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长臀


   长臀   ( C ranog lan is bouderius ) 隶属于鲇形目 ( Siluriformes) 长臀  科 ( Cranoglanididae ) 长臀  属 ( C ranog lan is) , 为东亚特有种 , 俗称骨鱼 , 是我国 名贵经济鱼类 。其主要分布于中国珠江水系 、海南 岛 、云南的元江水系 , 国外仅见于元江下游越南北 [1] 部的红河

水系 。目前 , 国内对长臀  的研究多 [2] 集中在养殖和基础生物学方面 。长臀  天然群 [3] 体资源日益枯竭 , 已被列为易危物种 , 且对其 [1] 的分类存在争议 。因此 , 开展长臀  分子标记 的研究 , 对长臀   的分类 、种质保护和合理利用具
   收稿日期 : 2007 - 06 - 11

第 37 卷   6 期 第 Vol137 No16

淡      水 渔 业 Freshwater Fisheries

长臀   遗传多样性的微卫星标记分析
程  飞
1, 3

, 叶  卫 , 叶富良 , 谢松光 , 龙翠华

2

1

3

4

摘要 : 利用 55 对微卫星引物对珠江和海南长臀   基因组 DNA 进行了扩增 , 有 23 对能扩增出清晰条带 , 其中有 平均等位基因数 2191 个 。结果显示 : 珠江长臀   的平均观测杂合度 ( Ho) 是 0145, 平均期望杂合度 ( He) 是 0146, 关键词 : 长臀   ( C ranog lan is bouderius) ; 微卫星标记 ; 遗传多样性 中图分类号 : Q173       文献标识码 : A       文章编号 : 1000 2 6907 2(2007) 06 2 0061 2 04
1, 3 2 1 3

11 对在珠江长臀   中表现多态性 , 9 对在海南长臀   中表现多态 。这些多态性位点的等位基因数在 2 ~4 之间 ,

资助项目 : 广东省科技重大专项 ( 2005A20105001) 通讯作者 : 叶卫 。 E 2 mail: yewei195856@ tom 1 com

第一作者简介 : 程飞 ( 1977 -  ) , 男 , 汉族 , 湖北黄陂人 , 硕士研究生 , 专业方向为水产经济动物生物学及种苗工程 。

平均多态信息含量 ( P IC ) 为 01377; 海南长臀  的平均观测杂合度 ( Ho ) 和平均期望杂合度 ( He ) 分别是 0158、
Abstract: 55 pairs of m icrosatellite p rim ers were emp loyed to amp lify the genome of Pearl R iver C ranog lan is bouderius and Hainan C. bouderius 23 pairs of p rim ers can amp lify legible band. Of these 23 p rim ers pairs, 11 showed polymorphism in . 0153, 平均多态信息含量 ( P IC) 为 01426。两群体间的遗传相似度为 01875、遗传距离为 01133。 genetic sim ilarity of these two populations was 01875 and the genetic distance was 01133. Key words: C ranog lan is bouderius; m icrosatellite mark; genetic polymorphism

Genetic D iversity of C ranog lan is boude rius w ith M icrosa tellite M arkers
CHENG Fei , YE W ei , YE Fu 2liang , X I E Song2guang , LONG Cui2hua
( 11Guangdong O cean U n iversity, Zhan jiang, Guangdong  524025;
4

cus was 2 ~4 and the average was 2191. The results showed: for Pearl R iver C1 bouderius, the average observed heterozygosi2 ty ( Ho ) was 0145, the average expected heterozygosity ( He ) was 0146, and the average polymorphism information content

Pearl R iver C. bouderius and 9 showed polymorphism in Hainan C1 bouderius The number of alleles on the polymorphic lo2 .

? 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

( P IC ) was 01377; For Hainan C1 bouderius, the averages of Ho, He and P IC were 0158, 0153 and 01426, respectively The .

31中国科学院水生生物研究所 , 武汉  430072; 41武汉市实验学校 , 武汉  430014 )
31 Institu te of Hyd robiology, W uhan  430072; 41W uhan Experim en ta l S chool, W uhan  430014 ) 21Guangdong O rech rom is B reed ing Fa r , Guangzhou  511453; m

( 11广东海洋大学 , 广东湛江  524025; 21广东罗非鱼良种场 , 广州  511453;

有重要意义 。 微卫星 (m icrosatellite )是由 1 ~6 个碱基对组成 的短串联重复序列 , 分布于真核生物整个基因组 。 微卫星标记被认为是物种遗传多样性评估的理想分 子标记之一 。利用已报道的鱼类微卫星引物来研究 近缘种是微卫星标记应用的是一种行之有效的方 [4] 法 。本实验利用已发表的微卫星引物对长臀   进行了扩增 ,筛选出了多态性较高的微卫星位点 ,并 对珠江和海南长臀   的群体遗传结构进行了研究 , 旨在为深入开展长臀   遗传研究提供参考资料 。

2007 年 11 月 Nov12007

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淡                           2007 年 水 渔 业

1  材料和方法
珠江长臀   30 尾采自广东罗非鱼良种场 , 海 南长臀   30 尾采自于海南南渡河 。实验鱼活体带 回实验室 , 取全血 1 mL 以 ACD ( acid 2citrate 2dex2 trose ) 抗凝 , - 20 ℃保存 。应用 DNA 提取试剂盒 (组织 DNA 提取试剂盒 , TI NGEN ) 从血液中提取 A 基因组 DNA。具体操作按试剂盒说明书进行 。将 得到的 DNA 溶于 TE 缓冲液中备用 。 112   引物选择 选取已发表的大 口鲶 和鲤 科鱼 类的 55 对 引 [ 4 ~7 ] 物 进行长臀   基因组 DNA 的扩增 。
Mg 111   材料与 D NA 提取 113  PCR 反应体系
2+

7 μL 混合物在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳 。

PCR 反应体系总体积为 20 μL: 10 × buffer 2 μL、 112 μL、 DNA 模板约 50 ng、 正向 、 反向引物各

环 30 次 ,最后 72 ℃ 终末延伸 7 m in。在此基础上 , 2+ 根据各对引物扩增情况 , 调整退火温度 、 g 等参 M 数 。扩增产物与上样缓冲液按体积比 5 ∶ 混匀 , 取 2

信息含量为 01250 ~ 01677, 平均多态信息含量为 01411, 有 2 个高于 015。珠江长臀  观测杂合度 为 0 ~017333, 平均观测杂合度 ( Ho ) 是 0145, 平 和平均 He分别是 0158、 0153, 与珠江长臀   杂合 (表 3 ) 。根据等位基因频率计算出珠江 度数值相近 长臀   和海南长臀   间的遗传相似度为 01875、遗 传距离为 01133。

均期望杂合度 ( He) 是 0146。海南长臀   的平均 Ho

10 mmol/L dNTPs 013 μL、 Taq 酶 1 U、 mmol/L 25 015 μmol/L。 PCR 反应程序 : 95 ℃预变性 5 m in, 212   长臀   群体遗传多样性 94 ℃ 变性 30 s, 55 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 45 s,共循

图 1  Koi20 在珠江长臀   群体中的扩增电泳图谱

珠江 长 臀   11 个 座 位 的 多 态 信 息 含 量 为 01061 ~01673, 平均多态信息含量为 01377, 其中
4 个座位的高于 015。海南长臀   9 个座位的多态

3  讨论

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M: DNA 标准分子量 pBR322 DNA /M spI; 1 ~25: 珠江长臀   群体 1 ~25 个样本 Fig11  Electrophoresis patterns of PCR p roducts amp lified by Koi20 in Pearl R iver C1 bouderius M: pBR322 DNA /M sp I molecular weight marker; 1 ~25: individuals of Pearl R iver C1 bouderius population
[ 11 ]

电泳缓冲液为 015 × E,电压 140V 恒压 ,电泳 3 h TB [8] 左右 。银染按 Sanguinetti 等 的方法进行 。凝胶显 式见参考文献 [ 9, 10 ]。

影后在紫外凝胶图像处理系统中扫描 、 。 分析 114   统计分析 用 I ageM asterI Elite (Version 3101 ) 软件对谱 m D 带进行分析 , 并辅以人工校正 。实验统计了等位基 因数 (α) 、有效等位基因数 (αe ) 、杂合度的观察值 ( Ho)与无偏倚预期值 ( He) 、多态信息含量 ( P IC ) 、 遗传相似性系数 ( I) 和遗传距离 ( D ) 。具体计算公

2  结果

其中珠江长臀   11 对引物 ( 2316% ) 表现为多态 有 性 , 海南长臀   9 对引物表现多态 (图 1, 表 1 ) 。 有 这些多态性引物共扩增出 38 个等位基因 , 等位基 因数在 2 ~4 之间 , 平均每个座位扩增出 2191 个等 位基因 , 等位基因大小在 124 bp ( koi20 ) 与 310 bp ( HLJ15 )之间 (表 2 ) 。
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自 1927 年 Koller 命名了新种海南长臀   , 后 关于珠江长臀   和海南长臀   关系的争议就不断产 [ 12 ] 生 。M yers 认 定 C 1 sinensis (珠 江 长 臀   ) 和 C. m u ltirad ia tus (海南长臀  ) 是两个明显的物种 , 并 将这两个种归入一个独立的科 , 即长臀   。褚新 科 [ 13 ] 洛等 根据形态差异将采自珠江水系的 C 1 boude2 rius以及采自云南元江和海南的 C 1m u ltirad ia tus 作 [ 14 ] 为 C 1 bouderius的两个亚种 ; Ng 在整理长臀   属 鱼类时 , 认为长臀   属有三个有效种 , 即除珠江水 系的长臀   ( C ranog lan is bouderius)和海南诸水系的 海南长臀   ( C ranog lan is m u ltirad ia tus) 外 , A nopleu 2 [1] tropius hennci也为有效种 。 2005 年刘彩霞等 对长 臀  的可测量性状进行了主成分分析 , 认为长臀   [ 15 ] 属鱼类只存在一个有效种 。 Thorp 研究认为 : 同 科属群体间遗传相似系数在 011 ~015 之间 ; 不同

211   微卫星引物扩增结果 所选用的 55 对引物 (大口鲶和鲤科鱼类 ) 中有

23 对能得到稳定 、可重复的 PCR 产物 ( 4118% ) 。

第 6期

程飞等 : 长臀   遗传多样性的微卫星标记分析 表 1  珠江长臀   和海南长臀   11 个微卫星座位的等位基因频率 Tab11  A llele frequenc ies of 11 m icrosa tellite loc i in C 1 bou derius 等位基因频率 珠江长臀   海南长臀   01288 01200 01192 01236
01365 01154 01519 01058 01173 01250 01032 01968 01000 01612 01388 01086 01343 01057 01514

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座位

等位基因
1

座位

等位基因
1 2 1 2 3 4 1 2 1 2 3 1 2 1 2

等位基因频率 珠江长臀   海南长臀  
01412 01588 01019 01577 01269 01135 01968 01032 01415 01585 01000 01211 01789 01348 01652 01453 01547 01108 01811 01054 01027 01527 01473 01227 01682 01091 01000 11000 01000 11000
2+

Koi20

2 3 4 1 2 3 4 1

HLJ21

HLJ3

HLJ15

2 3 1 2 1 2 3 4

HLJ20

HLJ18

座位
Koi20 HLJ3 HLJ15 HLJ18 HLJ20 HLJ21 HLJ22 HLJ23 HLJ33 HLJ36 HLJ38

F  TGCCCTCTCTTTCCTTCA CAGGCTTCAACACAAACACA F  AAGCAACGCTGAAAGGTA CACGCCCTCACTCTTATT

F  TCGGGTGTCCACATACTTT ATGGTCGTGATTGATTGC F  AGCTTTCCCGTCTTTGT GCATACTGTCCACCTCCT

F  TCCAACCACCACCTGATA GCAGCCCAAGGTAATGTA F  CGACGTAACCTGTAATGC AGGTGAAACCGTCTATCC

F  CAATGATGAGCGTGAGGT CAGGAGGTCTGTCTAAATGA F  CCACTGAGCACAGGGTAA AGGGAGGTAGAGGCAAAA

F  CAAGTTCTCATTTCCCATAC TTCTCCCTGTTGCTCTGT

F  CACAATGCCCTGCTCACA CTGCCTTTCTAAAGCTCTACCA F  GCACCCTAAGCCAAGCCT GATCCGACGGCAACAGTG

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表 2  11 对微卫星引物在长臀   中的扩增条件及结果 Tab12  The am plif ica tion cond ition s and results of 12 m icrosa tellite pr i ers on C 1 bou derius m 引物序列 (5 ′ 3 ′ ) 核心重复 序列
GGGA GT

01145 01418 01667 01026 01051 01256 01000 01483 01517 01588 01412 01000 01371 01229 01400 AC AC AC GT CA CA CA CA CA

HLJ22

HLJ23

HLJ33

HLJ36

HLJ38

退火温度 ( ℃)
50 53 56 53 54 52 53 51 51 55 58

退火时间 ( s)
30 30 30 30 30 35 30 30 40 35 30

等位基因大小 ( bp)
124 ~150 250 ~300 270 ~310 210 ~220 170 ~195 160 ~180 190 ~205 210 ~220 260 ~270 128 ~136 150 ~158

等位 基因数
4 4 3 4 2 2 4 2 3 2 2

M g 浓度 (mmol/L ) 115 110 112 110 112 110 110 112 112 115 112

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淡                           2007 年 水 渔 业 表 3  长臀   11 个微卫星座位遗传多态性 Tab13  Genetic d iversity the 11 m icrosa tellite loc i in C 1 bou de riu s 观察值杂合度 ( Ho) 珠江 海南
017333 017333 010333 011667 016333 017000 017333 010333 013667 012667 015333

座位
Koi20 HLJ3 HLJ15 HLJ18 HLJ20 HLJ21 HLJ22 HLJ23 HLJ33 HLJ36 HLJ38

有效等位基因数 (αe ) 珠江
316 217 111 215 119 119 214 111 119 115 118

期望杂合度 ( He)

多态信息含量 ( P IC ) 珠江
01673 01579 01061 01537 01362 01367 01513 01061 01368 01278 01350

海南
314 119 210 219 119 210 115 210 119

珠江

海南

海南
01677 01485 01250 01367 01592 01373 01305 01374 01412

— —

物种间遗传相似系数在 012 ~018 之间 ; 同种群体间 遗传相似系数在 018 ~0197 之间 。本研究显示长臀   和海南长臀  间的遗传相似度为 01875、 遗传距 离为 01133,所以根据本实验二者应同属一个有效 种的不同群体 。 多态信息含量 ( P IC ) 是衡量位点多样性的一种 较好的指标 。在某一群体中 ,当 P IC > 015 时该位点 表现为高度多态 ; 当 0125 < P IC < 0. 5 时该位点表现 为中度多态 ; 当 P IC < 0125 时该位点表现为低度多 [ 16 ] 态 。珠江长臀   12 个座位中 5 个座位是高度多 体的平均观测杂合度均低于各自相对应的平均期望 杂合度 ,表明群体中纯合子个体有一定的比例 ,群体 遗传多样性有下降的趋势 。
参考文献 :
[ 1 ]刘彩霞 ,彭作刚 ,何舜平 . 长臀  属鱼类多变量形态分析及物种

态基因座位 , 5 个座位是中度多态基因座位 。海南 长臀   群体中有 2 个高度多态基因座位 , 8 个座位 是中度多态基因座位 。这一结果表明 , 两个长臀   群体的遗传多样性中度偏高 。杂合度是度量群体遗 传变异的另一个有效参数 。珠江长臀   与海南长臀   的杂合度基本一致 , 两个群体平均观测杂合度均 小于 014, 平均期望杂合度分别是 0145、 146, 都符 0 合 Hardy2 einberg定理中的随机交配群体杂合度不 W 超过 015 的标准 , 说明两个群体在当前的野生环境 下种质资源较好 , 具有一定的群体稳定性 。两个群
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018333 013000 019333 011667 017000 017667 012333 018333 014667

— —

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出版社 , 1990. 313.

linkage map in man using restriction fragment length polymorphism s

017471 016513 010940 016207 014900 014900 016034 010940 014900 013448 014598

017302 014900 015172 016778 014900 015172 013448 015172 014900

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