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采用16SrDNA鉴定甜瓜细菌性叶斑病菌


              研究报告

  33 卷第 3 期 ( 2007) 第

PL AN T PRO TECTION   Vol. 33 No . 3 (2007)

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采用 16S rDNA 鉴定甜瓜细菌性叶斑病菌
( 1. 甘肃农业大学草业学院 , 兰州   7300

70 ;   甘肃省植保植检总站 , 兰州   2. 730030)

摘要   从甘肃河西 、 新疆阿勒泰甜瓜上分离获得的 2 株致病细菌 ,通过 16S rDNA 序列测定以及序列同源性比较 , 结合病原菌落培养性状 、 菌体形态观察和革兰氏染色反应等 ,初步确定当地甜瓜细菌性叶斑病菌为丁香假单胞杆菌
[ Pseu domonas s y ri n gae pv. l achry m ans ( Smit h et Bryan) Young et al . ]

关键词   细菌性叶斑病 ;   致病性测定 ;   16S rDNA 鉴定 中图分类号  S 436. 421. 69

Identif ication of the pathogen of bacterial spot of cucurbits leaves based on 16S rD NA sequences
Li Yali1 ,   Yingchun2 ,  Pu Chongjian2 ,  Yang Chengde1 ,   Jia Chen Xiurong1
( 1 . Col le ge of Prat acult ural S cience , Gans u A g ricult u ral U ni versit y , L anz hou   730070 , Chi na;

2 . Pl ant P rotection an d Qua ranti ne S t ation of Gans u , L anz hou   730070 , Chi na)

   近年来 ,甜瓜细菌性叶斑病在新疆发生严重 ,发 病率在 30 %以上 ,严重的达 100 % ,致使商品瓜产量 减少 ,甚至大面积绝收 ,为北疆产瓜区及东疆多雨年 份商品甜瓜生产的主要病害[ 1 ] 。据 2004 - 2005 年 调查 ,在甘肃省河西地区的西瓜 、 甜瓜地中有零星发 生 ,由于该病症状与西瓜细菌性果斑病在叶片上的 症状很相似 [ 2 - 3 ] ,认为可能是西瓜细菌性果斑病 , 因 此 ,笔者于 2004 - 2005 年采集了甘肃和新疆主要瓜 产区的病叶及病瓜进行了致病性测定和病原鉴定 , 以便明确甘肃和新疆发生普遍的甜瓜细菌性病害是 细菌性果斑病还是细菌性叶斑病 , 为综合防治提供 依据 ,现将病原鉴定的结果报道如下 。

1  材料和方法

1. 1   标样采集时间和地点

高台县 、 金塔县和新疆阿勒泰地区甜瓜生长季节 ,采 集类似于西瓜果斑病症状的叶片和果实 , 并描述症
收稿日期 :   2007 - 01 - 09 基金项目 :   甘肃省科技厅攻关项目 (2CS042 - B41 - 011) 3 通讯作者 E2mail :chenxiurong @gsau. edu. cn

ined using 16S rDNA gene sequences. The results showed that the pathogens might be Pseudomonas sy ringae pv. lachry 2
mans ( Smith et Bryan) Young et al . , based on their culture patterns , morphological characteristics and staining reactions.

2004 年 7 月至 2005 年 9 月 , 在甘肃省张掖市 、

Abstract  Two strains of pathogenic bacteria were isolated in Hexi in Gansu and Aletai in Xinjiang. The strains were exam2 Key words   bacterial leave spot ;   hogenicity ;   pat identificatio n based o n 16S rDNA

李亚利1 ,   贾迎春2 ,   蒲崇建2 ,   杨成德1 ,   陈秀蓉1 3
1. 2   分离培养

状 ; 在兰州瓜果市场上收集来自靖远县 、 敦煌市 、 安 西县 、 新疆哈密等地的腐烂病瓜 ,同时收集了病甜瓜 内的种子 ( 甘肃民勤和新疆昌吉) 作为标本备用 。 将采集到的病叶 、 病果以及种子 , 采用划线法 , 接种于 KB 培养基 ( 1. 5 g MgSO4 ?7 H2 O , 1. 5 g K2 H PO4 ,10 g 甘油 ,20 g 蛋白胨 ,20 g 琼脂 , 定容至 1 000 mL ,调 p H 为 7. 2) 上分离培养 ,获得的多个菌 株分别纯化后[ 5 ] ,经致病性测定 ,在具有致病性的菌 株中挑选出了 2 个代表菌株 , 分别编号为 Ps1 、 , Ps2 以西瓜细菌性果斑病燕麦食酸 菌西 瓜亚 种 ( A ci 2 dovora x avenae subsp . ci t rul l i Willems et al ) 的标 准菌株 ( 南京农业大学植物病理学实验室提供) 为对 照 ,进行病原鉴定 。
1. 3   病原鉴定 1. 3. 1   病原形态特性及革兰氏染色反应

将 Ps1 和 Ps2 接种于 KB 培养基上培养 24 h ,

观察菌落形状 、 大小 、 质地并通过革兰氏染色 , 观察

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染色反应 、 菌体形态 , 测定菌体大小[ 4 ] , 同时观察该 菌对氧气的要求以及适宜生长温度等 。
1. 3. 2   16S rDNA 分子鉴定 1. 3. 2. 1   引物设计

gov/ blast . cgi ) ,并采用 Clustal ( 1. 8 ) 软件进行多重

序列比较 ,再用 Mega ( 3. 0 ) 软件中的邻接法构建系 统发育树 ,确定各菌株的系统发育学地位 。

根据 16S rDNA 两端的保守序列 , 设计 1 对细 菌的通用引物 , 送上海生物技术公司合成 。引物 1 序列 : 5’ CC G GA T CCA GA G T T T GA T CA T GGC TCA GCA - 3’引物 2 序列 : 5’ C GG GA T ; CC T AC G GC T ACC T T G T TA C GA C T T - 3’ 。 1. 3. 2. 2   菌株 DNA 的提取

2  结果与分析
2. 1   症状 2004 - 2005 年在甜瓜生长季节观察 , 病菌主要

危害叶片 ,也可危害果实和茎蔓 。在子叶上形成圆 形或不规则形的浅黄褐色 、 半透明点状病斑 。真叶 发病 ,叶片呈水渍状小点 , 随后逐渐扩大 , 受叶脉限 制呈多角形或不规则形 。后期病叶干枯 , 呈现黄褐 色 ,病斑脆弱 , 易干裂脱落 。病叶背面不易见菌脓 。 茎、 果实的病斑初期呈水渍状凹陷 ,带有大量细菌粘 液 。果实表面病斑处易溃烂 , 龟裂口并向内扩展使 种子染菌 。
2. 2   菌株形态特征

在 2 mL 的离心管中加入 1 mL 无菌水 ,将纯化 好的单 菌 落 直 接 加 入 1 mL 无 菌 水 中 , 13 000 r
/ min ,离心 10 min ,去上清液 , 将收集的菌体沉淀重

悬于 1. 0 mL 的 NaCl ( 0. 85 mol/ L NaCl ) 中 ,4 ℃,
13 000 r/ min ,离心 5 min 。采用传统法
[5 ]

: 细菌沉

淀中加入 T E 567 μL 重悬 ,加入 10 %SDS 30 μL 和 20 mg/ mL 蛋白酶 K 3 μ , 于 37 ℃温育 1 h , 加入 L
5 mol/ L NaCl 100 μL ,C TAB/ NaCl 溶液 80 μ , 于 L 65 ℃ 温育 10 min , 加入等体积的氯仿/ 异戊醇 , 混

通过培养性状 、 染色反应以及生理特性的测定 , 各菌株形态特征如下 。
Ps1 : 菌落中型 , 乳白色 ,圆形或近圆形 , 平铺 , 表

匀 ,离心 5 min ,上清液转入 1 支 1. 5 mL 新管中并 加等体积的酚/ 氯仿/ 异戊醇 ,混匀 ,离心 5 min ,上清 液再转入 1 支 1. 5 mL 离心管中 ,加入 0. 6 倍体积异 丙醇 ,轻轻混合 ,离心 5 min ,弃上清 ,加入 70 %乙醇 洗涤 1 min ,离心 ,弃上清 ,将白色沉淀的 DNA 溶于 60 μL 的 T E 中 , - 20 ℃ 保存备用 。
1. 3. 2. 3  PCR 扩增

面光滑 ,半透明 ,有光泽 ,边缘整齐 ,质地较软 ,生长较 快 ,菌体杆状 , ( 1. 0 ~2. 7 ) μm ×( 0. 4 ~ 0. 6 ) μm , 革 兰氏染色阴性 ,好氧 ,在 30 ℃ 生长良好 。
Ps2 : 菌落中至大型 ,灰白色至乳白色 ,菌落圆形

或梭形 ,近圆形 ,平铺 ,边缘不整齐 ,表面光滑 ,质地较 软 ,生长较快 ,菌体杆状 , ( 1. 0 ~ 2. 4 ) μm ×( 0. 4 ~
0. 5 ) μm , 革 兰 氏 染 色 阴 性 , 好 氧 , 在 30 ℃生 长

根据预试验结果优化后 , 选出扩增条件 : 94 ℃ 预变性 5 min ;94 ℃ 变性 10 s ,54 ℃ 退火 20 s ,68 ℃ 延伸 40 s ,35 个循环 ; 最后在 68 ℃ 下延伸 7 min ,终 止反应 。 建立反应体系 : 10 ×buffer ( 含 MgCl 2 ) 5 μL ,
dN TP ( 2. 5 mmol/ L ) 0. 5 μL , p rimer 1 ( 10 μmol/ L ) 1 μL , p rimer 2 ( 10 μmol/ L ) 1 μ , Taq p roly2 L merase ( 2 U/μ ) 1 μ , Target DNA ( 10 ng/μL ) L L 1 μ , dd H2 O 40. 5 μL , 总体积为 50 μ 。 L L

良好 。 西瓜果斑病菌 ( 标准菌 ) : 菌落小型 , 乳白色 , 菌 落圆形或近圆形 ,稍隆起 ,有光泽 ,边缘透明 ,表面光 滑 ,边缘不整齐 , 质地较软 , 生长 较慢 , 菌 体杆 状 , ( 1. 4~3. 6) μm ×( 0. 4 ~ 0. 9 ) μm , 革兰氏染色阴 性 ,好氧 。
2. 3   细菌基因组 D NA 提取

提取的 Ps1 、 和标准菌株的基因组 DNA ,在 Ps2
1. 0 %琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 检 测 结 果 表 明 , 提 取 的 DNA 片断约在 2. 0 kb 以上 ,可满足获得 16S rDNA

扩增后取 7 μL PCR 反应产物在 1. 0 %的琼脂

糖凝胶电泳 40 min 后 , 置紫外透射仪下观察 DNA 特异性条带 。
1. 3. 2. 4   序列测定

的约1 500 bp 的要求 。同时与系列稀释的λ DNA 为 参照 的 电 泳 结 果 分 析 , 提 取 的 粗 制 DNA 浓 度 约 50 ng/μL ,即获得浓度较高并且纯度较好的细菌基 因组 DNA 。
2. 4  PCR 产物检测

将 PCR 产物送至上海 ( Sango n ) 生物技术公司

测序 ,将获得的序列与 GenBank 数据库中已报道的 序列进行同源性比较 ( ht tp : ∥www . ncbi. nlm. nih

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果表明 , 基

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因组 DNA 中 扩 增 出 16S rDNA 核 苷 酸 片 断 与
DL2000Mark 比较 , 约 在 1 500 bp 处 有 一 明 亮 的 PCR 特征性条带 , 其分子量大小与菌株 16S rDNA

一致 。而且从系统发育树可以看出 : Ps1 与 Ps2 本 身的亲缘关系非常接近 , 同源性高达 99. 7 % , 由此 可以确定 Ps1 、 为同一个种的不同株系 。 Ps2

的理论值基本相符 ( 图 1) 。

图2  甜瓜细菌性叶斑病菌 Ps1 、 与 Ps2 标准菌株系统发育学地位

3  讨论
张昕 、 孙福在等报道的甜瓜细菌性斑点病病原 为丁香 假 单 胞 菌 黄 瓜 致 病 变 种 ( P. s y ri ngae pv.
l achry m ans)
图1  甜瓜细菌性叶斑病菌 Ps1 、 、 Ps2 标准菌株 PCR 产物电泳图
[ 9 - 11 ]

, 而贠淑芬 、 王宏平等报道甜瓜细

菌性叶斑病的病原为油菜黄单胞菌黄瓜致病变种 ( X ant homonas cam pest ris pv. cucurbit ae ( Bryan
1926 ) ,Dye 1978 ) [ 6 - 8 ] 。可见甜瓜细菌性叶斑病可

2. 5  菌株 16S rD NA 序 列 测 定 结 果 与 系 统 发 育

分析    PCR 产物送往上海生物技术公司测序 , 测出 将 的 Ps1 、 和标准菌株的 16S rDNA 基因序列分别 Ps2 为 1 459 bp 、 463 bp 、 448 bp ,其序列分别见图 2 。 1 1 通过 Internet 网 ( ht tp : ∥www. ncbi. nlm. nih gov/
blast . cgi ) ,用 BL A S T 软件将 Ps1 、 和标准菌株 Ps2

由多种细菌引起 ,因此在新疆等地以哪种细菌为主 或混合发生或在甜瓜的生育期各细菌出现的高峰 期以及各病原细菌间的关系等 , 还需要进行深入 研究 。 笔者在甘肃 、 新疆收集到的病叶 、 病瓜 , 通过分 离纯化后得到的多个纯菌种 , 用 16S rDNA 技术鉴 定未发现西瓜细菌性果斑病菌 , 多数是腐生菌 。另 外 ,对生产中疑为染有果斑病的甜瓜中采集的种子 , 用 PCR 技术检测 ,也均未检测到与西瓜细菌性果斑 病菌相同的特异性条带 。初步表明 2004 - 2005 年 在甘肃瓜类主产区几乎未发生西瓜细菌性果斑病 。 另外 ,笔者从甜瓜叶斑病上分离到的 2 种致病细菌 , 通过对 16S rDNA 序列分析与 P. s y ri n g ae 的 16S
rDNA 序列同源性到达 99 % 。因此 , 初步确定为丁 香假单胞杆菌 [ Pseu domonas s y ri n g ae ( Van Hall ) ]

的 16S rDNA 序列与 GenBank 中同源序列进行比 较 。结果表明 Ps1 菌株和 Ps2 菌株与已报道的丁香 假单胞菌具有很高的同源性 , Ps1 和 Ps2 菌株均与
A F094749 ( Pseu dom onas s y ri n g ae ) 的序列同源性

达 99 % ; 标准菌株与已报道的燕麦食酸菌西瓜亚种 具有高 度的 同源 性 , 即与 A F137505 ( A ci dovora x
avenae subsp . ci t rul l i ) 的序列同源性达 99 % 。将

相似序列用 Clustal ( 1. 8 ) 软件进行多重序列比较 后 ,再用 Mega ( 3. 0 ) 软件邻接法构建了系统发育树
( 图 2 ) ,结果表明 : 测定的 3 个菌株与其相似序列可

聚为 2 大类 , Ps1 与 Ps2 都与 A F094749 ( P. s y ri n2
g ae) 聚在一起 , 说明 Ps1 和 Ps2 与 A F094749 ( P. s y ri n g ae) 相似性最高 , 亲缘关系最近 , 同源性高达

99 % , 初 步 确 立 Ps1 、 Ps2 为 P. s y ri n g ae ( Van Hall ) 的 两 个 菌 株 。标 准 菌 株 与 A F137505 ( A .
avenae subsp . ci t rul l i ) 聚 在 一 起 , 其 同 源 性 为

的燕麦食酸菌西瓜亚种 ( A . avenae subsp . ci t rul li)

99 % ,说明标准菌株与 A F137505 ( A . avenae sub2 sp . ci t rul l i) 的亲缘关系最近 , 即标准菌株与已报道

中的 2 个菌株 。由于丁香假单胞杆菌包含 1 个亚种 和 41 个致病变种 [ 12 ] , 主要根据寄主范围和症状表 现的差异来确定 。本研究中的另一部分工作 , 即这 2 个菌株的致病性和寄主范围的测定已发表 [ 13 ] , 因 此 , 根 据 在 寄 主 范 围 和 症 状 表 现 确 定 为 Pseu do2 monas s y ri n g ae p v. l ach r y m ans ( Smit h et Bryan 1915) Yo ung et al . 1978 。

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腐食酪螨实验种群生命表
刘   1 ,2 ,   婷 金道超1 3 ,   郭建军1
Liu Ting1 ,2 ,   Daochao 1 ,  Guo Jianjun1 Jin

( 1. 贵州大学昆虫研究所 , 贵阳   550025 ;   皖南医学院寄生虫学教研室 , 芜湖   2. 241001)

摘要   研究了腐食酪螨在 5 个温度梯度下的实验种群生命表 。结果表明 ,在 12. 5 ℃ 30 ℃ ,该种群的瞬时增长 和 时 力和周限增长率均较小 ,分别为 0. 055 6 、 057 2 和 0. 056 8 、 058 5 。说明温度过低或过高 ,均不利于该螨的发育 1. 1. 繁殖 。20 ℃ 虽然世代净生殖率最高 ,但由于产卵时间较长 ,平均日产卵量较少 ,瞬时增长力也较小 。25 ℃ ,该种 时 群的存活率最高 ( 0. 729 2) ,瞬时增长力和周限增长率最大 ( 0. 263 8 和 1. 301 9) ,日均产卵量最多 ,达 21. 87 粒 。 关键词   腐食酪螨 ;   实验种群 ;   生命表 中图分类号  S 433. 7

Laboratory population l ife table of Ty r op ha gus p ut resce nti ae at different temperatures
( 1 . I nstit ute of Entomolog y , Gui z hou U ni versit y , Gui y an g   550025 , Chi na;

2 . De p art ment of Pa rasitolog y , W annan Me dical Col le ge , W uhu   241001 , Chi na)

) tion rate ( R0 ) , finite rate of increase (λ , doubling time for pop ulation ( t) , int rinsic rate for nat ural increase ( rm )

and mean generation time ( T) were st udied under five constant temperat ures. The result s showed t hat λand rm were 0. 055 6 and 1. 0572 at 12. 5 ℃, respectively , and t ho se at 30 ℃ were 0. 056 8 and 1. 058 5 , respectively. These

able to mite pop ulations. Tho ugh R0 was t he highest at 20 ℃, t he mean egg number is lower for lo nger rep roductio n time. The highest survival rate , rm , λand mean egg number were observed at 25 ℃, which were 0. 729 2 , 0. 263 8 , 1. 301 9 and 21. 87 , respectively. Key words  T y rop ha g us p ut rescenti ae ;   labo ratory pop ulation ;   table life

   腐食酪螨 ( Ty rophagus p ut rescentiae) 隶属于蛛形

收稿日期 :   2007 - 02 - 19 基金项目 :   贵州省 “十五” 科技攻关项目 ( 黔科合农社字 (2001) 1111) ; 贵州省优秀科教人才省长基金 (20040735) 3 通讯作者 E2mail : dcjin @gzu. edu. cn

numbers were smaller t han t ho se at ot her temperat ures , which indicated t hat high or low temperat ure was unfavor2

Abstract   Life table parameters of the laborato ry pop ulatio ns of T y rop ha g us p ut rescenti ae , including net rep roduc2

纲 ,螨目 ,粉螨亚目 ,粉螨科 ,食酪螨属 。该螨是世界


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