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黑曲霉产柠檬酸菌种最优发酵条件探究


第 7卷   6期 第

实验科学与技术

?147?

? 大学生实验园地 ?

黑曲霉产柠檬酸菌种最优发酵条件探究
胡恺夫 , 赵   , 张理珉 伟
(云南大学生命科学学院 , 昆明  650091)

摘要 : 结合发酵工程实验教学改革 , 将实验室收集

保存的产柠檬酸菌株 11 株 , 进行初筛 、复筛后 , 选取产酸量相对较高的 2 112 菌株进行了正交实验 、稳定性实验 。得到的较好发酵条件为 : 玉米淀粉 16 , ( NH4 ) 2 SO4 011 , 麸皮 016 , pH 410, 发酵温度 35 ℃, 发酵时间 96 h。经 5 次稳定性实验 , 该菌株产酸率最高达 9192 , 已能满足实验教学的需要 , 为开 展柠檬酸发酵系列实验提供了保证 。 关     : 柠檬酸 ; 发酵 ; 分离纯化 ; 正交实验 键 词 中图分类号 : O62    文献标识码 : B    文章编号 : 1672 - 4550 ( 2009 ) 06 - 0147 - 03

Research on the O pti iza tion of Fermen ta tion Cond ition s of m A sperg illus N iger C itr ic - ac id - produc i g Stra i s n n
(Departm ent of L ife Sciences, Yunnan University, Kunm ing 650091, China)

的一种有机酸 , 学名为 3 - 羟基 3 - 羧基戊二酸 。 柠檬酸具有令人愉快的酸味 , 它入口爽快 , 无后酸 味 , 安全无毒 , 是发酵法生产的最重要有机酸 , 广 泛应用于食品 、化工 、医药 、日化 、纺织 、电子 、 建筑 、铸造等行业 。结合学院生物技术专业确定的 发酵工程专业系统实验教学体系 , 开展以柠檬酸好 氧发酵产生菌的分离 、纯化 、初筛 、产物定性 、定 量测定 , 产酸条件研究 , 发酵生产柠檬酸 , 柠檬酸 的提取以及提取产物的纯度测定等内容的综合实 验 。在该综合实验中 , 筛选和探索产柠檬酸的黑曲 霉发酵菌株的性能显得尤为重要 。

收稿日期 : 2008 - 07 - 11; 修改日期 : 2009 - 06 - 13 基金项 目 : 教 育 部 高 等 理 工 教 育 教 学 改 革 与 实 践 项 目 [ 239 ] , 云南大学实验室建设项目 。 作者简介 : 胡恺夫 ( 1986 - ) , 男 , 本科在读 , 专业方向 : 生物学 。

Abstract: Based on the teaching needs of fermentation engineering experim ents, 11 citric 2acid 2 roducing strains are collected and p Key words: citric acid; fermentation; purification; orthogonal experim ent

p reserved1 After p rim ary and secondary screenings, a highly citric 2acid 2 roducing strain 2 112 is selected and conducted w ith orthogo2 p nal experim ents and stability experim ents1 The findings show that the best fermentation condition is: corn starch ( 16 ) , ( NH4 ) 2 SO4 citric 2acid2 roducing rate of the strain reached 9 - 92, which comp letely meets the need of the instructions and ensures the p rogress of p

1    引 言

the serial citric 2acid fermentation experim ents1

( 011 ) , bran ( 016 ) , pH ( 410 ) , temperature: 35 ℃ and ti e: 96h1. According to the results of the five stable experim ents, the m

柠檬酸又名枸橼酸 , 它是存在于柠檬等水果中

HU Kai2fu, ZHAO W ei, ZHANG L i2 in m

2  材料与方法

实验室分离 、收集 、保藏的产柠檬酸黑曲霉菌 株 11 株 。 212   培养基 21211   种子培养基 (麸曲种 ) 用玉米淀粉 15 、蔗糖 18 、葡萄糖 18 在 ( NH4 ) 2 SO4 013 , 麸皮 012 , pH 410 的条件下 , 配制成 3 种不同碳源和浓度的发酵培养基 。 213   实验方法 初筛 、复筛过程分别以玉米淀粉 、蔗糖 、葡萄 糖三种不同碳源进行实验 , 得到发酵效果较好的培
21311   菌种初筛 、复筛

在 100 mL 三角瓶中加入麦麸 6 g、秸秆 4 g、 (NH4 ) 2 SO4 011 g混匀后加 10 mL 水 , 拌匀 、灭菌 、 冷却后接入斜面菌种 , 30 ℃ 培养 7 d 制成麸曲种 。 每瓶加入 50 mL 无菌水充分打匀制成孢子悬液 。 21212   初筛发酵培养基

211   菌株

?1 4 8 ?

实验科学与技术

2009 年 12 月

养基为淀粉水解糖培养基 , 并从实验室保存的 11 株菌种中筛选到产酸率较高的一个菌株 。 21312   正交实验 以培养基成分 、接种方式 、 pH 等为因素 , 选 择各因素的相应水平 , 设计正交实验表 , 进行多次 正交实验以探索菌种产酸的最优条件 。 31313   发酵稳定性实验 对获得的菌种及其最优发酵条件进行多次发酵 实验 。 31314   产酸量测定
菌    株 蔗糖
3019 0125 0115 1134 3024 0120 0122 2137 CHO - 1 CHO - 2 0113 0124 0191 0121 0113 1106 mL 1 2

3  结果与分析
初筛结果如表 1 所示 。从初筛 、复筛结果看 出 , 实验室保藏的 11 株产柠檬酸菌种在玉米淀粉 水解糖培养基中的产酸量均高于葡萄糖和蔗糖的 , 选取产酸率较高的 2112 菌株为正交实验用菌种 。 312   正交实验 在初筛 、复筛的基础上 , 选择以培养基配方为 正交实验的因素 , 以其在培养基中的含量多少为考 虑的水平数 , 进行正交表的设计 。
1-2 0123 0142 0134 1-3 0127 0143 0149 2-1 0130 0146 0165 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 013 012 011 2-2 0134 0149 0135 2-3 0119 0133 0141 2112 0134 0124 2177

实验结果分析如表 3 所示 。

淀粉 20

液接种 , 产酸量达 3180 了第 2 次正交实验 。 结果分析如表 5 所示 。 酸量达 8158
31212   2 次正交实验 第

发酵时间 96 h。本次正交实验对于 2 112 菌株来 说 , 最优 、最佳组合为 A3 B3 C2 D1 。且本次实验产
, 已经满足实验教学的需要 。

用 01142 9 N NaOH 滴定 , 每消耗 1 mL 01142 9 N NaOH 溶液为 1 酸量 。
葡萄糖 玉米淀粉

表 1  菌株初筛实验结果
1-1 0119 0143 0185

31211   初步正交实验
水平
1 2 3 A 淀粉 /( ) 20 16 12

第 1 次正交实验培养基因素水平如表 2 所示 ,

表 2   1 次正交实验培养基 L9 ( 34 )的因素水平表 第
B (NH4 ) 2 SO4 /( ) 014 013 012 C 麸皮 /( ) 012 014 016

D 接种量 /

孢子接种

   发酵条件为 : 往复式摇瓶机 (振幅 8 cm , 频率 110 次 /m in ) , pH 410, 发酵温度 35 ℃, 发酵时间
96 h。分析可以得到 , 本次正交实验的最优组合为 , 硫酸铵 012 , 麸皮 016 , 2 mL 孢子

。在此基础上我们进行

第 2 次正交实验培养基因素水平如表 4 所示 ,

发酵条件为 : 往复式摇瓶机 (振幅 8 cm , 频率 110 次 /m in ) , 2 mL 孢子液接种 , 发酵温度 35 ℃,

311   菌株的初筛 、复筛
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R

表 3   1 次正交实验结果分析 第
D 1 2 3 3 1 2 2 3 1

2112 产酸量 / ( ) 1156 0187 3180 0176 0176 0199 1129 1101 1198

表 4   2 次正交实验 2112 培养基 L9 ( 34 )的因素水平表 第
A 淀粉 /( ) 22 19 16 B (NH4 ) 2 SO4 /( )

水平
1 2 3

6123 2151 4128 2108 0184 1143 1124

3161 2164 6177 1120 0188 2126 1146

3156 3161 5185 1119 1120 1195 0176

4130 3115 5157 1143 1105 1186 0186

A1 B3 C3 D3

RB > RA > RD > RC

麸皮
016 014 012

pH

/( )

315 410 415

第 7卷   6期 第

Experim ent Science & Technology

?149?

表 5   2 次正交实验 2112 结果及极差分析 第 实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 6153 7191 1213 2118 2164 4110 1192 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 3187 6177 1611 1129 2126 5137 4108 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 6176 8166 2125 3177 2189 1152 D 1 2 3 3 1 2 2 3 1 12176 6123 7175 4125 2108 2158 2117

表 6  2112 发酵稳定性实验结果 实验号 产酸量 / ( ) 第 1次
8189

产酸量 ( )
1106 1137 4110 1137 3112 3142 1144 2128 8158

第 2次
8171

第 3次
9108

第 4次
8153

第 5次
9192

4    结 论

1 ) 确定了摇瓶发酵的最佳培养基为 : 玉米淀

对正交实验确定的最优培养基和培养条件进行 多次发酵实验 , 结果见表 6。
(上接第 118 页 )

真 、仔细的剖析 , 提出改进措施 。报告应文理通 顺 、字迹清楚 、图文并茂 。为防止实习报告出现相 互抄袭和不认真的现象 , 在平时实习过程中应每天 抽查学生的实习日志 。在专题性报告中 , 学生可选 一个自己感兴趣的内容进行论述 , 大部分学生则选 择了对电视机故障检修展开论述 。详细阐述了自己 对电视机各部分电路的工作原理的理解 , 对电视机 常见故障原因也作了彻底的分析 。对于维修电视机 过程中自己的心得体会 , 很多学生都作了详细的说 明 。有少部分学生 , 围绕像长虹这样的现代化大企 业的生产管理模式 、生产方式展开论述 , 写出了自 己的理解 、看法和合理化建议 。

电子信息科学与技术专业的生产实习是全面贯 彻素质教育和教书育人的重要内容 , 要提高实习质 量 , 必须从学校配备的经费 、选择实习地点 、配备

313   发酵稳定性实验

4  结束语

11132

A3 B3 C2 D1

RB > RD > RA > RC

粉 16 , ( NH4 ) 2 SO4 011 , 麸 皮 016 , pH 410。最佳培养条件为 : 2 mL 孢子液接种 , 发酵温 度 35 ℃, 发酵时间 96 h, 往复式摇瓶机 (振幅 8 cm , 震荡频率 110 次 /m in ) 。经 5 次发酵 稳定 实 验 , 最高产酸量达 9192 , 已经满足实验教学要 求。 2 ) 通过正交实验的发酵条件优化 , 菌株的产 酸量比初筛提高了 216 倍 。
551 - 981

参考文献

指导教师 、接待实习单位的技术含量 、实习的相关 要求与考核等各个环节都要有所保证 , 任何环节薄 弱都将影响整个实习的质量 。因此 , 建立一套比较 实用的生产实习措施 、指导方案和考核体系是非常 必要的 。 参考文献

[1]  汪多仁 1 柠檬酸的国外市场动态和我们的对策 [ J ] 1 [2]  石忆湘 , 刘祖同 1 黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸 [3]  王风琴 1 提高柠檬酸生产菌产酸的措施 [ J ] 1 中国调 [4]  李一婧 1曲酸生产菌种的筛选和发酵工艺条件的优 [1 ]  张珩 , 杨艺虹 , 刘永琼 , 等 1 工科大学生毕业实习 [2]  张兴法 , 徐超 , 韩效钊 1 工科院校毕业实习的研究 [3 ]  宣益民 , 李强 , 刘心志 , 等 1 改革毕业实习方式的 [4]  俞宏 1 关于提到本科生毕业实习质量的思考 [ J ] 1 山

工程能力培养实践 [ J ] 1 化工高等教育 , 2003 ( 2 ) : 96 探讨 [ J ] 1 南 京 理 工 大 学 学 报 : 哲 学 社 会 科 学 版 , 1997 ( 4 ) : 54 - 551 东理工大学学报 : 社会科学版 , 2003 ( 3 ) : 106 - 1081 与实践 [ J ] 1 合肥工业大学学报 : 社会科学版 , 2003 ( 1 ) : 100 - 1021

中国食品用化学品 , 1999 ( 1 ) : 1 - 61 味食品 , 1998, 1 ( 1 ) : 19 - 201

化 [ J ] 1 中国酿造 , 2006 (6) : 42 - 441

[ J ]1 清华大学学报 : 自然科学版 , 1998, 28 ( 6 ) : 52 -


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