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GB 47893-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数


中华人民共和国国家标准
GB 4789.3—2010

食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms

2010-03-26 发布

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2010-06-01 实施 发布

中华人民共和国卫生部

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GB 4789.3—2010





本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。 本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下: ——修改了标准的中英文名称; ——“第二法 大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU~150 CFU”; 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。

——删除了“第三法

本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。

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GB 4789.3—2010

食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围 本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 2 2.1 术语和定义 大肠菌群 coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数 most probable number,MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 冰箱:2 ℃~5 ℃。 恒温水浴箱:46 ℃±1 ℃。 天平:感量 0.1 g。 均质器。 振荡器。 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶:容量 500 mL。 无菌培养皿:直径 90 mm。

3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 3.11 菌落计数器。 4 4.1 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:见附录 A 中 A.1。

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GB 4789.3—2010 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:见附录 A 中 A.2。 结晶紫中性红胆盐琼脂(Violet Red Bile Agar,VRBA):见附录 A 中 A.3。 磷酸盐缓冲液:见附录 A 中 A.4。 无菌生理盐水:见附录 A 中 A.5。 无菌 1 mol/L NaOH:见附录 A 中 A.6。 无菌 1 mol/L HCl:见附录 A 中 A.7。

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GB 4789.3—2010

第一法
5 检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

大肠菌群 MPN 计数法

检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液,均质

10 倍系列稀释

选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀液,接种 LST 肉汤管 36℃±1℃ 48h±2h

不产气

产 气

BGLB 肉汤 36℃±1℃ 48 h±2 h

不产气

产 气

大肠菌群阴性

大肠菌群阳性

查 MPN 表

报告结果

图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序 6 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品: 称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,

6.1 6.1.1

8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。 6.1.2 6.1.3 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 样品匀液的 pH 值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
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(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。

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GB 4789.3—2010 6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液

或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。 6.2 初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续 培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 6.3 复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环, 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLB) 管中, ℃±1 36 ℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。 6.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告

按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN值。

第二法
7 检验程序

大肠菌群平板计数法

大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液,均质

10 倍系列稀释

选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液,接种 VRBA 平板 36℃±1℃ 18h~24h

计数典型和可疑菌落

BGLB 肉汤 36℃±1℃ 报告结果 24h~48h

图2 8 操作步骤

大肠菌群平板计数法检验程序

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GB 4789.3—2010 8.1 样品的稀释 按6.1进行。 8.2 8.2.1 8.2.2 平板计数 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿, 每皿1 mL。 同时取1 mL生理盐 及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心

水加入无菌平皿作空白对照。 旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平 板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。 8.3 平板菌落数的选择

选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.5 mm 或更大。 8.4 证实试验

从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于 BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃ 培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。 8.5 大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g (mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取 ( =6.0×105 其中10个接种BGLB肉汤管, 证实有6个阳性管, 则该样品的大肠菌群数为: 100×6/10×104/g mL) CFU/g(mL)。

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GB 4789.3—2010 附录A (规范性附录) 培养基和试剂 A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤

A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 2.75 g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.8±0.2 A.1.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管 10 mL。121 ℃高压 灭菌 15 min。 A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤

A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200 mL 0.1%煌绿水溶液 13.3 mL 蒸馏水 800 mL pH 7.2±0.1 A.2.2 制法 将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL 蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL, 用蒸馏水补足到1 000 mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭 菌15 min。 A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

A.3.1 成分 蛋白胨 酵母膏 乳糖 氯化钠 胆盐或3号胆盐 中性红 结晶紫 琼脂 蒸馏水 pH 7.4±0.1

7.0 g 3.0 g 10.0 g 5.0 g 1.5 g 0.03 g 0.002 g 15 g~18 g 1 000 mL
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GB 4789.3—2010 A.3.2 制法 将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。煮沸2 min,将培养基冷却至45 ℃~ 50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3 h。 A.4 磷酸盐缓冲液

A.4.1 成分 34.0 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.4.2 制法 贮存液: 称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中, 用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。 A.5 无菌生理盐水

A.5.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.5.2 制法 称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。 A.6 1 mol/L NaOH

A.6.1 成分 NaOH 40.0 g 蒸馏水 1000 mL A.6.2 制法 称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。 A.7 1 mol/L HCl

A.7.1 成分 HCl 90 mL 蒸馏水 1 000 mL A.7.2 制法 移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,121 ℃高压灭菌15 min。

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GB 4789.3—2010 附录B (规范性附录) 大肠菌群最可能数(MPN)检索表 B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表 每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。 表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数 MPN 0.10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 0.01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 0.001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 <3.0 3.0 3.0 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 9.2 14 20 15 20 27 下限 -0.15 0.15 1.2 1.2 3.6 0.17 1.3 3.6 1.3 3.6 3.6 4.5 4.5 1.4 3.6 4.5 3.7 4.5 8.7 上限 9.5 9.6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 0.10 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0.01 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.001 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100 95%可信限 阳性管数 MPN 下限 4.5 8.7 8.7 8.7 8.7 4.6 8.7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420 上限 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1,000 1,000 2,000 4,100 -95%可信限

注 1:本表采用 3 个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)],每个稀释度接种 3 管。 注 2:表内所列检样量如改用 l g (mL) 、0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时,则表内数字应相应增高 10 倍,其余类推。

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