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CN200810176801-猪胆膏或下脚料中...-审定授权


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猪胆膏或下脚料中鹅去氧胆酸的 分离纯化制备方法
申请号:200810176801.8 申请日:2008-11-19

申请(专利权)人 地址 发明(设计)人 主分类号 分类号 公开(公告)号 公开(公告)日 专利代理机构 代理人

毕小升 毕思宾 610200 四川省成都市双流县黄水镇成都金江制

药有限公司 (成都药圣生物) 毕小升 吴茂芝 付焕全 付常清 毕思宾 曹雪松 吴紫梦 于 露 C07J9/00(2006.01)I C07J9/00(2006.01)I 101830956A 2010-09-15

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注:本页蓝色字体部分可点击查询相关专利

(19)中华人民共和国国家知识产权局

*CN101830956B*
(10)授权公告号 CN 101830956 B (45)授权公告日 2012.11.21

(12)发明专利

(21)申请号 200810176801.8 (22)申请日 2008.11.19 (73)专利权人 毕小升 地址 276800 山东省日照市高新技术开发区 山东药圣生物科技有限公司院内 专利权人 毕思宾 (72)发明人 毕小升 毕思宾 (51)Int.Cl. 吴茂芝 曹雪松 付焕全 吴紫梦 付常清 于露

国生化药物杂志》 .( 第 03 期 ), 张传慧等 . 猪胆汁、 鸡胆汁研制鹅脱氧胆酸 比较 . 《安徽大学学报 ( 自然科学版 )》 .1999,( 第 03 期 ), 王友同等 . 鹅去氧胆酸的制备 .《江苏农业 科学》 .( 第 08 期 ), 杨春梅等 . 几种动物胆汁的组分对比及树脂 法精制 CDCA 初探 .《新疆农业科学》 .2006,( 第 06 期 ), 审查员 赵贞贞

C07J 9/00 (2006.01)
(56)对比文件 CN 101215309 A,2008.07.09, CN 1775798 A,2006.05.24, CN 1830996 A,2006.09.13, CN 1850846 A,2006.10.25, CN 1869044 A,2006.11.29, CN 1528779 A,2004.09.15, 张能荣 . 三种去氧胆酸的制备及其应用 . 《中
权利要求书 2 页 33 页 权利要求书 2 页说明书 说明书 页 附图 附图2 2页

(54) 发明名称 猪胆膏或下脚料中鹅去氧胆酸的分离纯化制 备方法 (57) 摘要 一种猪胆膏或下脚料中鹅去氧胆酸的分离纯 化制备方法, 涉及从家禽及动物胆汁或提取胆红 素猪去氧胆酸的废弃下脚料中提取纯化鹅去氧胆 酸的工业制备方法。其过程是皂化, 氧化脱色, 澄 清处理, 制备一次钙盐, 二次钙盐, 大孔吸附树脂 吸附, 解析结晶, 精制等生产工艺。整个工艺具有 环境友好, 安全无毒, 成本低廉, 易于工业规模化 生产鹅去氧胆酸。含量大于等于 98%, 高效液相 色谱检测。 其它物质 : 猪去氧胆酸含量 <0.5%, 石 胆酸 <0.1%。 薄层层析 : 一个鹅去氧胆酸主斑点, 一个较轻微的猪去氧胆酸斑点。

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1. 一种鹅去氧胆酸的制备方法, 其特征是, 所用的原料为动物胆汁, 胆膏或其提取胆 红素, 猪去氧胆酸之后的下脚料, 包括以下步骤 : (1) 皂化 .10 % — 15 % NaOH, 温度 100— 120℃, 时间 18—26 小时 ; (2) 氧化, 工业双氧水 0.5—2%, 以达到类白色为准 ; (3) 澄清, 用 1+1 天然澄清剂 0.5—5/ 万, 温度 80—100℃, pH9—14, 0.5—2 小时, 板框压滤得澄清滤液 ; (4) 用稀盐酸调 pH2—3, 得粗胆酸, 用乙酸乙酯 8 倍溶解, 活性碳 1 倍, 回流 2 小时, 将滤液浓 缩到 1/5 结晶, 得猪去氧胆酸, 用乙酸乙酯重结晶得熔点 198℃以上的猪去氧胆酸 ; (5) 将二 次猪去氧胆酸的乙酸乙酯回收完毕, 剩下黑褐色的胆膏状物, 加双氧水氧化, 1+1 天然澄清 剂澄清, 得澄清滤液 ; (6) 一次钙盐 ; 加入黑褐色的胆膏状物 1 倍量工业氯化钙, 含量以高效 液相色谱检测为要求 ; 摩尔比鹅去氧胆酸∶氯化钙= 1 ∶ 1.1, 温度 60—80℃, 时间 2 小时, 板框压滤之后加入碳酸钠置换鹅去氧胆酸, 加入摩尔比为氯化钙的 1.1, 温度 90— 100℃, 时间 1— 3 小时 ; (7) 二次钙盐, 以 (6) 的比例, 工艺条件成钙盐后, 用 300— 1000 倍的去离 子水洗涤, 毕, 调 pH2.0—3.5 得粗品鹅去氧胆酸 ; (8) 粗品鹅去氧胆酸溶于碱水 pH6.0—8.0 上弱碱性或强碱性大孔树脂吸附, 饱和后, 水洗除去杂质, 稀碱液解析, 以薄层层析来判断 接收的起始点, 终止点, 调 pH3 真空干燥 ; (9) 将鹅去氧胆酸溶于乙腈混合溶剂回流 2 小时, 加入活性碳 10%, 热滤, 结晶 ; 重结晶得鹅去氧胆酸精品, 含量大于等于 98% HPLC, 含猪去 氧胆酸< 0.5% HPLC, 石胆酸< 0.1%, 薄层层析 TLC : 一个鹅去氧胆酸主斑点, 一个较轻微 的猪去氧胆酸斑点。 2. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在分离鹅去氧胆酸步骤 (1) 中, 皂化 12% NaOH, 温度 110℃, 时间 24 小时 ; 步骤 (2) 中氧化双氧水用量 1.5% ; 步骤 (3) 中 1+1 天然澄清剂用量 5/ 万, 温度 100℃, pH10, 时间 1 小时, 结晶 pH3, 得到粗胆酸 ; 步骤 (4) 中用 乙酸乙酯重结晶得到高熔点的猪去氧胆酸, 198℃以上。 3. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (5) 中, 回收乙酸乙酯后的黑褐色膏状物, 需进一步氧化, 澄清, 双氧水用量 1.0%— 3.0%, 1+1 天 然澄清剂用量 0.5— 5/ 万。 4. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (6) 中, 一次钙盐氯化钙温度为 65℃, 时间 2 小时, 加入量摩尔比为 1 ∶ 1.1, 以高效液相色谱检测 计算, 鹅去氧胆酸∶氯化钙= 1 ∶ 1.1. 加入碳酸钠温度 95℃, 时间 2 小时, 加入量摩尔比为 1 ∶ 1.05, 以加入氯化钙计算。 5. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (7) 中, 二次钙盐, 同一次钙盐工艺, 成钙盐后用 500 倍量去离子水水洗, 至钙盐水溶液中无粗鹅去 氧胆酸为止, 调 pH3.0。 6. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (8) 中, 鹅去氧胆酸溶解后, 上弱碱性或强碱性大孔树脂吸附, 鹅去氧胆酸母液 pH 为 6.5。 7. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (8) 中, 用稀碱液解析时, 用薄层层析来判断接收的起始点, 终止点。 8. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (9) 中, 精制时, 活性炭加入量为鹅去氧胆酸 10%, 回流 2 小时。 9. 如权利要求 1 中所述的制备方法, 其特征是, 在提取分离鹅去氧胆酸的步骤 (9) 中, 根据薄层层析的杂质斑点情况可有选择的选择溶剂来结晶, 以去除杂质胆酸, 使其鹅去氧
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胆酸大于等于 98% HPLC, 猪去氧胆酸< 0.5% HPLC, 石胆酸< 0.1%。 10. 如 权 利 要 求 1 中 所 述 的 制 备 方 法, 其 特 征 是, 在提取纯化鹅去氧胆酸的步骤 (1)-(9) 中, 原料可以是动物类胆汁胆膏, 或是其提取胆红素或猪去氧胆酸之后的下脚料, 前提是不变质, 霉变。

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猪胆膏或下脚料中鹅去氧胆酸的分离纯化制备方法
技术领域 : [0001] 发明涉及一种鹅去氧胆酸 (3α, 7α—二羟基—5β—胆甾烷酸 ) 的分离纯化制备 方法, 主要涉及从家禽及动物胆汁, 特别是猪胆膏 ( 汁 ) 或下脚料 ( 提取胆红素或猪去氧胆 酸之后的下脚料 ) 中提取, 以及分离纯化鹅去氧胆酸的制备方法。 背景技术 : [0002] 鹅去氧胆酸 (3α, 7α—二羟基— 5β—胆甾烷酸 )ChenodeoxycholicAcid( 简称 CDCA), 1824 年首次发现在鹅胆汁中, 1924 年, wieland 和 windaus 在不同的胆 ( 人和鹅 ) 中 发现了鹅去氧胆酸, 它是一种最易溶的胆汁酸, 被命名为鹅去氧胆酸。 [0003] 鹅去氧胆酸具有平喘化痰镇咳和抗炎的作用, 其利胆作用尤为显著, 它是通过减 少胆固醇的吸收, 合成, 使胆汁内胆固醇下降, 从而阻抑胆固醇结石形成和促其溶解, 并且 能有效降低胆固醇饱和度。 [0004] 鹅去氧胆酸还作为制取熊去氧胆酸 (3α, 7β— 二羟基 — 5β— 胆甾烷酸, 简称 UDCA) 的中间体。 熊去氧胆酸是名贵中药熊胆所含的主要成分, 在临床上用于治疗各种胆疾 及消化道疾病。 目前, 传统名贵药用动物胆汁非常紧缺, 寻找有开发前景的药用动物胆汁和 人工合成品为热门研究项目。 进一步发掘动物胆汁的药用价值, 分析动物胆汁 的药用成分 并揭示其作用机理, 使动物胆汁得到综合开发利用。 因此, 制备鹅去氧胆酸对于进一步制备 熊去氧胆酸也具有很重要的意义。 [0005] 鹅去氧胆酸主要有家禽的胆汁或动物胆汁中提取, 由于家禽, 特别是鹅的胆汁量 少而不容易收集, 人们就转向了猪胆汁, 特别是提取胆红素或猪去氧胆酸之后的下脚料中 提取。传统的提取制备工艺过程复杂, 收率低, 特别是纯度上不去, 还不到 98% (HPLC), 其 它物质 ( 猪去氧胆酸, 石胆酸偏高 ) 含量不能满足临床需求 ; 并且使用大量不安全的有机溶 剂。 [0006] 工艺主要分以下几类 : [0007] 1. 以中科院上海有机化学所周维善院士为代表的硅胶柱层析法。 《医药工业》 , 1988, 19(12) : 529-30 ; [0008] 2. 以沈阳化工学院和周维善院士为代表的合成法, ( 中国专利 CN1869043A 等 ) [0009] 3. 以山东博尔德生物公司为代表的大孔树脂法 ( 中国专利 CN1775798A) [0010] 4. 以 常 德 云 港 生 物 公 司 为 代 表 的 钡 盐, 钙 盐 法 ( 中 国 专 利 CN1830996A, CN1869044A 等 ) [0011] 5. 以美国专利 USP4213911.4022806.4163017.4316849 等为代表的精制工艺。 [0012] 由于受原料产地, 工业化生产条件, 环境要求, 特别是工艺技术的成熟度导致了鹅 去氧胆酸的提取, 分离纯化困难, 工业化生产不能达标上量。 发明内容 : [0013] 本发明的目的在于提供一种用于大规模工业制备高纯度鹅去氧胆酸的方法, 回避
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了现有技术的缺陷。 采用安全低毒, 简单实用的方法得到含量大于等于 98% (HPLC 法, 高效 液相检测 ), 猪去氧胆酸 <0.5%, 石胆酸 <0.1%的鹅去氧胆酸 (CDCA). [0014] 发明的目的是通过以下技术方案实现的 : [0015] 1. 皂化处理 ; [0016] 2. 氧化处理 ; [0017] 3. 澄清处理 ; [0018] 4. 猪去氧胆酸粗品的制备 ; [0019] 5. 下脚料的收取, 氧化及澄清处理 ; [0020] 6. 一次钙盐 ; [0021] 7. 二次钙盐 ; [0022] 8. 大孔树脂吸附 ; [0023] 9. 精制得到高纯度的鹅去氧胆酸 (CDCA), 含量大于等于 98% (HPLC), 其它物质 : 猪去氧胆酸 HDCA<0.5% (HPLC), 石胆酸 LCA<0.1%。 [0024] 详细工艺如下 : [0025] (1) 皂化 .10%—15% NaOH, 温度 100—120℃。时间 18—26 小时 ; (2) 氧化, 工业 双氧水 0.5— 2%, 以达到类白色为准 ; (3) 澄清, 用 1+1 天然澄清剂 0.5— 5/ 万, 温度 80— 100℃, PH9— 14, 0.5— 2 小时, 板框压滤得澄清滤液 ; (4) 用稀盐酸调 PH2— 3, 得粗胆酸, 用 乙酸乙酯 8 倍溶解, 活性碳 1 倍, 回流 2 小时, 将滤液浓缩到 1/5 结晶, 得猪去氧胆酸。用乙 酸乙酯重结晶得熔点 198℃以上的猪去氧胆酸 (HDCA) ; (5) 将二次猪去氧胆酸的乙酸乙酯 回收完毕, 剩下黑褐色的胆膏状物, 加双氧水氧化, 1+1 天然澄清剂澄清, 得澄清滤液 ; (6) 一次钙盐 ; 加入黑褐色的胆膏状物 1 倍量工业氯化钙 ( 含量高效液相色谱检测为要求。克 分子比鹅去氧胆酸 : 氯化钙= 1 : 1.1) 温度 60— 80℃, 时间 2 小时, 板框压滤之后加入碳酸 钠置换鹅去氧胆酸, 加入克分子比为氯化钙的 1.1, 温度 90—100℃, 时间 1—3 小时 ; (7) 二 次钙盐, 以 (6) 的比列, 工艺条件成钙盐后, 用 300—1000 倍的去离子水洗涤, 毕, 调 PH2.0— 3.5 得粗品鹅去氧胆酸 ; (8) 粗品鹅去氧胆酸溶于碱水, PH6.0— 8.0, 上弱碱性或强碱性大 孔树脂吸附饱和后, 水洗除去杂质, 稀碱液解析, 以薄层层析来判断接收的起始点, 终止点, 调 PH3 真空干燥 ; (9) 将鹅去氧胆酸溶于乙腈混合溶剂回流 2 小时, 加入活性碳 10%, 热滤, 结晶。重结晶得鹅去氧胆酸精品含量大于等于 98% (HPLC), 含猪去氧胆酸 <0.5% (HPLC), 石胆酸 <0.1%, 薄层层析 (TLC) : 一个鹅去氧胆酸主斑点, 一个较轻微的猪去氧胆酸斑点。 [0026] 本发明的优点与效果 : [0027] 整个工艺具有操作简便, 安全, 成本低廉, 易于工业化生产, 易于得到高纯度的 鹅去氧胆酸, 含量大于等于 98 % (HPLC), 含猪去氧胆酸 <0.5 % (HPLC), 石胆酸 <0.1 % (HPLC)。 附图说明 : [0028] 图 1, 为 提 取 猪 去 氧 胆 酸 后 下 脚 料 的 高 效 液 相 色 谱 图 <23.67 % >. 采 集 日 期 和时间 : 2007-6-15 14:11:32 ; 用户名 : Admin ; 样品名称 : 供试品 ; 注入量 : 20μl ; 方 法 文 件 名: C:\ChromatoSolution-Light\Data\Project1\ 无 标 题 .gcm ; 报 告 名: C:\ ChromatoSolution-Light\Sample\ 模 板 .gcr ; 保存路径: D:\Data\project1\CDCA\12.
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gcd ; 使用仪器类型 : 液相色谱 ; 梯度方式 : 恒流 ; 仪器型号 : LC-10ATvp ; 检测器 : 紫外 ; 柱温 (℃ ) : 40 ; 波长 (nm) : 205 ; 柱型号 : C18 [0029] 图 2, 为鹅去氧胆酸成品高效液相色谱图 <98.80% >. 采集日期和时间 : 2007-6-27 21:30:53 ; 用户名 : Admin ; 样品名称 : CDCA ; 注入量 : 20μl ; 方法文件名 : C:\Chromato Solution-Light\Data\Project1\ 无 标 题 .gcm ; 报告名 : C:\Chromato Solution-Light\ Sample\ 模板 .gcr ; 保存路径 : D:\Data\project1\CDCA\17.gcd ; 使用仪器类型 : 液相色谱 ; 梯度方式 : 恒流 ; 仪器型号 : LC-10ATvp ; 检测器 : 紫外 ; 柱温 (℃ ) : 40 ; 波长 (nm) : 205 ; 柱型 号: C18 [0030] 图 3, 为鹅去氧胆酸成品高效液相色谱图 <98.50% >. 采集日期和时间 : 2007-6-27 20:22:43 ; 用户名 : Admin ; 样品名称 : CDCA ; 注入量 : 20μl ; 方法文件名 : C:\Chromato Solution-Light\Data\Project1\ 无 标 题 .gcm ; 报告名 : C:\Chromato Solution-Light\ Sample\ 模板 .gcr ; 保存路径 : D:\Data\project1\CDCA\14.gcd ; 使用仪器类型 : 液相色谱 ; 梯度方式 : 恒流 ; 仪器型号 : LC-10ATvp ; 检测器 : 紫外 ; 柱温 (℃ ) : 40 ; 波长 (nm) : 205 ; 柱型 号: C18 [0031] 具体实施方式 : [0032] 1. 在分离鹅去氧胆酸过程中, 皂化 12% NaOH, 温度 110℃, 时间 24 小时 ; 氧化双氧 水用量 1.5%, 澄清剂用量 5/ 万, 温度 100℃, PH10, 时间 1 小时, 结晶 PH3, 得到粗胆酸。用 乙酸乙酯重结晶得到高熔点的猪去氧胆酸 (198℃以上 )。 [0033] 2 回收乙酸乙酯后的黑褐色膏状物, 需进一步氧化, 澄清, 双氧水用量 1.0 % — 3.0%, 澄清剂用量 0.5— 5/ 万。 [0034] 3. 一次钙盐氯化钙温度为 65℃, 时间 2 小时, 加入量克分子比为 1 : 1.1, 以高效液 相色谱检测计算, 鹅去氧胆酸 : 氯化钙= 1 : 1.1. 加入碳酸钠温度 95℃, 时间 2 小时, 加入量 克分子比为 1 : 1.05, 以加入氯化钙计算。 [0035] 4. 二次钙盐, 同一次钙盐工艺, 成钙盐后用 500 倍量去离子水水洗, 至钙盐水溶液 中无粗鹅去氧胆酸为止, 调 PH3.0。 [0036] 5. 鹅去氧胆酸溶解后, 上弱碱性或强碱性大孔树脂吸附, 鹅去氧胆酸母液 PH 为 6.5。 [0037] 6. 鹅去氧胆酸中, 用稀碱液解析时, 用薄层层析来判断接收的起始点, 终止点。 [0038] 7. 精制时, 活性炭加入量为鹅去氧胆酸 10%。回流 2 小时。 [0039] 8. 根据薄层层析的杂质斑点情况可有选择的选择溶剂来结晶, 以去除杂质胆酸, 使其鹅去氧胆酸大于等于 98% (HPLC) 猪去氧胆酸 <0.5% (HPLC), 石胆酸 <0.1%。 [0040] 9. 在提取纯化鹅去氧胆酸过程中, 原料可以是禽类胆汁胆膏, 可以是动物类胆汁 胆膏或是其提取胆红素或猪去氧胆酸之后的下脚料, 前提是不变质, 霉变。

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