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PCR技术检测甘蔗线虫病抗性基因的研究


福建农林大学 硕士学位论文 应用PCR技术检测甘蔗线虫病抗性基因的研究 姓名:吴杨 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:潘大仁 2003.5.1

福建农林犬学2003届硕士学位论文

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本研究以43份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,首先提

取供试甘蔗基因组DNA,然后根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线 虫病基因的保守序列区域,分别设计了两条上游引物、两条下游引物,埘引 物组合后,进行了PCR特异扩增,从中分别筛选出一对特异引物,并优化
了PCR扩增反应体系中的各个影响因素。用抗根结线虫基因设计t的引物进 行扩增最终获得了一条大约460 bp大小的特异片段:用抗胞囊线虫基因设计

的引物进行扩增最终获得了一条大约690bp大小的特异片段,并进一步做了
PCR.Southern杂交.以确认这两条特异片段的同源性程度和真实性,本实验 所得结果如下: 1.建立了适合于甘蔗PCR特异扩增的反应体系:反应总体积为209l,
含10nmlol/L Tfis*HCl(pH8.3),50 mmol/L
KCI


2.0 mmol/L MgCl2,100pmol/L

dNTP,O.2¨mol/L引物,40ng模板DNA,1.0U Taq酶;反应程序为:94"C,
5min,I cycle;9437。40s,60"C,50s,72℃,90s,35

cycles;72"C延伸10rain。

2.对43份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源根据不同的引物进行 PCR检测。其中,用抗根结线虫病基因设计的引物进行扩增,结果有37份
甘蔗出现特异条带,6份未出现任何条带;用抗胞囊线虫病基因设计的引物

进行扩增。结果有39份甘蔗出现特异条带,4份未出现任何条带。 3.对两种PCR特异产物进行了PCR—Southern杂交,结果显示它们有杂 交信号,说明这两个片段分别与两个抗线虫病基因有较高的同源性,为克隆 甘蔗抗线虫病基因奠定了基础。

关键词:甘蔗

抗线虫基因

基因检测PCR.Southern杂交

福建农林大学2003届坝_二学位论文

第2甄

ABSTRACT
The

nematode

resistance

of

forty—three

sugarcane

cultivars(wilhout

conventional identification of nematode resistance)was tested in the experiment. Firstly,the sugarcane genomic DNA was extracted.Secondly,according
tO

the

sequence of root?knot nematode resistant gene in tomato and the sequence of

nematode resistant gene in sugar beet,two forward primers and two

reverse

primers were produced separately by synthetic,4 pairs of primers that wege in each kind were composed,and by PCR


palr of primers in each was selected among them

Thirdly,conditions for PCR in sugarcane were optimized,the results


showed that

special fragment of about 460bp and



special fragment of about

690bp were appeared,and PCR—Southern blotting about them was made further in order to affirm the homogeneous sequences of nematode resistant gene. Finally,43 sugarcane cultivars were primarily detected by PCR technique The result§were summarized
as

following:


1.An optimal reaction system for PCR in sugarcane was established:in

209l

reaction solution,the optimal composition included 10 mmol/L Tris—HCI(pH8.3), 50 mmol/L KCI,1.5 mmol/L MgCl2,1009mol/L dNTP,0.29mol/L primers,40ng of template DNA and 1.0 U Taq DNA Polymerase.The reaction program was devised in to 3 second
ode

processes:Tk first

one

ia denaturation

at

94"Cfor 5 mia.The

is 35 cycles of denaturation at 94"C for 40s,annealing at 60℃for
one

50s and extension at 72℃for 90 S.The last 2。Among 43

iS extension at 72℃for 10 min.


5ugarcane eultivars,37 cuRivass appeared

special fragment of

about 630bp,and 6 cultivars had nothing by using root—knot nematode resistant

primers.39 cultivars appeared



special fragment of about

630bp,and 4 cultivars

had nothing by using cytocyst nematode resistaat primers,

望堡坐整叁兰!!塑星堕主兰些堡壅————兰三—!L
3.The two kinds of special PCR products were hybridized by PCR—Southern biotting
The blo'【ting signals appeared,which proved thin there was


great

root—knot nemaode homogeneous sequence between 460bp special fragment and resistant gene in tomato and there was


great homogeneous sequence between

in sweet potato.They were 690bp special fragment and nematode resistant gene the basis for cloning nematode resistant gene in sugarcane. 4.The results will be tested by field identification in the further Key words:Sugarcane、Nematode PCR-Southern blotting
res’stant

gene、Gene

detection、

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1.前言
1.1线虫病的研究现状 线虫病是一种严重制约世界农作物产量的重要病害,其危害超过细菌和 病毒.仅次于真菌病害,每年约造成1000亿美元的损失…。线虫能危害粮、 浊、棉、烟、茶、蔬菜、果树、林本、花卉、药材、牧草等各种植物,它的 适应范围广、传播途径多,是一种极难防治的土传性病害I”。植物寄生线虫 有外寄生线虫和内寄生线虫两类。其中危害最严重的多属内寄生线虫,尤以 根结线虫、胞囊线虫和球形胞囊线虫三个属的线虫最为重要。

1.1.1根结线虫(Meloidogyne Goeidi) 根结线虫是定居型内寄生线虫,其二龄幼虫侵入根组织后,在一个位点 上取食刺激寄主细胞,从而使取食位点周围的皮层组织逐渐形成根结或结瘿 【”。生活于根结内的线虫,破坏根结构,阻碍水分、养分运输。 自1855年根结线虫被作为病害首次报道口l以来,现已发现世界上有80 多种根结线虫”】,我国报道的有25种,广泛地危害许多粮食和经济作物,如 水稻、花生、香蕉、柑桔、甘蔗、烟草、棉花、马铃薯、花卉(月季等)、 果树以及中药材等,还严重危害我国南方露地和北方保护地大棚的蔬菜,如 番茄、黄瓜、丝瓜、茄子、辣椒等.一般每年引起产量损失达10%,1 5%,严
重时损失达30%,40%,甚至绝产p。J。 根结线虫另一重要危害体现在引致复合病。在田间植物根际土壤中生存

着许多着许多真菌、细菌等微生物,其中有不少是植物病原物或弱寄生物, 当植物受到根结线虫侵染后,这些微生物可能产生并发为害【2J。
1.1.2胞囊线虫(Heterodem Schmidt) 胞囊线虫是专性内寄生线虫,它们一般以根尖生长点后的伸长区作为侵 入部位,幼虫进入根后向维管束方向移动,而后选择靠近根部维管束内侧的 某些特殊细胞作为最初的取食部位,此后经口针分泌食道腺分泌物溶解相邻 细胞壁,使得相邻细胞事融合而形成一个大的细胞,称为合胞体【8】。胞囊线 虫经两性交配后,雌虫仅把少量卵排出体外,大部分留在体内,虫体死后, 形成胞囊,胞囊呈白色或黄色,约为针头大小,每胞囊约有卵200.500粒, 卵在囊中可存活数年pJ。 胞囊线虫常生活在轻质、低肥、干旱土壤中,易造成寄主断报、根系粗 糙,或其他病原乘机而入,引起烂根、寄主矮化。此外,胞囊线虫与其他病 原物在植物上引起复合侵染,常常造成更大损失12J。 作物胞囊线虫病是最重要的线虫病害之一,燕麦胞囊线虫在印度西北地 区和澳大利亚南部被认为是限制小麦和大麦产量的重要因素口f。据报道,1990

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年美国东北地区因大豆胞囊线虫为害造成损失达8840万美元阻1。在日本,大 豆胞囊线虫引起的产量损失可达10%。75%t”。我国东北盐碱干旱地带大豆胞 囊线虫病常年引起的减产一般为30%以上I”。 1.2作物抗线虫基因的研究现状

1.2。l作物抗线虫基因的克隆 植物抗线虫病基因的分子学研究是目前国内#1--t一分活跃研究领域,近年 来,依据基因在染色体上的位置,科研人员已分离克隆到一些抗线虫基因。 第一个抗线虫基因是1997年Cai等Il 0J从甜菜中分离到的抗甜菜胞囊线

虫的基因协,”~,该基因由微小的染色体易位所产生,这种染色体易位是由 于两个染色体不正常的断裂和联结所形成的。胁』胛。基因在植物根部特异表
达,编码一个由282个氨基酸组成的酸性蛋白质。该蛋白质含有一个由几个 富含亮氨酸区域(Leucine.riched repeat region,LRR)构成的受体结构域和 一个典型的跨膜区域,这可能是定位于膜上的糖蛋白受体,可与线虫尖锐的 口器刺入甜菜根时所产生的化合物相结合。Hsl呻。蛋白所携带的亮氨酸重复 序列可能在其它抗性蛋白中也存在,它涉及宿主与病原体之闯的蛋白质一蛋 白质的相互作用。Hslv”o这些结构特征与从番茄中分离的抗叶霉病基因 Cf-9,Cf-2和Cf-4具有很大的类似性。研究证明在易感甜菜中表达此抗病基 因会对胞囊线虫的侵染具有抗性。胞囊线虫的幼虫既可以侵袭抗性株的根 .部,也可侵袭敏感株的根部。在适宜的系统中,雄虫与雌虫交配后离开根部,

雌虫变为充满虫卵的胞囊:在表达胁J胛。基因的抗性植物中很少观察到雌
虫,这些雌虫不能完成生活史。也不能产卵,它们的取食细胞很小,与正常 的合胞体明显不同。

Jung研究组与荷兰的研究组发现,栽培种的甜菜是无抗性的,但其野生

近亲葡生甜菜B,procumbens却携带Hsl,Hs2,和协,三个基因,其中每个
基因均具有完全的抗性。此外,野甜菜与易感植物如糖甜菜的杂交体也带有 Hsf”7基因。他们将来自1号染色体的基因Hslp”。通过种间杂交和定位克 隆技术转移到转移到培养的、未经免疫的甜菜根中去,经转化的甜菜根能抵 抗线虫的损害【lo】。这一基因已在易感甜菜根部用基因互补实验得到证实,并 在CaMV35S启动子的控制下得到表达,象在抗性植物中所表现的那样观察 到不适宜的反应,首次证明了用天然抗性基因培育抗性作物的潜能。可以预 料在不久的将来借助于转基因技术可以培育出具有抗性的甜菜品种。最近,

借助于和胁J胪7紧密连锁的分子标记的选择,传统的培育品种已经进入市
场㈤。
第二个抗线虫基因是1998年Kaloshian等和Milligan等从野生番茄 peruvianum(L.)Mill)中用定位克隆途径分离到的抗根结线虫 基因^靠∥2_31,该基因已与限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态
(Lycopersicon

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DNA(RAPD)和扩增片段长度多态性(AFLP)紧密连锁,并用重组鉴定技 术将Mil基因定位于番茄6号染色体上的一小段区域内,通过对连续52kb
DNA的序列分析,鉴定出3个开方阅读框架。这个基因位于至少由8个基

因组成的基因簇中,丙且含有一个核苷酸的结合位点(Nueleotide.Binding Site,NBS)和一个富含亮氨酸区域(LRR),这些基序是以前所克隆的疾病 抗性基因的特性,如核苷酸结合部位、富亮氨酸区。然而M/I和Hslp”。的 产物却完全不同。 第三个抗线虫基因是从小麦中分离的抗胞囊线虫基因Cre31“】。此基因编 码一个含有核苷酸结合位点(NBS)和一个富含亮氨酸区域(LRR)的多肽, 在小麦根部特异表达。NBS结构暗示它们在发挥正常功能时有可能需要结合 ATP或GTP;而LRR结构则表明它们可能作为受体,结合病原物产生的某 种诱导物,从而起始细胞的信号传递过程以产生抗病反应。研究证明Cre3 基因同小麦的抗线虫能力相连锁。 1.2.2作物抗线虫基因的定位 除了以上这些已经被克隆出来抗性基因,还有许多抗性多基因型和单基 因型已经用分子标逸进行了定位。 抗马铃薯金线虫G.rostochiensis所有致病型的Grol基因已通过RFLP、 AFLP和RAPD方法给予了精确定位【l”。有证据表明GroI已经克隆出来, 但还未被证实Il“。通过用已克隆出的不同抗性基因中的序列基元作为引物已 扩增了几个序列,至少有5个序列位于GroI位点上,它们都带有一个核酸 结合位点基序【j”,然而必须用转基因马铃薯进行基因互补实验来证实。用

RFLP标记的等位基因进行PCR分析诊断发现GroI和脚等位基因紧密相
连,这样就发现了第2个抗性位点【l 81,£U基因的功能是导致马铃薯取食部
位的坏死。 另一个等位克隆的基因是来自番茄的野生近亲Lycopersicon pimpinellifolium中的Hero基因,它具有对马铃薯金线虫的抗性,并用紧密 相连的RFLP标记进行了定位。同时,酵母人工染色体(YACs)从带有此基 因的区域分离出来,这个基因对马铃薯育种也有意义,因为它的抗性机制与 以往描述的马铃薯基因均不一样。此外,抗G pallida的Gpa2基因也将很快 被克隆出来,这个基因已被精确定位到12号染色体上,覆益这一区域的细 菌人工染色体(BcA)克隆也得到分离,基因互补实验正在进行中[161。 大豆胞囊线虫H glycines在美国是非常重要的大豆病原体,该线虫的不 同抗性基因已经用分子标记进行了定位【l”,一个主要的抗性位点(R^gJ)位于 大豆的G染色体上,阐明了有50%的基因变异拉“。围绕这一位点的一个620kb 的BCA毗邻序列群通过紧密连锁的标记被建立起来,使得尺妇,成为第一个 从该种植物中克隆出的抗性基因。紧密连锁的标记方法同样也可用于对大豆 A连锁群的第二个抗性基因R蛔4的定位。南方根结线虫M incognita也属于

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大豆的主要病原体,但抗性属于数量遗传,抗这种线虫的两个主要数量特征 位点(QTLs)已通过RFLP标记定位¨“。 在世界某些地区,如澳大利亚,小麦和大麦严重感染燕麦胞囊线虫H avenae。在大麦中,线虫抗性位点Hal和Hal2(等位基因Ha3)已经定位到2 号染色体上【2”,而一个新基因Ha4被定位到5号染色体上【l”。在小麦中, 已用RFLP、RAPD和STS标记定位了两个位点,Crei基因定位到2B染色 体上【2”,来自Triticum tauschii的Cre3基因已经得到分离,并证明与已有的
抗性基因有同样的抗性II…。 在花生中,花生根结线虫M arenaria引起严重病害,来自A.cardenasii

的两个主要基因Mae和Mag可减少虫卵数量或限制结节的形成,这两个基 因已与RAPD、序列特征性扩增区域(SCAR)和RFLP位点紧密相连【24】。依据 标记进行的选择正在用栽培种的基因进行研究。拟南芥Arabidopsis出作为甜 菜胞囊线虫和它的寄主之间相互作用的模型,尽管己进行了广泛的研究,但 没有发现任何抗性基因【2“。 由于分子生物学迅速发展,目前许多抗病基因都成为科学家们研究的热 点。根据这些基因的保守序列,合成寡核苷酸引物,通过PCR扩增R基因 类似序列,为克隆抗病基因提供了一条新的途径。 1.3生物技术在基因检测方面的应用
1.3.1

PCR的研究现状

PCR是polymerase chain reaction(聚合酶链式反应)的简称,它是由美国

Cetus公司的Kary Mullis等人在1985年建立起的一套体外大量快速扩增特 异DNA片段的系统¨…。PCR可在几小时内将一个分子的遗传物质成百万乃 至上亿倍的复制。PCR扩增基因的原理是模拟生物体内DNA的半保留复制 过程。它是基于碱基互补的原则,以待扩增的目的DNA两条链为模板,在 其两端加上与之互补的两段寡核苷酸引物,通过模板DNA在高温下变性, 引物在低温下与其互补序列复性,在DNA聚合酶作用下,中温中引物延长 合成互补链。这样三步反应为一周期。每一周期的产物又可作为新的模板, 进行新的合成反应。经过n个周期后特异的靶DNA片段就扩增为原来的2“ 倍,从而达到进一步分析、研究和诊断的需要量【2 71。 PCR反应液的基本组成是DNA聚合酶、寡核苷酸引物、四种脱氧核苷 酸(dNTP,N=A,T,G,c)、缓冲液以及模板DNA分子。 DNA聚合酶:目前常用的DNA聚合酶是分离自水生嗜热杆菌(Thermus

aquaticus)的耐热性DNA聚合酶,称为聊DNA聚合酶,它的发现和应用极
大地促进了DNA片段的特异性扩增。早期的PCR反应采用大肠杆菌 (Escherichia coli)DNA聚合酶I的Klenow片段,它的延伸反应条件为37℃, 扩增效率和专一性都很差;而Taq DNA聚合酶在DNA变性温度下表现相对

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稳定,因模板DNA不同,其最适温度高达75.80 9C,95℃条件下半寿期可达 40min【2…,因此不需每个合成循环后补充DNA聚合酶,不仅降低反应费用, 而且允许进行自动热循环。除了此种Taq DNA聚合酶以外,自然界还存在 丰富的有待于开发利用的DNA聚合酶资源,比如从高温嗜酸性的古细菌酸 热硫化叶菌(鼢帕lobus acidocaldarius)分离到的DNA聚合酶能耐受100℃变 性条件的PCR反应,这种特性有助于提高PCR扩增反应的特异性以及扩增 富含二级结构的DNA序列Ⅲl。Myers和Gelfand[”1从嗜热性嗜热轩菌 (Thermus thermophillus)eO发现的Tth DNA聚合酶还具有反转录酶的活性,在 Mn2+存在的条件下该酶能有效地进行cDNA的反转录合成,通过螫合剂降低 Mn2+浓度,而加入Mg”即可促进该酶的DNA聚合活性,进行cDNA的扩增。 所有反应可在同一反应管中操作.极大地方便了cDNA的合成和扩增。在 100 121 PCR反应中1.5—2U的Taq酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根 据DNA、引物及其他因素的变化进行适当的增减。过多会使产物非特异性 增加,过少会使产量降低。 引物:由于PCR所需的一对引物只与目的基因的两个3’端互补,因此 被扩增鹩DNA总是介于两个引物结合位点之阊,不在这些位点外延僻,所 得产物大部分都一致,只有在最初的几个循环较长的非特异性扩增片段才占 有较高的比例。引物的好坏往往是PCR成败的关键,引物设计和选择目的 71 序列区域时应遵循下列原则【2 281:(1)引物中的(G+c)含量应在45%一55%, 可按下列粗略估计引物的退火温度T。=4(G+C)+2(A+T);(2)四种碱基应 随机分布,避免单一碱基或膘吟、嘧啶的连续排列,否则易在模板DNA富 含G+C的区域发生错配:(3)确保两引物之间不能发生互补,以免形成引物 二聚体,减少产量;(4)还应避免同一引物内序列的互补性:(5)引物3’端最 好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二核苷酸对应,以减少由于密码子 摆动产生的不配对,同时3’端末位碱基不应选A;(6)一对弓l物要有近似的 解链温度;(7)引物不与模板结合位点以外的序列互补,否则会产生非特异 性扩增,因为所扩增产物本身无稳定的二级结构:(8)引物长度是直接影响 PCR扩增效率和特异性的因素之一,太短会降低退火温度影响引物与模板配 对,从丽使{}特异性增大,太长则比较浪费,且难以合成。通常,弓【物长度 为】8.28个核苷酸足以克服非特异性扩增问题12…。以上原则是针对长序列引 物而言的,对长度仅为9.10个核苷酸的引物,除了引物内不能有反向重复序 列外,其突出的特点还表现在G+C的含量应高于50%13“32]引物的3’端为 G或c时可取得较高的特异性。最近的研究表明,这种短序列引物的特异性 主要取决于近3’端的6个碱基13”。一般PCR反应中的引物浓度为 O.2,1.09mol/L,引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过少则降低产 量。通过对不同引物的设计,可以产生各种改良的PCR技术。 dNTP:dNTP应用NaOH将pH调至7.0。一般反应中每种dNTP的终 浓度为20-200pmol/L。理论上4种dNTP各20p.mol/L,足以在1∞p:反应中

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合成2.6p.gDNA。当dNTP浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq酶的活性。4 种dNTP浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现错误掺入。 dNTP的浓度要尽可能低以降低非特异扩增以及引物延伸中发生的错配134‘
2S;


缓冲液:PCR反应缓冲液一般含有1 O-50 mmol/L Tris-HCI,50 mmol/L KCI,1.5 mmol/L MgCl2。缓冲液的pH值在室温下为8.4,在聚合反应的温 度条件下(724C)其pH值为7.2。缓冲液的M92+的浓度对反应十分重要。 它影响引物的退火程度、模扳与引物链的解链温度、酶的活性、酶的准确性、 产物的特异性及引物二聚体形成等诸多过程。Mg”浓度高时非特异性扩增产 物积累,浓度低时产物量下降, 因此适宜的Mg”是扩增成败的又一关键。 缓冲液中的KCI有助于引物与模板的结合,KCI的最适浓度是50 mmol/L, 高于75 mmol/L时就会抑制Taq DNA聚合酶的活性【3”。此外,表面活性剂 如明胶,牛抗血清蛋白或Tween.20等,也是PCR反应液的重要组成部分。 表面活性剂具有稳定Taq DNA聚合酶活性的作用。 模板DNA:模板DNA的纯度和浓度都会影响PCR扩增反应的特异性Iz“ 28_矾,模板DNA提取物中的抑制物质对PCR扩增效率也存在很大影响【281。

一般反应中的模板数应为102.105个拷贝,对于单拷贝基因,需要0.1烬的人 基因组DNA,10ng的酵母DNA,lng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时,
用量更少。

PCR反应三个阶段的温度和时间选择取决于引物的长度、浓度及其核苷 酸组成,以及目标DNA片段的长度和浓度。目前已有报道应用PCR技术实 现长度达10kb的DNA片段的扩增p“,但对长度为100,1000个核苷酸的目 标DNA片段,其扩增效率高而且扩增产物易于电泳分离【2”。 1.3.1.1影响PCR反应特异性的几个因素及解决方法 1、模板 模板的纯度是影响PCR反应的因素之一。制备优质的模扳是PCR扩增 成功的基础。在模板制备的过程中,最重要的是严格防止污染。对于PCR, 由于增加循环次数意味着扩大单核苷酸掺入的几率,因此,在PCR反应中, 适当增加模板数,可以削减循环次数,减少单核昔酸掺入的几率。较大的模 板如基因组DNA往往不利于扩增反应,此时可通过内切酶将其切为较小的 片段后再进行扩增【3日。对于来源于血样制品的模板,在其提取制备过程中有 效的排除抗凝剂的干扰是十分关键的p”。对于RT-PCR,如果使用肝素抗凝 剂,要保证良好的扩增效果,还必须注意有效的除去肝素的干扰P s-堋。 2、引物 引物的设计是PCR中最重要的因素之一,尤其是在采用标准化反应条 件或使用试剂盒时。引物要按照规则设计,除此之外,还可以通过对引物进 行修饰来提高PCR反应的特异性。Weigharch等人通过在引物的5’端引入一

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个与模板无配对特征的含10—15个核苷酸的尾部,这样可以使反应体系的退 火温度高于聚合温度,并相应的采用两步扩增程序,即首先引物在各自最高 退火温度下的延伸,然后在相同的退火/聚合温度下完成扩增循环。该方法能 够有效提高许多反应的特异性f40】。此外,引物的设计必须根据反应的特征和 要求选择合理的长度和修饰,有时也可以通过几对引物的不同组合筛选出其
中有效的搭配。

3、M92+浓度 M92+对PCR反应的成功是十分重要的。通常M92+浓度越低反应的特异 性越高,降低M92+浓度是最简单的提高特异性的方法。但是过低的Mg”浓 度也会对获得扩增产物起负性影响。为筛选最佳的浓度,可以首先从聚合酶 所要求的浓度开始,根据结果逐步获得最佳的反应条件。在无法单纯通过降

低Mf+浓度获得良好结果的情况下,就要考虑结合采用其他提高特异性的
方法。 4、退火温度

升高退火温度也是常用的提高特异性的方法,并且是较为有效的方法。 但是由于最佳的退火温度范围往往较窄,因此筛选到合适的退火温度有进需 要多次重复反应,目前已经有一些PCR系统,如Stratgene公司的Robocycler 可以在同一PCR反应体系中同时选择12个不同的退火温度进行,而其他的 反应条件均保持相同,所以此类的仪器有助于快速有效的筛选到最佳的退火 温度。
5、热启动 在室温下将PCR反应的各个组分混和后,容易导致非特异性扩增产物

的产生,从而影响所需产物的生成141】。此时可以采用热启动的方法加以改进, 该方法是在PCR反应体系中首先加入除Taq聚合酶以外的其他各个组分, 升高反应温度直至变性温度,在完成变性反应第一循环的即时加入所需要的 Taq聚合酶,然后继续PCR的扩增步骤。采用热启动的方法可以大大减少非 特异性反应的干扰,因此,在扩增样品数量不是很多的情况下,可以使用此
方法。

6、增效剂 在反应体系中加入某些化合物也可以提高PCR反应的特异性。最常用 的试剂是二甲亚砜(DMSO),近年来的研究表明,加入适量的甲酰胺 (Formamide)【42】、三甲铵乙内酯(Belaine)[431、四甲基氯化铵(TMCI)【44】 也有助于提高扩增的特异性。 总之,根据PCR结果的不同要求和模板的各自特点,在建立PCR时可 以采用不同的方法来提高反应的特异性,也可以将几种方法结合起来考虑。

1.3.1.2PCR技术的应用 PCR技术自闽世以来,出于其灵敏、快速、特异性高以及灵活多样雨受

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到生命科学各个研究领域的广泛重视。 l、PCR在植物病理学中的应用 在植物病理学领域,除了PCR技术在揭示寄主植物和病原物的遗传分 化以及病原物的分子检测研究中的应用潜力外,寄主植物一病原物相互关系的 研究也可望由于PCR技术的应用而得到极大的促进。比如t由于PCR技术 的应用,已经在克隆(或基因合成)病原物或病原物诱导寄主表达的基因(或 eDNA}方匿取得进震:PCR技术亦有助于构建病原物螅基因或cDNA文痒, 以及侵染过程中特异表达的奇主和病原物的基因组或cDNA文库。最近的一 些进展一比如可用于研究病原物侵染过程中特异表达的mRNA的专一性扩增 技术的建立和完善,方便了植物染病过程中特异基因的表达调控研究,为揭 示植物抗病和感痈的分子机制奠定了基础。 1.1克隆基因,进行序列分析 运用PCR技术进行某一基因的克隆和次级克隆尤为方便,目前在病毒 基因上克隆得比较多。储瑞银等(1992)【4 5】通过逆转录大豆花叶病毒RNA,利 用PCR技术,克隆了一个O、8kb的外壳蛋白基因,对其进行了序列分析。有

关特异性基函酌克隆及其序弼分析,在烟荤花叶病毒(TMV)【…、水稻矮缩病
病毒【47】等病毒上也做了许多工作。除对病原的特定基因进行研究外,近年来, 运用PCR技术分离、克隆植物抗病基因的研究也有不少,吴玉良等(1998)一研 运用该技术对水稻抗瘟性基因进行了研究。 I.2鉴定抗病基因 传统的植物杂交育种是根据植物的表现型来进行选择。由于这种选择往 往要受到环境条件的影响,早期很难对其农艺性状的表现做出准确判断,极 大地限制着作物育种的速度。但是,目前通过利用遗传标记对目标性状进行 选择.则大大地提高育种效率。1994年,陆军等【49’50】就以水稻种子DNA为 模板进{亍过RAPD分析,鉴定了种子的抗,感病基因,提出用分子手段泉标 记水稻抗瘟病基因,以进行品种抗性的鉴定。郭金乎(2001)p”根据甜菜抗

胞囊线虫病基因的保守序列区域,设计合成了一对630bp特异扩增引物,以 甘薯总DNA为模板进行PCR扩增,其产物在抗/感病品种间能表现出差异, 利用这种差异来进行品秸抗矬的分子鉴定。 I.3病原菌的分类、鉴定 无论是真菌、细菌、病毒,还是线虫的分类,传统的方法不仅主观、繁 杂,而且难以可靠地分析和鉴别近似种间和种内生理小种或致病型间存在的 差异。难以揭示种群在进化过程中的亲缘关系。然而,多聚酶链式反应技术 则能有效地加咀解决,在真菌分类与签定中,PCR技术更有独到之处。目前, 国内外对有关病原菌菌种、生理小种亲缘关系方面的研究较多。刘学敏等 (1997)[52】利用RAPD对我国东北的大豆灰斑病菌(Cercosporidium sojinum)10 个生理小种进行了基因组的DNA多态性分析,在聚类分析基础上确立了它

{『j阊的亲缘关系。秦国夫(1996)c玎l、躅永力等(t99∞㈣对蜜环菌和球壳孢菡

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分别进行过类似的研究,确立了部分生理小种间的亲缘关系。在林业病害研 究中,有人通过随机扩增DNA多态性水平上的遗传分析,对国内的3种松 干锈菌进行了研究,确立了它们的亲缘关系【5“。有关它在病原菌分类鉴定上 的应用,目前也有不少报道。利用RAPD分析能成功地鉴定4种常见的根结 线虫一南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫。 1.4病原的检测、鉴定 使用的引物不同,PCR扩增后的产物也不同。选择某一特定的引物,我 们就能扩增得到相应的DNA片段,这也是PCR技术用来检测、鉴定病原的 机理所在。朱有勇等(1999)[561根据棉花黄萎病菌(Verticillium dabliae)核糖体 基因ITS区段的碱基编码序列,设计合成了1对26bp的PCR特异扩增引物, 进行了大丽轮枝病菌PCR特异扩增试验,证明利用上述设计合成的引物能 对棉花黄萎病菌进行分子鉴定和分子检测。目前PCR技术对病毒、类菌质 体两类病原的检测上应用得较多。肖火根等(1999)1571建立了PCR扩增检测香 蕉组织和单头蚜虫内的香蕉束顶病毒(BBTV)。王克日(1995)9…、李江山 (1996)t59】认为利用PCR技术扩增16 SrDNA可对泡桐丛枝病病原菌MLO进 行检测,具有很高的灵敏度。邓晓玲(1999)旧…,孔维文等(2000)1611和田亚南 冬乎(2000)1 621利用PCR技术研究柑桔黄龙病时同样发现,利用PCR技术能在 未显症状前检测出病原,而且准确、快速、方便。 PCR技术的应用已使植物病理学的中心问题可望在更精确的水平得到 阐明。随着PCR技术的应用和发展,必将推动对植物病原物群体遗传学、 生态学、分子进化、毒性变异的本质和规律、植物一病原物相互作用的分子 机制、植物抗病性的发掘利用,以及化学农药的开发和合理组合使用等研究, 从而促进对植物病害发生的本质和规律的认识,提高对病害的控制水平。 2、PCR在国内农业研究中的应用 国内自90年代起,PCR技术已被应用于农业科学方面的基因检测、遗 传分析、微生物检测等研究实践中。 李育庆等(1992)163】用这项技术检测了小麦高分子量谷蛋白亚基基因片 段,并对它作了克隆和序列分析。陈忠英等(1994)阻4】通过分析与基因家族同 源的互补DNA片段,证明了在水稻中存在Ras类蛋白基因家族和G蛋白基 因家族。陆朝福等(1996)[65】利用一个含Xa21(水稻白叶枯病抗性基因之一)基 因的水稻品系IRBB21分别与2个感病品种杂交获得F2群体,用4对引物 分别对3个亲本进行分析,其中一对引物(PB78)的PCR产物在抗/感病品种 间可揭示多态性。对2个F2群体进一步的遗传分析表明,PCR标记与Xa21 的白叶枯病抗性紧密连锁,其重组率仅为2.48%。根据该标记选择基因型 纯合的抗性植株,其准确率可达100%。 目前而言,PCR技术应用于国内农业科学研究的实例虽然不多,但它们 丰富了分子生物学的内容,对引导我们及时采用现代分子生物学方法和手段 从事农业科学研究具有重要的启发、示范作用。

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1.3.1.3PCR技术的展望 由于PCR在获得目的基因中有巨大作用,因此从PCR诞生到今天,有 关PCR的新仪器、新方法层出不穷。人们不仅可以直接克隆目的DNA,而 且可以RNA为模板通过反转录先获得互补DNA(cDNA),然后再对cDNA 进行PCR(逆转录PCR);人们不仅可以对已知序列的DNA进行PCR,而且 可以扩增已知序列两端的未知序列(反向PCR);同时,人们还可以扩增那些 只知一端序列的目的DNA(锚定PCR)。 最近发展的PCR新方法更使分子生物学家们如鱼得水【6…。比如“多重 PCR”可以在一个反应管中使用多套引物,针对多个DNA模板或同一模板 的不同区域进行扩增,满足同时分析不同DNA序列的需要,尤其是在临床 检测和科学研究时,在一个反应管中能够同时检测多种目的DNA,这不仅 能节省实验样品,而且能使以往繁琐的操作变得省时省力,多重PCR已被 成功的应用到生物学的多个方面,如各类病原的检测与鉴别、遗传疾病诊断、 以及基因缺失、突变和多态性分析等;用硅制薄片制作的反应器取代传统的 塑料小管而建立起来的“PCR芯片”,则具有反应体积小,加热效率高等特 点,但在PCR芯片中,有人甚至提出研制“纳米PCR芯片”,它将比目前的 PCR芯片在空间尺度上小三个数量级,反应所需求的材料以及起始样品量将 大幅度减少,由于芯片的微型化,其热循环效率也必将大大提高。而目前发 展的“电子PCR”则将计算机与PCR联系在一起,利用相应的“电子PCR” 软件,在短时间内,对待测序列进行成千上万次不同的电子PCR分析,假 阳性率等于零,假阴性率等于零,适应了现代基因组研究的大规模分析的需 要。所有这些使得PCR越来越成为科学家们得心应手的不可缺少的工具。

Southern杂交的研究现状 Southem杂交是最基本的技术之一,很多植物分子生物学技术,如RFLP 分析、克隆鉴定、品种鉴定等都要用到它。该技术的优点在于其技术成熟, 灵敏度高,重复性好。 所谓Southern杂交是指将DNA片段从琼脂糖凝胶转移若固定在硝酸纤 维素膜或尼龙膜上,然后用同位素或非同位素标记的已知序列的探针进行杂 ’交,最后经放射自显影或显色反应进行检测。该项技术自1975年由Southern 建立以来几乎没有什么大的改动。唯一的明显改变就是用尼龙膜代替了硝酸 纤维素膜,相比之下,尼龙膜更易于处理,更加牢固,DNA结合效率也更 高,尤其是在低离子强度缓冲液中更是如此。
1.3.2

1.3.2.1探针的标记 探针是核酸分子杂交及分子标记研究进行的必要前提。在Southern blot、 Northemblot、ALFP、RFLP、RAPD、SSR等技术中得到了广泛应用。从化

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学和生物学意义上理解,探针是一种分子,它带有供反应后检测的合适标记
物,并与特异靶分子反应。抗体.抗体、外源凝集索一碳水化合物、亲合素一生 物素、受体一配基(Ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针.靶分子反应, 蛋白质探针(如抗体)与特异靶分子是通过混合力(疏水离子和氢键)的作 用在少数特异位点上的结合,而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的
长短不同,通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决定了它的 特异性。 基因探钊‘根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大

类,根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、 cRNA探针及寡核苷酸探针等几类,其中DNA探针还有单链和双链之分。 分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式,是核酸的重要理化 特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测,必须将杂交链中 的一条用某种可以检测到的物质进行标记,这条链就称为核酸探针。因此, 核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也 是目前最常用的核酸探针标记方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P 因其能量高,信号强,所以最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高, 但却存在辐射危害和半衰期限制(32P半衰期为14.3天,35S半衰期为87.1 天,125I半衰期为60天),3H的半衰期长达12t3年,但它所释放B射线的 能量太低,只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存 在着上述缺点,近年来,人们在寻找非放射性标记物方面取得了很大进展。 国内已具备生物素类标记物的生产能力,并有相应试剂出售。目前非放射性 标记物有下述几类:金属如Hg、荧光物质如F2TC、半抗原如地高辛、生物 素、酶类如辣根过氧化物酶(HI冲)、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶(AKP)等, 不同的标记物,所标记探针的方法及检测方法也各异。 核酸探针的常用酶促标记技术有:缺口平移;DNA快速末端标记;用 T4多核苷酸酶标记DNA 5’末端,随引物延伸;聚合酶链反应。 核酸探针的非放射性标记技术有:光促生物素标记核酸、酶促生物素标 记核酸、寡核苷酸的生物素末端标记、酶标DNA、酶标寡核苷酸、DNA半 抗原标记。
1.3.2.2核酸分子杂交方法 随着基因工程技术的发展,新的核酸分子杂交技术不断出现和完善,核 酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交 是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上,?条反应核酸链游离在 溶液中,固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板 等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 在固相杂交中,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交 物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点,所以比较常用。常用的固相

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杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组 织原位杂交和夹心杂交等。 液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型,由于液相杂交后过量 的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高,所以不如固相杂交那样普 遍。近几年由于杂交检测技术的不断改进,商业性基因探针诊断盒的实际应 用,推动了液相杂交技术的迅速发展。

1.4我国甘蔗线虫病研究概况 1.4.1本研究的目的和意义 甘蔗线虫病在我国和世界许多蔗区均有发生,在我国尤以根结线虫病更 为严重。侵染甘蔗的根结线虫共有6个种:南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和爪畦根结线虫(脱javanica)是甘蔗田中常见的种类,分布于 世界各地,花生根结线虫(M arenaria)分布于澳大利亚、斐济、波多黎各、 台湾等地,泰晤士根结线虫(M hispanica)和吉库尤根结线虫(M kikuyensis)
分布子南非婶1。

南方根结线虫以二龄幼虫侵染甘蔗幼嫩新根,侵入后寄生在根皮层与中 柱之间.并诱发中柱形成5-6个巨型细胞。由于巨型细胞的形成及细胞过度 分裂,甘蔗根尖部分延长肿胀且明显弯益,并在根上形成大小不等的根瘤, 在瘤上长很多小根。同时,由于根结线虫刺激侧根增生,致使严重感病植株 。根过度增生成乱发状的须根团。病根变赤褐色,最后腐烂。由于根系受到破 坏,根部吸收机能受影响,从而使植株地上部表现为缺肥、缺水状,主茎细 而短。有效茎数减少,植株短小,生势衰弱等症状【681。 据报道,根结线虫引起甘蔗产量损失达6%-9%I”】,1985—1986年全世界 因此病使甘蔗损失270万吨p”。在部分地区,胞囊线虫也会严重制约甘蔗的 产量【70J。 目前,我国采用的线虫防治方法一般为4种,分别是化学药剂防治、轮 作防治、生物防治和选育抗病品种。其中生物防治作用小:轮作防治虽被广 泛使用,但有一定的局限性,它不适应于寄主范围较宽的根结线虫的防治: 而化学药剂的大量使用不仅费用昂贵,而且造成相当严重的环境污染。因此, 筛选利用抗病品种是最经济、最有效的防治方法,不但能提高产量,增加经 济效益,而且对净化土壤,保护生态环境都具有深远的意义和应用价值。近 些年来,国外特别是欧洲各国都投入相当大的人力物力研究防治各种线虫病 的难题,其中尤其注意各种作物的抗线虫病育种,而我国在这方面的研究做 得还不多。现在,常用的筛选抗病品种的方法主要是利用田间鉴定,此方法 虽然准确率高,但难度较大,而且较费时间。如何才能实现既快又准确的挑 选抗病品种是目前急德解决的一个问题。线虫病是土传病害,不论水田还是 早地都会发生,特别是年年连作的旱地、设施栽培的基质,虫口密度都很高。

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甘蔗是生长速度很快的C。作物,它的生长时间长,可以多年宿根种植。线虫 病同样是宿根甘蔗连作减产的主要原因之一。但目前除印度有零星报道外, 国内外还未见对甘蔗线虫病的相关报道,特别是在甘蔗抗线虫病品种分子鉴 定上,还没有人做过研究。因此,本研究应用PCR技术及Southern杂交技 术等手段对甘蔗品种资源进行检测,目的是从现有甘蔗品种资源中快速而准 确的筛选出抗线虫病的种质资源,为今后甘蔗抗线虫病品种选育和高产优质 栽培提供理论依据。 1.4.2本研究的技术路线

2.材料和方法
1,1供试材料

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2.1.1植物材料 本研究以43份未经过线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为材料,供试材 料来自于福建农林大学甘蔗综合研究所。
2.1.1.1原种和野生种 l、松溪竹蔗:2、滨湘竹蔗:3、福建大野;4、大野Fl:5、割手密;6、Badila 2.1.1。2栽培品种 1、福农81.745;2、福农91-4710;3、福农95—1702;4、福农91.4621;5、 福农94.0403;6、ROCl6;7、ROCl0;8、粤C25;9、粤92/373:10、粤 糖91/854;11、湛93—159;12、云92/19;13、川89/103;14、闽糖86/2121: 15、闽糖93/246 2.1.1.3亲本品种 1、COl001:2、CP65.357:3、CP72—1210:4、CP84。1198;5、崖71—374: 6、崖82-96;7、崖90—3;8、桂73—167;9、ROCll;10、科5:ll、湛74.141

2.1.1.4引进品种
1、U¥90—1013:2、CP00—2047 6、US87.1036 3、LCP85-384;4、CP88-1762;5、HOCP91—555

2.1.1.5果蔗品种 1、巴布亚新几内亚果蔗;2、大田雪蔗;3、温岭果蔗;4、红叶蔗;5、同 安果蔗 2.1.2生化试剂和仪器 Taq酶、dNTP、Marker、饱和酚、SDS、Tris均购自上海生工有限公司, 引物由上海生工有限公司合成,EB购自瑞典Phamacia公司,PCR产物回收 和纯化试剂盒、琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司,地高辛标记DNA捡 一?测试剂盒购自德国Roche公司,其它常用试剂均为国产分析纯。 PCR仪为美国PE公司9600型,高速冷冻离心机分别为美国Beckman 公司Avanti30型和德国Hittchi公司LBA 12R型,紫外/可见光分析仪为 Beckman公司DU.640型,凝胶图像扫描系统为法国VIL公司TFP.M/WL型。 2.2方法
2.2.1DNA提取纯化方法

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2.2.1.1

DNA的提取 甘蔗基因组DNA的提取参照SDS提取法171 J: 1.59经去淀粉处理(实验之前将植株于暗处放置24h即可达到去除淀粉目 的)的新鲜植物材料用液氮速冻,然后在研钵中将其磨碎成细粉。 2.将冷冻粉末转移至一50ml离心管中并加入15ml SDS提取缓冲液
(500mmol/LNaCl,100 mmol/LTris.HCI(pH8.01,50 mmol/LEDTA(pH8.O),

2-巯基乙醇(用前加入)),轻轻旋转混匀,65℃保温20min并不 时轻轻旋转混匀。 3.加入5ml 3mmol/LKAc,混匀后冰上放置20一30min。
10 mmol/L

4.在250009、4℃中离心20min。

5.上清用双层Miracloth纱布过滤。转移至一干净的50ml离心管中。 6.加入10ml异丙醇,轻轻颠倒混匀,.20℃放置40min沉淀核酸。

7.挑出并晾干沉淀至一Eppendorf管中,再用7009l 50xTE缓冲液(50 mmol/LTris—HCl pH8.0)溶解沉淀。
DNA的纯化 1.加入79l RnaseA贮液,37℃保温1h。 2.加入759l 3mol/LKAc,轻弹混匀,离心15rain沉淀不溶性杂质。 3.上清转移至一装有5009l异丙醇的干净管中,轻轻混匀,室温下放置
2.2.1.2 5min。

4.微量离心机离心15min沉淀DNA,去上清并用5009l 70%乙醇清洗沉淀。 5.再次离心5rain,用巴斯德玻璃吸管吸去乙醇,沉淀物溶解于300p,1 TE 缓冲液中,加入1倍体积的饱和酚,轻轻混匀。 6.离心10min,静置取上清,加入等量氯仿,轻轻混匀。 7.离心10rain,静置取上清,加入2倍体积的无水乙醇,轻轻颠倒混匀, 一20℃放置40min沉淀核酸。 8.挑出沉淀,加入5009l 70%乙醇清洗DNA,晾干。

9.加入1509l灭菌双蒸水,保存于4。C。
2.2。2弓l物设计
2.2.2.1

根据番茄抗根结线虫病基因Mi的碱基序列,按照引物设计的原则,结 合保守序列区域,设计了4条用于扩增与该抗线虫病基因同源DNA片段的 寡聚核苷酸引物,序列如下: 上游引物:Pl:5’AGACAGTATGGACCAAAAGAATGG3’ P::5’C从CA研ATGATGTGG从AAcTGC3’
下游引物:P3:5’GAAGGAGCAGAAGAATTAGAAAGC3’

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P4:5 AGGATCACTCACTGAAGACGAGC3



2.2.2.2

根据甜菜抗胞囊线虫病基因Hsl P”。的碱基序列,按照引物设计的原则, 结合保守序列区域,设计了4条用于扩增与该抗线虫病基因同源DNA片段 的寡聚核苷酸引物,序列如下: 上游引物:SPl:5’TGCGAATGGAGAACATGATACTACC3’
SP,:5’TTGAATcTGCTATGAGAAGGTGTGG3’

下游引物:SP3:5’AGACTCAGTAGAACCACCAATcACA3’
SR:5’CI_rGTGCCGTAGATCCTTGCTTAAT3’

2.2.3PCR扩增和电泳
2.2.3.1

PCR反应体系

反应总体积为20pl, 10mmol/L Tris—HCI(pH8.31
50mmol/LKCl 2.0 mmol/L MgCl2 100/amoI/L dNTP

0.2p_mol/L上游引物 0.2pmol/L下游引物 .40ng模板DNA 1.0UTaq酶 其余用灭菌双蒸水补足。 2.2.3.2反应程序 将样品放入DNA扩增仪中进行PCR扩增,反应程序为
94℃5min 94℃40s]

60℃50s'35 cycles 72℃90s J

72℃延伸10min 2.2.3.3结果记录 扩增产物经含有O.5p.g/mL溴化乙锭的l,5%琼脂糖凝胶电泳 90min(5V/crn)后在凝胶成像系统上观察并照像记录。
2.2.4

PCR.Southern杂交‘72

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第20顶

2.2.4.1杂交溶液的制备
1.Maleic acid buffer:0.1M Maleic acid,0.15M NaCl,pH7 5(20℃)
2.Detection buffer:0.1M Tris—CI,0.1M NaCl,pH9.5(20"C)

3.TE.buffer:10raM Tris—CI,lmM EDTA,pH8.0
4.Blocking Solution:Diluting the 10xBlocking Stock Solution l:10 in Maleic acid buffer 5.Antibody Solution 6.Color-substrate Solution:Add 409l of NBT/BCIP Stock Solution to 2ml of Detection buffer Solution:Diluting Anti-Digoxigenin-AP 1:5000 in Blocking

2.2.4.2目的基因片段的回收 1.利用特异引物P2P4、SP2SP3扩增DNA,扩增出抗线虫病的目的基因片段, 作为制作探针的模板DNA。 2.将PCR产物使用低熔点胶进行凝胶电泳后,用干净的手术刀切下含有目 的DNA片段的琼脂块,放入1.5ml Eppendof离心管中。 3.反应管中加入约6009l的NaI溶液,55℃水浴中加热10分钟使胶完全溶 解。加入30/al硅胶树脂后,充分混和,室温放置20分钟。 4.离一11,(10,000rpm lmin)后,除掉上清,在反应管中加入5009l洗净用缓 冲液(浓缩缓冲液与100%乙醇等体积混合),振荡搅匀后离心(10,000rpm lmin),除掉上清。 5.加入灭菌双蒸水后混匀,55℃水浴中放置5分钟,离心(10,000rpm lmin),

回收上清液,此上清液即为回收的DNA溶液.回收后的浓度大约为25ng/I.tL。
2.2.4.3探针的制备 1.取4t.tl回收模板DNA与灭菌双蒸水混匀,使最终体积为16I_tl。 2.将DNA在沸水浴中加热10分钟,然后迅速转入冰浴冷却,使DNA充 分变性。(注意:完全的变性是有效标记所必须的)。 3.将地高辛引物彻底混匀,并加入49l体积到变性的DNA之中,混合后, 短暂离心。 4.在37℃水浴中温育,过夜,反应20小时。 5.取出反应管,加入29l 0.2M EDTA,放入65。C水浴中保温10分钟,终止 反应.,并按试剂盒提供的反应曲线图,估计标记的量,然后放在.20"C条件 储存备用。 6.取19l^DNA/EcoRI+HindlII,浓度为100ng/pL,制作^DNA/EcoRI+Hind IIIMarker探针,步骤同1—5。

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第2I页

2.2.4.4转膜 1,特异PCR扩增后,将PCR产物点样于浓度为1,5%的琼脂糖凝胶上,然 后在3V/cm的电压下电泳1小时。 2.电泳完毕后,在紫外灯下用锋利刀片修去凝胶的无用部分,在凝胶左上 角(加样孔一端为上)切去一角,以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。 3.将凝胶置于数倍体积的l,5mol/LNaCI,O.5mol/LNaOH中浸泡45分钟并

在摇床上温和的不断振荡,使DNA发生变性。
4,将凝胶置于去离子水中稍事漂洗,随后浸泡于数倍体积的1mol/LTris—CI (pH7.4),1.5mol/L NaCI中,于室温下温和的不断振摇,使凝胶中和,更换 中和液,将凝胶继续浸泡15分钟。 5.当凝胶仍浸于中和液时,用两张灭菌后的滤纸包裹一块有机玻璃.做成 一个长和宽均大于凝胶的平台。将包裹住的平台放入一个大干烤皿内,倒入 转移缓冲液(20×SSC),使液面略低于平台表面。当平台上的滤纸湿透后,

用玻璃棒赶出所有的气泡。
6.用一把新的解剖刀裁一张尼龙膜。(注意:膜的长度和宽度应分别比凝胶 大1mm,接触尼龙膜须戴手套或用平头镊子,甩有油腻的手接触过的尼龙膜 不易浸湿)。 7.将尼龙膜浮在去离子水表面,直至尼龙膜从下向上湿透为止,随后用20 ×SSC浸泡尼龙膜至少5分钟,用一干净的解剖刀片切去尼龙膜的一角,使 其与凝胶的切角相对应。 8.从中和液中取出凝胶,将凝胶翻转以使其背面向上。把凝胶放入平台上

湿润的滤纸中央,赶出滤纸和凝胶之间的气泡。 9.用Parafilm膜围绕凝胶周边,但不是覆盖凝胶,以此作为屏障,阻止液
体自液池直接流至凝胶上方的纸层中。
lO. 在凝胶上方放置湿润的尼龙膜,并使两者的切角相重叠。尼龙膜的 一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。(注意:尼龙膜置于凝胶

表面适当位置后,就不应轻易移动,尼龙膜与凝胶之间不应留有气泡。) 11. 用20×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的滤纸,湿润的滤纸放置 在湿润的尼龙膜上方,用玻璃棒赶出其闻滞留的气泡。 12. 切一叠(5-8cm高)略大于滤纸的纸巾,将其放置在滤纸的上方,并 在纸巾上方放一块玻璃扳,然后用一5009的重物压实。
13.

建立液体自液池经凝胶向尼龙膜的上行路线,以洗脱凝胶中的变性 使上述DNA转移持续进行8小时以上,其间,每当纸巾浸湿后.应

DNA,并使其聚集在尼龙膜上。
14.

更换新的纸巾。 15. 转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和滤纸,翻转凝胶和尼龙膜,以 凝胶的一面在上.置于一张干的滤纸上,用一支极软铅笔或圆珠笔,在尼龙 貘上标记凝胶加样孔的位置。

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从尼龙膜上剥离凝胶弃之,于室温下用6×SSC溶液浸泡滤膜5分钟, 除去粘着在尼龙膜上的凝胶碎片。 】7. 从6×SSC溶液取出尼龙膜,将尼龙膜上的溶液滴尽后平放在一张纸 巾上,于室温下晾干30分钟咀上。 18. 将晾干的尼龙膜放在两张滤纸中间,用烘箱于80℃干烤2小时。
16.

2.2.4。5杂交 1.在杂交袋中预热适量体积的杂交液至40"C(按10ml/100cm2尼龙膜加入)

不敷出,然后将尼龙膜封入杂交袋中,留一小口,赶尽气泡,封口,再套一
个杂交袋封口后,放入恒温水浴摇床中,40℃下预杂交30分钟。 2,与此同时,在另一杂交袋中预热适量杂交液(按3,5ml/100cm2尼龙膜加 入),并按20.25ng/ml取出探针在沸水浴中变性5分钟,然后迅速置于冰上 冷却3分钟,再加入到预热的杂交液中混合,但要避免起气泡。 3.从预杂交的杂交袋中取出尼龙膜,迅速放入到加有探针的杂交液中,赶 尽气泡后封口,再套入一个杂交袋,封口后在40℃下杂交6-8小时。 2.2.4.6洗膜 1.准备好适量的洗膜液1(2×SSC,O.1%SDS)。 2.剪去杂交袋的一角,倒出杂交液,用过的杂交液可于4"C或.20"C长期保 存,还可用于该探针的再杂交,沿三条边剪开杂交袋,取出膜并立即浸入一 装有数毫升洗膜液的浅盘中, 3.将膜转移至另一装有足量洗膜液的培养皿中室温下轻摇5rain。 4.重复步骤3。

5.将膜转移至一装有足量洗膜液2(0.5XSSC,0.1%SDS)的培养皿中,
65"C保温15min。 6.重复步骤5。 注意:洗膜过程的任何时候都不应使尼龙膜完全干透,取膜时应用平头镊子。 2.2。4.7显色 1.杂交和严格洗膜之后,在Washing Buffer中简单漂洗1—5分钟。 2.转移膜到50ml Blocking Buffer中,温育30分钟。 3.转移膜到20ml Antibody Buffer中,温育30分钟。 4.转移膜到50ml Washing Bufier中,洗膜15分钟。 5,重复步骤4。 6.转移膜到20ml
Detection

Buffer中,平衡2-5分钟

7.转移膜到10ml新鲜Color Substrate Solution中,在黑暗中温育16小时, 在显色过程中不要摇动。 8,当条带出现压,中断反应,用50mlTE缓冲液洗膜5分钟。

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第23页

9.在ViberLourmatVDS凝胶成像系统上照相并记录结果。

3.结果与分析
3.1

PCR特异扩增影响因素分析

甘蔗野生种松溪竹蔗号称“松溪百年蔗”,经百年宿根至今依然生长良 好,表现出较强的抗病虫害能力。因此,本实验所做的分析均以野生种松溪 竹蔗为模板DNA。 3.1.1模板DNA浓度的影响 将模板DNA稀释为一定的梯度进行扩增。以确定最佳DNA用量,模板 梯度依次为0,5,15,40,60。100ng/p.L。每201sl反应体系加入1“1上述 模板,反应结果见图1。

图1模板DNA浓度对PCR扩增的影响
Fig,1 Effects oftemplate DNA with different concentrations
on

PCR results

从左到右:M,50bpDNAladder:LI,0:L2,5:L3t

15:L4,40;L5,60:L6,100 ng/uL

结果表明:模板DNA浓度在15—100ng/I_tL之间,均能扩增出条带,但 浓度为15ng/laL时,扩增产物产量很少,导致条带很弱,浓度在40一IOOng/pL 之间时,条带都很清楚,因此实验时采用40ng/laL对PCR扩增比较适宜。
3.1.2

Taq酶浓度的影响

为了选择合适的Taq酶浓度,设计了7个浓度梯度,分别为0,O.5,1.0 1.5。2.0,2.5,3.0U,反应结果见图2,

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图2不同Taq酶浓度对PCR扩增的影响
Fig.2 Effects of Taq DNA polymerase concentrmions
on

PCR results

从右到左:M.50bp
2.5:b,3.0 U

DNA ladder;Lt,O;L2,O.5;L3,1.O:L4,1.5;L5,2.0;L6

结果表明:Taq酶浓度在O.5-3U之间,均会扩增出条带,但浓度为O.5u 时,条带较模糊,浓度在1.5—3U之间,会产生一些非特异性条带,因此从结 果的特异性及经济节约角度考虑,Taq酶宜采用1.0 U/20pL反应体系较为合 适。 3.1.3引物浓度的影响 引物浓度不同会产生不同的扩增效果,共设计了8个浓度梯度,分别是 0,0.1,0.2,O.3,0.4,O.5,0.6,O.79mol/L,反应结果见图3。

图3不同引物浓度对PCR扩增的影响
Fig.3 Effects ofprimer concentralions
on

PCR results

从左到右:M,50bpDNAladder;Li-0;L2t
0.5:L1,0.6:L8,O.7pmolFL

0.1;L3?0.2;L4,0.3:L5,O.4;L6

结果表明:引物浓度在0.1.0.79mol/L之间,均有特异扩增条带,但浓 度为0.Igmol/L时,引物与模板结合位点太少,扩增条带较弱,因此,综合

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第25页

考虑,引物浓度宜采用0.2pmol/L。
3.1.4

dNTP浓度的影响

dNTP量的多少会直接影响到PCR扩增产物的产量以及特异性,因此本 实验共设计了7个浓度梯度,分别是0,50,100,150,200,250,300pmol/L, 反应结果见图4。

图4不同dNTP浓度对PCR扩增的影响
Fig.4 Effects ofdNTP concentrations
on

PCR results

从左到右:M,50bpDNAladder:Ll,0;L2,50:L3,100:L4,150;b,200:L6
250:L',300pmol/L

结果表明:dNTP浓度为50—100pmol/L时,产生的特异条带较弱。 150.30Qamol/L时差异并不显著,随着dNTP量的增加,扩增产物也会增加,

但dNTP浓度过高时,容易与M92+结合而降低游离M92+浓度,从而影响豫g
酶的活性,因此dNTP浓度以150I_tmol/L为宜。 3.1.5退火温度的影响 退火温度的高低会直接影响PCR扩增的特异性,因此本实验共设计了9 个温度梯度,分别是53,54.6,55 反应结果见图5。
8,57.1,58.4,59.8,61.1,62.2,63。C,

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第26页

图5退火温度对PCR扩增的影响
Fig.5 Effects ofannealing temperatures
Oll

PCR results 8:L4,57.1:L5,58.4

从左到右:M,50bpDNAladder:Ll,53:L2?54.6;L3,55
L6,59.8:L7,61.1:L8,62.2;L9,63"(2

结果表明:退火温度在53—58.4℃之间时,有很明显的非特异条带产生。 随着退火温度的逐渐升高,杂带逐渐消失,温度在58.4—62.2℃之间时,条带 明显且没有任何杂带。但退火温度继续升高,条带则逐渐变弱,当温度达到 63"13时,单一条带变模糊。因此,将退火温度设定在60’C。 3,2引物筛选 3.2.1抗根结线虫引物筛选 以野生种松溪竹蔗为模板DNA,按照以上PCR扩增的条件,对2条上 游引物和2条下游引物进行排列组合,共产生4对引物组合,分别是P1 P3、 PlP4、P2P3、P2P4,由图6中可以看出,只有P2P4这对特异引物产生较清楚 的单一条带,大约为460bp,而其它的引物组合并没有出现任何特异条带, 只出现一些模糊的非特异扩增条带。

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第27员

图6抗根结线虫引物的筛选
Fig.6 Selection of root—knot nematode resistant primers

从左到右:M,50bp DNA ladder;Ll,PlP3;L2,PIP4:L3,P2P3;L4t

P2P4

3.2.2抗胞囊线虫引物筛选 以野生种松溪竹蔗为模板DNA,按照以上PCR扩增的条件,对2条上 游引物和2条下游引物进行排列组合,共产生4对引物组合,分别是SPlSP3、 SPlSP4、SP2SP3、SP2SP4,由图7中可以看出,只有SP2SP3这对特异引物产 生较清楚的单一条带,大约为690bp,而其它的引物组合并没有出现任何特 异条带,只出现一些模糊的非特异扩增条带。

图7抗胞囊线虫引物的筛选 从左到右:M,50bp



Fig.7 Selection ofcyst nematode resiNant primers DNA ladder;Li,SPISP3:L2,SPISP4;L3,SP2SP3;L4,SP2SP4

3.3甘蔗PCR特异扩增产物的分析

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第28贝

3.3.1原种和野生种特异扩增产物的分析 3.3.1.1用P2P4这对特异引物对6份甘蔗原种和野生种的基因组DNA 进行PCR扩增,反应结果见图8。

图8.6份原种和野生种总DNA的PCR扩增产物
Fig.8 PCR products ofsix original and wild sugarcane DNA

从左到右:M,50bpDNA Ladder;Ll,松溪竹蔗;L2,滨湘竹蔗;b,福建大野;L4

大野Fl:L5,割手密;L6,Badila

结果表明:松溪竹蔗、滨湘竹蔗、福建大野、大野F-、割手密均出现了 大约为460bp的单一条带,说明这5份甘蔗可能是抗根结线虫病的;而Badila 没有出现任何条带,说明它可能是不抗的。 3.3.1.2用SP2SP3这对特异引物对6份甘蔗原种和野生种的基因组DNA 进行PCR扩增,反应结果见图9。

图9.6份原种和野生品种总DNA的PCR扩增产物
Fig.9 PCR products ofsix original and wild sugarcane DNA

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第29页

从左到右:M,50bp

DNA

ladder;Ll,松溪竹蔗;L2,滨湘竹蔗:L3,福建大野:L4

大野F1;L5,割手密;L6,Badiia

结果表明:松溪竹蔗、滨湘竹蔗、福建大野、大野FI、割手密、Badila 均出现了460bp的单一条带,说明这6份甘蔗可能都是抗胞囊线虫病的。 3.3.2甘蔗栽培品种特异扩增产物的分析 3.3.2.1用P2P4这对特异引物对15份栽培品种的基因组DNA进行PCR 扩增,反应结果见图lO。

图10.15份栽培品种总DNA的PCR扩增产物
Fig.10 PCR products offifteen cultivated sugarcane DNA

从左到右:M,50bp

DNA

ladder:Ll,福农81—745;L2,福农91—47lO;L3。福农95一t702:

L4,福农91.4621;L5,福农94.0403;L6,ROCl6:L7,ROCl0:Ls,粤C25:L9,粤 921373;L…粤糖911854:L¨,湛93-159:L12,云92119:L13,川89/103:L14,闽糖 86/2121;Lm闽糖931246

结果表明:栽培品种福农81-745、福农91-4710、福农95—1702、福农 91—4621、福农94.0403、ROCl6、ROCl0、粤C25、粤92/373、粤糖91/854、 湛93.159、云92/19均出现了大约为460bp的单一条带,说明这12份甘蔗 可能是抗根结线虫病的;而川89/103、闽糖86/2121、闽糖93/246没有出现 任何条带,说明这3份可能是不抗的。 3.3.2.2用SP2SP3这对特异引物对15份栽培品种的基因组DNA进行PCR 扩增,反应结果见图11。

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第30页

图11.15份栽培品种总DNA的PCR扩增产物
Fig 1 1 PCR products of fifteen cultivated sugarcane DNA

从左到右:M,50bp DNA ladder;L】,福农81.745;L2,福农91—4710;L3,福农95.1702; L4,福农91.4621;L5,福农94-0403:L6,ROCl6;L7,ROCl0:L8,粤C25;L9,粤 92/373:LIo,粤糖91/854;Lll,湛93—159;L12,云92/19;Ll 3,川89/103:L14,闽糖 861212l;L…闽糖93/246

结果表明:栽培品种福农81-745、福农91—4710、福农95.1702、福农 91—4621、福农94。0403、ROCl6、ROCl0、粤C25、粤92/373、粤糖91/854、 湛93—159、云92/19、川I 89/103均出现了大约为690bp的单一条带,说明这 13份甘蔗可能是抗胞囊线虫病的;而闽糖86/2121、闽糖93/246没有出现任 何条带,说明这2份可能是不抗的。 3.3.3甘蔗亲本品种特异扩增产物的分析 3.3.3.1用P2P4这对特异引物对11份亲本品种的基因组DNA进行PCR 扩增,反应结果见图12。

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第31页

图12
Fig.12

11份亲本品种总DNA的PCR扩增产物
PCR products ofeleven parent sugarcane DNA

从左15右:M,50bpDNAladder;L1,COl001:乙2,CP65—357;L3,CP72?1210:b CP84.1198;k,崖71.374;L6,崖82?96;L7,崖90—3;L8,桂73一167;L9,ROCll LIo,科5:LIl,湛74-141

结果表明:亲本品种C01001、CP65—357、CP72-1210、CP84—1198、崖 71—374、崖82—96、崖90.3、桂73.167、ROCtl、科5均出现了大约为460bp 的单一条带,说明这10份甘蔗可能是抗根结线虫病的:而湛74-14l没有出 现任何条带,说明这个品种可能是不抗的。 3.3.3.2用SP2SP3这对特异引物对ll份亲本品种的基因组DNA进行PCR 扩增,反应结果见图13。

图13,11份亲本品种总DNA的PCR扩增产物
Fig.13 PCR products ofeleven parent sugarcane DNA

扶左劐右:M,50bpDNAladder;LI,C0100i:乙2,CP65-357:b,CP72-1210:L4

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CP84—1198;L5.崖71?374;L6,崖82-96;L7,崖90-3:L8,桂73.167:L9,ROCll L10,科5:L…湛74.141

结果表明:亲本品种COl001、CP65—357、CP72—1210、CP84.1198、崖 71—374、崖82-96、崖90-3、桂73—167、ROCll均出现了大约为690bp的单 一条带,说明这9份甘蔗可能是抗胞囊线虫病的;而科5、湛74.141没有出 现任何条带,说明这2份可能是不抗的。 3.3.4甘蔗引进品种特异扩增产物的分析 3.3.4.1用P2P4这对特异引物对6份国外引进品种的基因组DNA进行 PCR扩增,反应结果见图14。

图14.6份引进品种总DNA的PCR扩增产物
Fig.14

PCR products ofsix imposed sugarcane DNA

从左到右:M,50bpDNAladder;Ll,US90—1013;k,CP00-2047;L3,LCP85—384
h,CP88-1762:L5,HOCP91-555:L6,US87-1036

结果表明:引进品种US90.1013、CP00.2047、LCP85—384、CP88.1762、 HOCP91-555均出现了大约为460bp的单一条带,说明这5份甘蔗可能是抗 根结线虫病的;而US87.1036没有出现任何条带,说明这个品种可能是不抗
的。

3.3。4.2用sP2SP3这对特异引物对6份国外引进品种的基因组DNA进 行PCR扩增,反应结果见图15。

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第33页

图15.6份引进品种总DNA的PCR扩增产物
Fig 15 PCR products ofsix impoaed sugarcane DNA

从左到右:M,50bpDNAladder:L1.US90?IOD:k.CP 00-2047:L3,LCP85—384
L4,CP88-1762:L5,HOCP91-555:L6,US87—1036

结果表明:引进品种US90—1013、CP

00,2047、LCP85.384、CP88。1762、

HOCP9I一555、US87一[036均出现了大约为690bp鲍单一条带,说明这6绘 甘蔗可能都是抗胞囊线虫病的, 3.3,5果蔗特异扩增产物的分析 3.3.S.1用PzPd这对特异引物对5份果蔗的基因组DNA进行PCR扩增 反应结果见图16。

图16.5份果蔗品种总DNA的PCR扩增产物
Fig.16 PCR products offive knit
care

DNA

从左到右:M,50bp

DNA ladder z

L},巴布亚新几如亚累蔗:k,大田霉藏;b,温岭

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果蔗:L4,红叶蔗:L5,同安果蔗

结果表明:巴布亚新几内亚果蔗、大田雪蔗、温岭果蔗、红叶蔗、同安 果蔗均出现了大约为460bp的单一条带,说明这5份果蔗可能都是抗根结线 虫病的。 3.3.5.2用SP2sP3这对特异引物对5份果蔗的基因组DNA进行PCR扩 增,反应结果见图17。

图17.5份果蔗品种总DNA的PCR扩增产物
Fig.1 7 PCR products of five fruit
cane

DNA

从左到右:M,50bp DNA ladder;Li。巴布亚新儿内亚果蔗:L2,大田雪蔗;L3.温岭 果蔗:L4,红叶蔗;k,同安果蔗

结果表明:巴布亚新几内亚果蔗、大田雪蔗、温岭果蔗、红叶蔗、同安 果蔗均出现了大约为690bp的单一条带,说明这5份果蔗可能都是抗胞囊线 虫病的。
3.4

PCR.Southern杂交结果的分析

3.4.1根据P2P4这对特异引物对43份甘蔗基因组DNA的PCR扩增产物,
从37份有特异条带的甘蔗中任取3份(1、松溪竹蔗,、2、福农91—4710,3、 COl001),6份没条带的甘蔗中任取2份(4、Badila,5、闽糖86/2121),6 号样品为水对照,经过PCR—Southern杂交后,第一、二、三泳道在460bp 处出现杂交信号,第四、五、六泳道则无杂交信号,反应结果见图17。

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第35页

图18.6份样品PCR.Southern杂交的结果
Fig.18 PCR—Southern hybridization results ofsix PCR products

从左到右:M,^DNA/EcoRI+HindlII;LI,松溪竹蔗:L2,福农9l-4710;L3,C01001 L4,Badila;L5,闽糖86/2121;L6,ddH20

3.4.2根据SP2SP3这对特异引物对43份甘蔗基因组DNA的PCR扩增产 物,从39份有特异条带的品种中任取3份(1、松溪竹蔗,2、粤C25,3、 CP 00-2047),4份没条带的品种中任取2份(4、闽糖93/246、5、科5),6 号样品为水对照,经过PCR-Southem杂交后,第一、二、三泳道在690bp 处出现杂交信号,第四、五、六泳道则无杂交信号,反应结果见图19。

图19.6份样品PCR.Southern杂交的结果
Fig.19 PCR—Southern hybridization result ofsix PCR products

从左到右:M,x DNA/EcoRI+HindlIh Ll,松溪竹蔗:L2,粤c25:b,CP00.2047 L4,闽糖93/246:h。科5;k,ddH20

4.讨论
4.1关于实验材料的选取 到目前为止,除印度之外,其他国家还没有做过甘蔗线虫病的田间鉴定。 由于未取到经过常规鉴定的抗/感甘蔗品种,所以本实验所用甘蔗材料都是未 经过鉴定的品釉。本实验在选材方面注意到了广泛性并结合了田间长期种植

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第36页

的经验,所取目。蔗材料分为五个部分,分别是从原种、野生种、栽培品种、 亲本品种、引进品种以及果蔗中随机选取的。 4.2关于PCR特异扩增 PCR反应涉及到的因素有很多,而且对每个因素的条件都极其敏感。其

中模板的浓度和纯度、Taq酶、引物、dNTP、退火温度对PCR反应的影响 尤其明显。因此在进行PCR扩增之前,一定要建立一个合适的反应体系。 本研究结果表明,模板DNA浓度在15-100ng/p.L之间对PCR扩增结果 没有明显影响。模板DNA的纯度对PCR扩增是非常重要的,DNA的粗提 物中往往含有很多大分子杂质,这些杂质通常与DNA共同沉淀或与DNA 聚合形成大分子复合物,这些复合物会对PCR扩增产生不良影响,因此在 进行PCR扩增之前.DNA纯化一定要做好。Taq酶用量宜根据具体情况适 当调节,在Taq酶活性较低的情况下,还可以通过调节M92+的浓度来提高 Taq酶的活性。但Mg”的浓度也不能太高,否则会抑制酶的活性,也导致扩 增效率低甚至无扩增。对PCR特异扩增来说,引物浓度应适当。浓度过低, 引物与模板结合位点减少,引起扩增条带减弱:浓度过高,会产生非特异条 带。dNTP是PCR扩增反应的原料,浓度过低时,产生的特异条带较弱。但 dNTP浓度过高时,容易与Mg”结合而降低游离Mg”浓度。从而影响raq 酶的活性,对扩增不利。退火温度会直接影响到PCR扩增的特异性。温度 太低,会产生非特异条带;温度太高,特异条带会减弱甚至消失。 此外,还需要注意的是反应体系中各种试剂的来源,Taq酶、dNTP、引 物、缓冲液等在不同厂家或同一厂家不同批次之间会有差异,DNA放置时 间长短也会对PCR反应产生影响。所以,在更换实验材料或所用的试剂时, 应对反应体系重新进行摸索,以确保实验的精确性。
4。3关于PCR-Southern杂交 PCR-Southem印迹杂交是将被检测DNA的PCR特异扩增产物经琼脂糖 凝胶电泳分离后原位转移到固相膜上,杂交液中的探针与印迹到固相膜上的 特异片段发生杂交,以检测特异片段是否存在与探针同源的序列。Southern 印迹杂交对样品的纯度要求很高,而且琼脂糖凝胶电泳中的溴化乙锭会对杂 交产生不良影响。因此,在进行PCR扩增时,应注意尽量不要污染到PCR 各反应成份;在进行电泳时,要保证琼脂糖凝胶以及电泳缓冲液中没有溴化 乙锭的存在。另外,印迹杂交需要的样品量也很大,所以在点样时要尽量多 加样品。


4.4甘蔗对不同线虫病的抗性结果讨论 本实验分别用两个抗线虫病基因对甘蔗基因组DNA进行PCR检测,共 有36份甘蔗既出现了460bp的特异条带,也出现了690 bp的特异条带;

福建杠¨大掌2003儡砸_学位论文

第,7页

Badila、JIl 89/103、US87.1036只出现了690 bp的特异条带:科5只出现了
460

bp的特异条带:闽糖86/212l、闽糖93/246、湛74—14l没有出现任何条

带。

出现该结果的原因可能有两个,一是因为根结线虫侵粢的是主要甘愿的 根部,因此,宿根性较差的甘蔗容易感染根结线虫。相对于其它甘蔗来说, Badila等甘蔗宿根性较差,更容易感染根结线虫。另外,胞囊线虫大多发生 在北方地区,南方田阊中胞囊线虫的虫口密度比较低,因此,在南方种植的 甘蔗感染胞囊线虫的机会较少。本研究所得结果与实际情况相符合。 二是近年来从植物中分离的抗痛基因有9个,这些抗病基因虽作用的病 原种类有别,但其中8个基因编码的蛋白质都存在同源序列,即都含有或部 分含霄LRR、NBS或STK。这些结果揭示,同源序列可能存在于大多数的 植物抗病基因家族中。根据这些同源序列设计引物,进行'PCR扩增,从而 分离克隆基因和寻找新的抗病基因可能是一个最经济最快捷的途径。本研究 利用P2P4、SP2SP3这两对引物扩增的DNA片段有可能是甘蔗抗线虫病基 因的同源序列。 PCR-Southerh杂交结果的验证性 本实验对甘蔗PCR特异产物进行Southern杂交,结桑表明它们有杂交 信号.进一步证明了该PCR产物的特异片段不是假阳性条带,说明这两个 ‘‘抗线虫病基因和甘蔗的抗线虫病基因序列存在较高的同源性。该结果为克隆 甘蔗抗线虫病基因提供了可能。
4.S

由于时间关系,育一部分试验工作未能最终结束,例如DNA片段测序、 被检测甘蔗品种的田间鉴定等。PCR扩增所得到的特异条带可以回收然后去 测序,以检{110两个片段序列之间的同源性。还有,利用PCR及Southern杂 交技术检测所得到的结果,还有待于进一步国间接触鉴定。

5.结论
5.t建立了适合于甘蔗PCR特异扩增的体系及退火滠度 在20 u1的反应体系中,2,0 mmol/L MgCl2.1001amol/L dNTP,0.2¨mol/L 上游引物,0.21amol/I。下游引物,40ng模板DNA,1.0U Xaq酶,退火温度 60℃.比较适合甘麓DNA的PCR特异扩增。


5.2根据番茄抗根结线虫病基因设计的引物经过筛选之后,得到一对特异性

较好的引物P2P4,以这对引物进行扩增,得到~条大小约为460bp的片段。

福建农林丈学2003届硕:L学位论文

第38页

5.3根据甜菜抗胞囊线虫病基因设计的引物经过筛选之后,得到一对特异性 较好的引物SP2SP3,以这对引物进行扩增,得到~条大小约为690bp的片段。
5.4用抗根结线虫病和抗胞囊线虫病两种基因分别对甘蔗基因组DNA进行 了PCR检测,共获得36份甘蔗对这两种线虫病是双抗的。
5.5

PCR-S。uthern杂交的结果说明,这两条特异条带都不是假阳性条带 该结果为以后的甘蔗抗线虫病基因克隆奠定了基础。

福建农林大学2003届硕J:学位论文

第39页

参考文献:
【t】Sasser j N,Freekman
7,14 D

W.A world perspective
on

on

nematology:the role of the society.

In:Veech J A,Dickerson D、Ⅳ.Vistas

Nematology.Society of Nematologists,1 987:

【2】张绍升编著.植物线虫病害诊断与治理.福建:福建科学技术出版社.1999
【31
Winstead N N and Sasser J N.Reaction of cucumber varieties
to

five root—knot

nematodes(Meloidogyne spp.).Plant Diesase Reporter,1 856,40(4):272-275 【4】Karssen G
in
The Plant-parasitic Nematode Genus

Meloidogyne Goldi,1 892(Tylenchida)

Europe.Drukkerij Modern:Bennekom,l 999

[5】杨宝君.十五种根结线虫病害的病原鉴定.植物病理学报,1984,14(2):107.112 16】刘维志,段玉玺.植物病原线虫学北京:中国农业出版社,2000。213-281 [7]彭德良.蔬菜线虫病害的发生和防治.中国蔬菜,1998,4:57.58
[8]Jones M G
【91
K Host cell response to endoparastic nematode aflack:structure and

function ofgiant cells and syneytia.AnnApplBiol,1981,97:353—372

Sijmons PC,Plant-nematodeineractions.PlantMolBiol,1993,23:917—93l
D,Kleine M,Kifle S,Harloff H J,et a1.Positional cloning of


【10】Cai

gene for nematode

resistance in sugar beet.Science,1997,275:832.834

[1 1】Hallden

C et a1.The

USe

ofbulked segregant analysis to accumalate RAPD markers

near

alocusforbeet cyst nematode resistanceinBeta vulgaris.PlantBreed,1996,116:12-22

【12】Kaloshian 【13】Milligan

l,Yaghoob J,Liharska T

et

a1.Genetic and Physical localization of the

root.knot nematode resistance locus Mi in tomato.M01.Gen.Genet,1998,57:376.385 S B,Bodeau J,Yaghoobi J et a1.The rootknot nematode resistance gene Mi


from tomato is

member ofthe leucine zipper,Nucleatide binding,Leucine-Rich repeat

familyofplantgenes.The plantce)l,1998,10:1307-1319

[14]Lagudah
locus



S,Moulet O,Appels,R.Map-based cloning of




gene sequence encoding



nucleotide binding domain and

leucine-rich region

at

the Cre3 nematode resistance

ofwheat.Genome,1997,40(5):659-665
A et

【1 5】Ballvora

a1.Marker enrichment and high resolution map of the segment of potato
Harbouring the nematode resistance gene GroI.M01.Gen.Genet,

chromosome VII 1995,249:82—90

【16】Jung

C et a1.Engineering nematode resistance in crop species.Trends in Plant Science,

1998,3:266-271

【17】Niewoehner
linked
to

J.Development of PCR assays diagnostic for RFLP marker alleles closely
to

alleles Grol and H1,conferring resistance

the

root

cyst

nematode

Globodera rostochiensis in potato.M01.Breed,1995,1:65-78

【18】Ganal M W

et

a1.Genetic mapping ofa wide spectrum nematode resistance

gene(Hera)

against G如bodera rostochiens括in tomato.M01.Plant-Microbe Interact,1995。8:

福建农林火学2003届硕士学位论文

第40页

886-891

【19】Vierling R A

et al

Association ofRFLP marker with loci conferring broad resistance to

the soybean cyst

nematode(Heterodera glycines).Theor.Appl,Genet,1996,92:83—86
el

【20】Coneibidio
【21】Tamulocus

V C

al。Soybean cyst nematode resistance genes in‘Peking’,P190763,and

P188788 using DNA markers.Crop Sci,1997,37:258?264
J P et a1.RFLP mapping of resistance to southern root—knot nematode in

soybean.Crop Sci,1997,37:1903—1909

【221 Krelschmer J M 【23】Williams

et

a1.RFLP mapping ofthe Ha2 cereal cyst nematode resistance gene in

barley.Theor.Appl.Genet,1997,94:106I一1064
K J et a1.Development of
to el


PCR-based allele—specific assay from

an

RFLP

probe linked

resistance

to

cereal cyst nematode in wheat.Genome,1996,39:798—801
to

[24】Garcia G M

a1.Identification of RAPD,SCAR,and RFLP markers tightly linked
to

nematode resistance genes introgressed from Araehis cardenasii in Genome,1996,39:836-845

Arachis hypogaea.

[25]Sijmons
f26]Joan M

P C et a1.Arabidopsis haliana

as



flew model

hosts for plant?parasitic

nematodes.Plantj.199l,l:245—254 H,Roy French.The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis Ann,

Rev.Phytopathol,1993,31:81-109

f27】Arnheim N,Erlich H.Polymerase chain reaction strategy.Ann.Rev.Biochem,1 992,1:
131

【28]Saeffan ILl,Atlas Rlvl.Polymerase chain reaction:Applications
microbiology.Ann.Rev.Microbiol,1991,45:137

in

environmental

【29】鲍晓明,黄百渠,李松涛等.用RAPD技术鉴定两个小冰麦易位系.遗传学报,1993,
20(1):81—87

[30】Myers TW,Gelfand

DH.Reverse transcription and DNA amplification by



Thermus

thermophillus DNA polymerase.Biochem,1991,30:7661—7666

[31]Schafer C,Wostemeyer

J.Random primer dependent PCR differentiates aggressive

from non-aggressive isolates ofthe oilseed tape patbogen Phoma

Ligain(Leptosphoeria

maculans).Phytopathol,1992,1 36:124-130

[32】Wostemeyer J,Schafer C,Kellner M
primer dependent PCR as


et

a1.DNA polymorphisms detected by random

powerful tool for molecular diagnostics of plant pathogenic

fungi.Mol Genet,1992.5:227—235

【33】Bauer D,Muller
species by 4272.4284
an

H,Reich J

et

a1.Identification of differentially expressed mRNA Acids Res,1993。21:

improved display

technique(DDRT-PCR).Nucleic

[34】Lnnis MA,Myambo

KB,Gelfand DH et a1.DNA sequencing with thermos aquaticus

DNA polymerase and direct sequencing of chain reaction—amplified DNA.Proc Nucl Aeid Sci USA,1998,85:9436-9440

福建农林大学2003届硕士学位论文

【35】Kainz P,Schmtedlecbner A,Scrack
Appl Biochem,1992,202:46—49

HB./n vitro amplification ofDNA fragments>10kb

【36】Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T Molecular cloning:a laboratory manual.2rid cd.
Cold Spring Harbor,1989

【37】Burckhard
239-243

J.Amplification of DNA from whole blood.PCR Methods Applic,1994,3:

[38】Tsai M,Miyamoto M,Tom SY

et

a1.Detection of mouse mast cell associated protease

mRNA:heparinase treatment greatly improved RT-PCR of tissues containing mast cell
heparin.Am J Pathol,1995,146:335-343

【39】Jung R,Lubcke C,Wagener

C et a1.Reversal of RT-PCR

inhibition observed in

heparinized clinical specimens.BioTechniques,j997.23:24-28

【40】Weigharch F,Riva

S et a1.A simple procedure for enhancing of PCR

specificity.PCR Methods Applic,1993,3:77-80

【41]Chou Q,Russell M,Birch
1712.t723

DE,Prevention of pre-PCR mis-priming and

primer

dimerization improves low-copy-number amplifications.Nucl Acids Res,1 992,20:

【42】Sarkar

GS,Kapelner

S,Sommer SS.Formamide

can

dramatically

improve the

specificity ofPCR.Nucl Acids Res,1990,18:7465—7468

【43]Henke w’Herdel

K,Jung K

et

a1.Belaine improves the PCR amplification of

GC—rich DNA sequences.Nucl Acids Res.1997.25:3957.3958

[44】Chevet E,Lemaitre C,Katinka D.Low concentrations of TMCI increase yield and
specificity ofPCR.NuclAcids Res.1995.16:3343.3344

【45】储瑞银等.应用聚合酶链式反应扩增大豆花叶病毒外壳蛋白基因及其序列分析.植 物基因工程研究.北京人民出版社,1992 [46】任兵等.烟草花叶病毒的45KD基因的eDNA克隆及序列分析.植物基因工程研究.
北京人民出版社,1992

[47]储瑞银等.水稻矮缩病毒基因组第10号片段的克隆及序列分析.植物基因工程研 究.北京人民出版社,1992 【48】吴玉良,董继新等.用PCR-差别筛选法分离和克隆水稻抗瘟性相关基因.浙江农
业大学学报.1998,24(5):487-492

【49】陆军,钱惠荣等.应用RAPD标记快速鉴定水稻抗瘟病基因.科学通报.1994,
39(22):2103-2105

[50】何祖华,吴玉良等RAPD方法鉴定水稻抗瘟性和eui基因相关的DNA片段.浙江 农业大学学报.1995,21(4):412 [51]郭金平,潘大仁.甘薯线虫病品种抗性的PCR检测.作物学报,2002,28(2):167.169 [52】刘学敏等.大豆灰斑病菌生理小种RAPD标记.菌物系统.1997,16(2):128-133 [53]秦国夫,惠东威等.中国蜜环菌生物种RAPD分析.真菌学报.1996,15(1):26.33 [54】周永力,吕国忠等.采用PCR.RFLP和RAPD对球壳孢目真菌系统的研究菌物系

福建农林大学2003届硕士学位论文

第42页

统.1998,17(2):154-159

【55】程东升,粱惠燕.中国3种松干锈菌在随机扩增DNA多态性水平上的遗传分化.林 业科学,1998.34(5):51.59

f567朱有勇,王云用等.大丽轮枝菌核糖体基因ITS压段的特异扩增.植物病理学报.
1999,29(3):250-255

【571肖火根,胡晋生.香蕉束项病毒PCR检测技术研究.华南农业火学学报.1999,
20(1):5-8
【5 8】王克日,庞辉.泡桐组织苗丛桉病原体PCR检测林业科学研究.1995,8(2):
215—218

[59】李江山,金开璇.用PCR扩增16 SrDNA检测泡桐组织苗丛枝病菌质体.林业科学.
1996,32(6):569-572

[60]邓晓玲,梁志慧,唐伟文.快速检测柑桔黄龙病病原的研究华南农业大学学报
1999,20(1,:I-4

【61】孔维文,邓晓玲等.柑桔黄龙病病原DNA片段的克隆及序列分析植物病理学报.
2000,30(1):71—75

[62】田亚南等.应用电镜与PCR技术检测王官溪蜜柚黄龙病病原.植物病理学报.2000,
30(1):76?81

[63】李育庆,曹凯鸣,忻骅等.聚合酶链反应(PCR)所得小麦高分子量谷蛋白亚基基 因片段的克隆和顺序分析.植物学报.1992,34(9):651-657 【64】陈忠英,王钧.PCR方法检测水稻中存在G蛋白基因家族.生物化学与生物物理学
报.1 994,26(3):345—349

[65】陆朝福等,用PCR技术诊断水稻自叶桔病抗性.遗传学报.1996,23(2):Ij0.i16 【661陶生策,张治平等.PCR技术研究进展.生物工程进展.2001,2l(4):26.29 【67】张绍升.甘蔗根结线虫病及其病原鉴定.甘蔗糖业.1992,4:20.22 [68】黎少梅,冯志新.广东甘蔗根结线虫病的病原鉴定及致病性研究.华南农业大学学
报.{995,16(1):54—57 【69】Sasser
J N.Economic importance of

Meloidogyne in tropical countries In:Lamberti.F

&Taylor,C.E.(Eds)Root-1(110t nematodes(Meloidogyne species)Systematics,biology
and contr01.London:Academic Prademic Press,1979。359.373

【701 Ahlfeld,H,World
yearbook and

sugar statistics.In:F.0,Licht’s international sugar economic

directory,e O.Licht,Ratzeburg,X111+79p,1986

【71】顾红雅,翟礼嘉主译,植物分子生物学实验手册.1998,北京:高等教育出版. [72】金冬雁,黎孟枫编译.分子克隆实验指南,第二版.1993,北京:北京科学出版社.

福建农林大学2003届硕士学位论文

第43页


LoCUS DEFINITION AFl48934 1355 bp


mKNA

番茄抗线虫病基因Hsl”‘序列
linear
PLN 19-JUL-1999

Lycopersicon eseulentum phantastica mRNA,complete cds AFl48934 L241 l 1 AFl48934.1 Lvcopersicon
428A

ACCESSlON
VERSION SOURCE BASECoUNT ORIOIN


GI:5230655

esculentum(tomato)
323 G 337T

267C

AATTCGATTA TTTTCTTGAA ATATAATAAA AAAGATCATA TGGGTCGAGC TAGAAACTGG

61

GATGCCTAAG TTGTTTCTTG AAAATTATGA GGAGTTTGGG AGGATGGAAA CTGGTGTTTA

12I CACCTGGAAA TGAGGGAGAG GCAAcGGTGG cGAGcTGAAG AGGATGcTTT GTTGcGGGcA 18l TACGTGAGAC AGTATGGACC AAAAGAATGG CCCCTTGTAT CACAGCGTAT GAACACGCCC
24l

CTTAACAGGG ACGCGAAGTC TTGTTTAGAA AGGTGGAAAA ACTACCTCAA ACCAGGGATT AAAAAAGGAT CACTCACTGA AGACGAGCAG CGTCTTGTTA TACAACTACA AGCCAAACAC

301 361 42l 481

GGTAACAAAT GGAAGAAAAT AGCAGCTGAA GTACCAGGTC GAACTGCTAA AAGATTAGGA
AAGTGGTGGG AAG"ITTTCAA AGAGAAGCAA CAGAGAGAGC AGAAAGAAAA CAACAAGGTT GTTGATCCAG TAGACGAGGG AAAATACGAT CACATTCTCG AAACCTTTGC AGAAAAGATT

541 GTGAAAGAAA GGAGTGTCCC AGGTTTACTT ATGGCTACTT CTAATGGAGG TTTCCTCCAC 601 GCCGATGCCT CAACTCCTAC GCCACAAACT CTTCTTCCTC CGTGGCTTTC TAATTCTTCT

661 GCTCCTTCAA C下GTTAGATC ATCATCTccA TcTGTGACTT TAAGTCTcTc CCcCTCTACT 721 GTGCCGCCTA CACCTACACC TGGCATTCCG TGGCTACAGA CAGATAGAGG ACCTGATAAT
78l GCGCCTCTCA TCTTGAGCAG TTTTCCACAT CATAGTGTTG CTCCTTGTGG AGAAAATCCT 841 TTTATTACTG AACTTGCGGA ATGCTGCAAG GATTTAGACG AAGGGCATCG TACTTGGACT 90l GeAeATAAGA AGGAAGcAGC TTGGAGGTTA AGGAGGGTTG AATTGCAACT AGAATCTGAA 96l AAAGCAAGCA AAGTTAGGGA GAAAATGGAG GAAATTGAAG CAAAAATGAA AGcGCTGAGG

1021 GAAGAACAGA AAGCAACTCT AGACAGAATT GAAGCAGAAT ACAAGGAGCA ACTAGCAGGC
108l
1 141

TTGAGGAGGG ATGCAGAAGC AAAAGAGCAG AAATTGGCAG AGCAATGGAC ATCCAAACAC ATGCGCCTTG CTAAGTTTCT TGAGCAGATG GGATGCCAAT CAAGACTTGC TGAACCTAAT

120I GGcGGCcGcT AAAGCAAAGC TTGcAAGCTA^GCC^AGAAT

Tc订TTGTGT TTccTTGCTc

1261 CTTTAGACGG TTCTTTCTAC TTGCCGCGAC TTTTCTTACT GTAAACTTTT TGTTTGATCA
1321

TCTTCTATTT GGTTTTCTAA ATCACTAGTG AATTC

福建农林大学2003届硕士学位论文

第44页


LOCUS DEFINlTION ACCESSION VERSION SOURCE BASE COUNT ORjGIN
1 6l 12i


mRNA



甜菜抗胞囊线虫病基因Hsl”” 序列
BPU79733
1450 bp

inear

PLN 01-MAR.j997

Betaprocumbens nematode U79733 U79733.1 Gl:1850967

resistance(Hslpro一1)mRNA,complete cds

Beta procumbens
432A

206C

386G

426T

GAGTCGTTAG CGAGAGATCA AGTCCGAAAC TCATCTCAGT TCTCTGCGGA AGACGATGAG ACACGTGGAT CAGCTCCGAA TCGTTGATCT GACGTCATCG TATGGTGAGG TGATGTCACA AACAGAAGTT CAGcGGAGGT ATGGAAGCTT GCGAATGGAG AACATGATAC TACCGTGGTC

181 TGTCGTAGTA GCGAATTTAG TCTCCTTCCG AGGTTAGCCA cGTGGCAGAA GTCGGAGGAG 241 ATTGCTTcTA GAATCTTCTA CGCGGTTGAA TCTGCTATGA GAAGGTGTGG GTATAGTTTG

301 GGCCTTGGTG AGCCCAATTT GGACGGAAAG CCCAATTTAG ATTACGACGC CGTTTGTCGT 361 CCTTCTGAGC TTCACGCGCT TAAAAAGGGC GCGTTGGATT ATATTCAGAA TTCGGAAAAT 421 CAGATATTGT TTACAATTCA TCAGATTTTC GAGTCGTGGA TTTTTTCCTC GAAAAAATTG 481 TTGGATCGAA TAAGTGAGAG GATCAGTAAA GAAGAGTTTA CCAAAGCAGC AGATGATTGT
541 TGGATACTGG AGAAAATATG GAAGTTATTG GAGGAAATCG AGAATTTACA TTTATTAATG 60l GATCCTGACG ATTTCCTGCA TCTGAAGACG CAACTGAGGA TGAAAACAGT GGCGGATTCT

66l GAAACTTTTT GTTTTCGATC AAAAGGACTG ATCGAGGTAA CAAAATTAAG CAAGGATCTA 72l 781 84l 901 961

CGGCACAAGG TGCCGAAGAT CCTTGGTGTA GAGGTGGACC CTATGGGAGG ACCGGTGATA CAAGAGTCGG CAATGGAGTT GTACCGAGAA AAAAGAAGAT ACGAGAAGAT ACATCTGTTA
CAAGCGTTTC AAGGGGTGGA ATCCGCTGTT AAAGGGTTTT

TcTTT从TTA

TAAACAGTTG

TTGGTGATCA TGATGGGTAG TTTGGAAGU3 AAAGCGAATT TTGCTGTGAT TGGTGGTTCT
ACTGAGTCTT CGGATTTGTT GGCTCAGTTG TTTTTAGAAC CTACTTATTA TCCGAGTTTG

1021 GATGGTGCCA AGACTTTTAT TGGTGATTGT TGGGAGCATG ATCAGGCTGT TGGTAGCGGC 1081 cTCGATTGTC GTCATCATCG GAAGAATCGG ACTGCGAAAC AATGATGGTT TCGAAGTTAG

I 141 TTTTGGATTG AGTTTGGTTT GATCTGACTC GGCTGAGTAA TGGGCGGCGA TAGGGAGGTT 1201 ATGG^GA^cG TGGGGCGGAA AGTGGGTGGC CTTGTTAGTG AGACGTGcAA 1261 i321 1381 144I

AC丌TGGTTA

CTATTACATG TGATATACTT ATATTTAGTG GGAATATTGC TTTGGTGTAT ATAGATAAAT

TTTTGAATTA ATTGTTACAC TTGTATTAGT AAATTCTGTA TCATGATGAT TATAACATGA
ATTTTTTGTT GTGACTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

福建农林大学2003届硕士学位论文

第45页




英汉对照缩写词



AFLP Op
Cm

扩增片段长度多态性(amplified 碱基对(base
pair)

fragment length polymorphism)

厘米(centimorgan) 天(day)

d ddH20 dNTPs EB EDl、A RFLP h mln PCR PVP


双蒸水(double

distilled water) triphosphate)

脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside 溴化乙锭(ethidium
bromide)

乙二胺四乙酸(ethylene

diaminetetraacetic acid) fragment length polymorphism)

限制性片段长度多态性(restriction
小时(hour)

分钟(minure)

聚合酶链式反应(polymerase 聚乙烯毗咯烷酮(polyvinyl 抗病(resistance) 随机扩增多态DNA(random

chain reaction)

pyrrolidone)

RAPD RT-PCR SCAR SDS SSR STK STS
TE

amplified polymorphic

DNA)

反转录聚合酶链式反应(reverse

transcription PCR) amplified region)

序列特征性扩增区域(sequence characterized 十二烷基硫酸钠(sodium
微卫星标记(single
dodecyl sulfate)

sequence repeat)

丝氨酸.苏氨酸激酶(serine.threonine
序,d标签位点(sequence tagged site)

kinase)

TE缓冲液(Tris。EDTA buffer) 三(羟甲基)氮基甲烷【Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
单位(unit)

Tris
U NBS LRR

核苷酸结台区(Nucleofide—Binding

Site) region)

富含亮氨酸重复(Leucine—riched repeat

福建农林大学2003满硕士学位论文

热46夏





本试验是在农业部甘蔗遗传育种重点开放实验室进行的,本研究受福建
省国际合佟项目(2000t004)资助,在譬烬潘大仁教授的悉心指导下完成的。 献论文资料熬收集,实验设计盏至8全部实验完成,都倾注着导师大量汗水和
心盔。三年来,导师给予擎生生活秘学习上无微不至的关怀和孜孜不锩豹教

诲,学生在诧表示衷心的感谢。导师严谨的治学态度、广博的学谈、踏实的 工作作风和为科学事业无私奉献的精神,都为学生今后的工作、学习稽立了 ..光辉的典范,这必将使我终身受益。三年来,师母周以飞副教授在学>-J;Ft】生 活上给予了无徽不至的关怀,表示感谢。 特别感谢陈如凯教授、转彦铨研究员、张木清研究员、许裁萍副研究员、 陈平华老烬对本研究绘予了大力支持共提出了许多宝赛的指导性意见。邓根 溺、张华、毫三基、徐良年、罗後等忍经老师为本薹嚣究疆{;乏实验毒毒料。薛其 清研究员、王慧娟老烬、罗部意老师等也都给予了不掰程瘦的帮助,在此表 示衷心的感谢。 另外,本实验室的研究生周会、韩新远、杨志霞、吴朝峰、陈观水、张 辉、方珊茹等同学,对论文的完成提供了很大的帮助,在此一并表示感谢。


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