的共 10 种菌种的代码及形态如下表所示。 菌种代码 1 2 3 4 5 中心是否带点 是 否 是 是 否 菌体周围是否有晕圈 是 是 是 是 否

注: 号菌种是从加放青霉素的 BP 平板中分离出的特定菌种。前 1-6 号共 4 个菌种是从补救实验中分离 (6 出的菌体;而 7、8、9、10 四种菌体则是从菌粉中分离出来的。

从补救实验中分离出的菌体在平板内的长势不好, 平板内有数条蠕动的蛆; 且部分平板 沾染里杂菌;只有一个平板内长有少数菌体。

分离得到的菌落

生有蛆的平板

从菌粉中分离出的菌体在梯度平板内长势不好, 出现了以下情况: 只在负二梯度的培养 基上长有少许菌落;在其他平板上没有菌体生长;有一个平板上长有杂菌-放线菌;还有一 个平板培养基浑浊。

从菌粉中长势较好的三个平板

异常的蛋黄平板

随后分离出的试管菌种没有出现异常现象;培养出的 1-6 号试管菌种表面水分较多、干 裂,7-10 号菌种表面则没有上述现象。 2)生化实验一 明胶液化实验 菌种经过穿刺接种后在试管内生长的现象为:2 号菌管(三只菌管中有一只管的底部培 养基中出现了气泡;其他两管没有异常现象)4 号菌管(三只菌管中有两只管内菌体表面有 水分且第三只没长菌;长菌的菌管内有两种形态的菌体)5 号菌管(三只试管菌种的菌体表 面有水分; 其中两只菌管内斜面体与高层之间出现朱砂色的朱砂环; 这位三只试管内也长有 两种不同的菌体)六管(三只菌管内菌体表面有水分;其中有一只管出现了朱砂圈)

出现朱砂环及 2 号菌管中的气泡 点植到平板培养基内的菌种长势:2 号平板(三个平板菌种长势很好,三点式菌落且没 有沾染任何杂菌;其中在平板壁的外围也长有一圈菌落)4 号平板(三个平板内出现了多个 菌落,没有沾染杂菌)5 号平板(三个平板中有一个平板内在点植的位置没有长菌但在其他 位置长有一个单菌落; 第二个平板内在点植位置长有三个菌落且菌体形态有两种; 第三个板 内没有出现异常现象)六号平板(三个平板中有一个平板沾染了霉菌;其他两个平板内生长 了多个菌落)

生长正常的平板

经点植后四号平板内菌体的形态

长有霉菌的平板

滴加升汞后平板内出现的现象为: 号平板 2 (培养基变为亮白色, 菌体周围无明显变化) 4 号平板(培养基变为亮白色,菌体周围有明显的透明圈)5 号平板(培养基变为亮白色, 菌体四周有较大的透明圈)六号平板(整个平板变为透明色,明胶酶吸取了大部分的明胶)

四号及六号平板内出现的透明圈

结论: 结论: 有晕圈的出现从而说明菌种产生了能使明胶液化的明胶酶 因此证明了 1-6 号菌种皆为 产生了能使明胶液化的明胶酶, 有晕圈的出现从而说明菌种产生了能使明胶液化的明胶酶, 明胶阳性。 明胶阳性。 4)保种

经过筛选保留了 11 个菌种,并对 2 号和 3 号菌种进行了转接、保存。
5)生化实验二 精氨酸脱羧酶试验 培养三天的试管里只有 6 号管培养基呈黄色,其他无明显变化仍然呈紫红色。

阴阳性菌管的对比

试管内培养基颜色的变化

结论: 结论: 根据溴甲酚紫的显色范围可知, 时呈黄色、 根据溴甲酚紫的显色范围可知,当 PH 为 5.2 时呈黄色、PH 为 6.8 时呈紫红色得知六 六号菌种产生了精氨酸脱羧酶, 号管菌管培养基的 PH 值已大于 6.8;因此六号菌种产生了精氨酸脱羧酶,为阳性。 ;因此六号菌种产生了精氨酸脱羧酶 为阳性。 再次加放菌落培养后三号、四号菌管虽有颜色的变化,但由于三号、四号菌管在培养前 后加放的菌种不一致所以试验结果作废。其他菌管没有明显变化。

作废的三号机四号菌管

结论: 结论: 再次接种培养后唯一变色的两个菌种因为前后培养的菌种不同, 再次接种培养后唯一变色的两个菌种因为前后培养的菌种不同,因此无法证明任何一 个菌种的阴阳性。 个菌种的阴阳性 6)生化实验三 尿素酶试验 1 号、4 号和 7 号平板沾染了杂菌,其他平板菌种生长良好。

生长正常的平板

长有霉菌的平板

滴加尿素后平板内的变化如图所示:

滴加尿素后平板内的变化

阴、阳性菌种平板的对比

结论: 结论: 从现象中看出从菌粉中分离出的菌种平板培养基呈现了粉红色, 从现象中看出从菌粉中分离出的菌种平板培养基呈现了粉红色,从而得知菌种产生的 菌种平板培养基呈现了粉红色 尿素酶分解了尿素 尿素被分解为氨使得培养基成了碱性 碱性的环境又使酚红呈粉红色。 分解了尿素, 培养基成了碱性, 尿素酶分解了尿素,尿素被分解为氨使得培养基成了碱性,碱性的环境又使酚红呈粉红色。 证明出了,该菌落是阳性。 证明出了,该菌落是阳性。

2.2 讨论及分析
2.2.1 菌种的分离
1)为什么菌体在不同平板培养基内的长势不同? 分析: 可能是由于醋酸钠的抑菌效果要比青霉素和庆大霉素的抑菌效果差; 或者是由于庆大霉 素和青霉素在培养基内加放浓度的因素。 土壤内微生物的含量要比叶片中微生物的多, 或者可能是由于采集的树叶叶片处于阳光 照射强度较高的部分,所以会出现从土壤中提取的菌体数要比从树叶中提取的多。 2)为什么培养基表面颜色不均匀? 分析: 可能是由于培养在倒平板时分布不均匀造成的。 3)培养基沾染杂菌的原因是什么? 分析: 可能是因为无菌操作的不规范性、 灭菌器材灭菌不彻底或者是由于外界环境中的灰尘落 入平板内…… 4)蛋黄培养基平板出现的原因是什么?

分析: 目前没有分析出导致浑浊培养基的原因。

2.2.2 菌种的纯化
为什么菌体在平板培养基内非划线的部位也有生 长? 分析: 可能是灭完菌的培养皿内水蒸气冷凝成流动水 所造成的,或者是由于操作者的不规范操作。

2.2.3 菌种的鉴定
1)为什么平板内会有蠕动的蛆?

长有蛆的平板

分析: 在其他分离的五种菌体的平板内也长有蛆的原因可能是分离白僵菌平板内的虫体蠕动 到里面;或者由于管理不善造成环境的恶劣引来蝇在平板内释放虫卵造成的。 2)为什么大部分平板沾染了放线菌? 分析:

观察平板内放线菌的长势及分布不难发现,是由于操作者的不规范操作所造成的后果。 3)在分离菌种进行培养后,为何菌体在梯度平板内生长一直都不好? 分析: 经过多次失败试验的探讨, 确定菌体生长不好的缘由为: 徒步接种时涂布棒在灭菌后没 有将温度降至适宜温度,使得温度过高烫死了菌体。 4) 明胶酶液化实验中进行穿刺接种后个别菌管出现朱砂环 的原因是什么? 分析: 可能是由于生锈的接种环在经穿刺时,铁锈沾到了培 养基上并扩散的结果。 5)精氨酸脱羧酶实验中为什么大部分菌管没有显黄色?

未变色的培养基

分析: 可能是由于培养基内加放的菌量过少,或者是由于菌种除 6 号外皆为阴性。

3 实验中出现的异常现象及补救措施
3.1 菌种分离
从土壤中分离出的菌种在加放醋酸钠的平板培养基中培养三天后发现: 菌种长满整个平 板,所以再重新取相应的土壤浸出液进行菌种分离。操作流程如下: 制作 BP 培养基 500mL→配置 90mL 的生理盐水→准备平板 25 个、 试管 18 个及需要灭 菌的工具→灭菌→超净工作台的准备→倒平板 (至少 24 个) →平板培养基的冷凝→取样 (长

势较好的菌体相应的土样 2 个) →梯度稀释 (利用生理盐水制备出负 4 至负 9 梯度的稀释液) →徒步、接种(每个梯度重复两个平板)→培养(置于 36℃的光照培养箱内进行培养)→ 三天后观察结果 异常现象及分析 菌体在各梯度平板内生长的形态、大小不一,且在同一平板内菌体分布不均。

分布不均及形态不一的菌体

分析: 菌体形态不一是因为菌种种类的不同; 菌体大小不一则是由于菌体生长时利用的营养不 同(即:培养基在平板内分布不均) ,或者是由于徒步接种时没有涂均匀;

3.2 青霉素、庆大霉素浓度梯度测试
针对可能由于加放在平板培养基内青霉素、 庆大霉素的浓度不适宜才造成菌体生长不好 的问题,做一次测试,试找出适宜菌体生长的浓度。操作流程如下: 制作 BP 培养基 7500mL→配置 100mL 的生理盐水→准备 70 个平板及需要灭菌的工具 →灭菌→超净工作台的准备→往灭菌的空皿内按一定的浓度梯度加放青霉素和庆大霉素 (青 霉素和庆大霉素加放量梯度依次为 0mL;0.2mL;0.4mL;0.6mL;0.8mL;1.0mL;1.2mL; 1.4mL;1.6mL 共计九个)→倾倒培养基(待培养基稍冷后倾倒以免温度过高会影响青霉素 和庆大霉素的药性)→摇匀→平板培养基的冷凝→培养(置于 36℃的光照培养箱内进行培 养)→三天后观察结果 异常现象及分析 在加放庆大霉素的梯度平板中没有菌体生长而在加放青霉素的梯度平板内菌种长势欠 佳;菌体在加放青霉素的梯度平板内生长的菌体形态、大小不一,在同一平板内菌体分布不 均且在个别平板内长有杂菌—放线菌。

分析: 菌体形态不一是因为菌种种类的不同; 菌体大小不一则是由于菌体生长时利用的营养不 同(即:培养基在平板内分布不均) ,或者是由于徒步接种时没有涂均匀;长有杂菌可能是 在倒平板时或在徒步时有杂菌趁机滋生。

3.3 生化实验
在明胶液化实验中利用 4、5 号菌种进行穿刺接种和点植时发现,有新的菌种生长,说 明菌种不纯;所以又在做完明胶液化实验后进行了纯化,保留了 9 只试管。

保钟后的试管菌种

在验证精氨酸脱羧酶试验时, 第一次接种培养三天后只有六号菌管变为了黄色, 初步怀 疑是菌体太少造成的。 因此再次在无菌环境下加放一次菌体, 再培养三天观察结果并得出了 结论。

4 参考文献
[1]林群新,张群林,张灵玲,洪金田,吴小凤,关雄.从植物中分离苏云金芽孢杆菌的 研究;福建农林大学生命科学学院;2008-7 [2]罗兰,谢丙炎,袁忠林,杨之为;我国土壤中苏云金芽孢杆菌的分离与基因型的鉴 定;应用与环境生物学报 2005-11-6 [3]王立,刘利檬,张思雅;土壤中苏云金芽孢杆菌的分离纯化与初步鉴定;哈药集团 生物工程有限公司 2011-07 [4] 李凤梅 ,李平 ,闫敏 ,郑爱萍 ,孙惠青;苏云金芽孢杆菌的筛选和初步鉴定;四川省 农业生物技术工程研究中心;2003-12


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