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基因工程复习题


一、名词 1. 基因工程:按照人们的愿望,进行严密的设计,通过体外 DNA 重组和转基因等技术有目的地 改造生物种性, 使现有的物种在较短的时间内趋于完善, 创造出更符合人们需求的新生物类 型。 2. 基因工程工具酶:指体外进行 DNA 合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶,包括 DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。 3. 基因工程药物:主要指基因工程活性

多肽、基因工程疫苗和 DNA 药物等。 4. Tm:DNA 达到 50%变性的温度。 5. 复性:高温变性的 DNA 被逐渐冷却时,分开的两条链又会重新结合成双链 DNA。 6. 杂交: 7. 复制起始位点: 每一种生物 DNA 的复制总是从特定的位点开始, 这个位点具有一定的核苷酸 序列,这个序列就叫复制起始位点。 8. 复制子: 从复制起始位点开始复制出一个 DNA 分子或一个 DNA 片段的核苷酸序列称为复制子。 9. 启动子:是一段提供 RNA 聚合酶识别和结合的 DNA 序列,它位于基因的上游。 10. SD 序列:在原核生物结构基因的起录点下游不远处,总有一个 5’-AGGAGG-3’的序列,转 录出 mRNA 上的 5’-AGGAGG-3’序列, 与核糖体 30s 亚基 16SrRNA3`端的 5`-CCUCCU-3`互补, 成为 30S 亚基识别和结合 mRNA 的位点。这个序列就叫 SD 序列。 11. 基因编码区:转录 mRNA 上起始密码 AUG 至休止密码 UAG 或 UAA、UGA 的各种遗传密码的核 苷酸序列。 12. 转录终止子:在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列。 13. 限制性核酸内切酶:是一类能识别双链 DNA 中特殊核苷酸序列,并使每一条链的一个磷酸 二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 14. 稀切酶:那些长的识别序列和富 GC 或富 AT 的识别序列在 DNA 分子中出现的概率很低,所 以把这些识别序列相应的限制性核酸内切酶称稀切酶。 15. 同裂酶:有一些限制性核酸内切酶虽然来源不同,但是具有相同的识别序列。这样的限制 性核酸内切酶成为同裂酶。 16. 粘性末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的,对称得分布在识别序列 中心位置的两侧。这样的切割的结果,使 DNA 片段末端的一条链多出一至几个核苷酸,同时 具有互补核苷酸的另一 DNA 片段末端可以连接,这样的 DNA 片段末端叫做粘性末端。 17. 平末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心。这样 的切割的结果产生的 DNA 片段末端是齐平的。 18. 同尾酶:有些限制性核酸内切酶虽然识别序列不同,但是切割 DNA 分子所得的 DNA 片段具 有相同的黏性末端,称这样的一组限制性核酸内切酶为同尾酶。 19. Star 活性:有些限制性核酸内切酶在特定条件下可以在不是原来的识别序列处切割 DNA 这 种现象称为 STAR 活性。 20. 部分酶切:选用的限制性核酸内切酶对其在 DNA 分子上全部识别序列进行不完全的切割。 21. 限制性图谱:当一种 DNA 分子的核苷酸序列被全部测定后,意味着此 DNA 分子上所有的限 制性核酸内切酶识别序列也已经全部知道, 可以绘制出 DNA 分子上每种限制性核酸内切酶的 识别序列的分布图。 22. PCR:是模仿细胞内发生的 DNA 复制过程进行的,在体外由酶催化合成特异性 DNA 片段。 23. 寡核苷酸连杆:是一种按预先设计,化学而成的寡核苷酸片段。一般由 8—12 个核苷酸组 成,以中线为轴,两侧互补对称。其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列,是连接 了寡核苷酸连杆的 DNA 片段经过这些限制性核酸内切酶切割后,可以产生一定的黏性末端, 便于与具有相同黏性末端的另一 DNA 片段连接。

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24. 多克隆位点: 25. MCS 连杆:MCS 这样的连杆被称为多克隆位点寡核苷酸连杆或简称 MCS 连杆。 26. 衔接头:是一种化学合成的寡核苷酸,含有一种以上的限制性核酸内切酶的识别序列。 27. DNA 芯片:是 DNA 片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上而组成的密集分子 排列。 28. DNA 连接酶:能催化双链 DNA 片段紧靠在一起的 3`羟基末端与 5`磷酸基团末端之间形成磷 酸 2 酯键。 29. 基因克隆载体:是以质粒 DNA 分子为基础构件而成的克隆载体,主要用于原核生物和植物 的基因转移以及建立基因组文库和 cDNA 基因文库。 30. 质粒:一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的双链 DNA 分子。 31. 严紧型质粒:拷贝数少的质粒。 32. 松弛型质粒:拷贝数多的质粒。 33. 亲和性质粒:把能同寓于细胞中的不同质粒成为亲和性质粒。 34. 不亲和性质粒:不能同寓于一个细胞中的质粒。 35. 不相容质粒:既不亲和质粒。 36. 接合质粒:含有 tra 基因的质粒。 37. 非接合质粒:不含有 tra 基因的质粒。 38. 质粒迁移作用:部分质粒虽不含 tra 基因,但含有 bom 位点,当宿主细胞内同时存在含有 mob 基因的辅助质粒时,mob 基因的产物可打开非接合质粒的 oriT 位点,借助于接合质粒 tra 基因的产物,使非接合质粒被动迁移到受体细胞中,这个现象叫质粒迁移作用。 39. 显性质粒:质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外,有的质粒还携带一些其他的基 因,宿主细胞由于含有这样的质粒二呈现出新的形状。 40. 隐蔽质粒:即使宿主细胞含有某些质粒,但无异样性状表露。 41. R 质粒:显性质粒有抗抗菌素的抗性质粒。 42. 穿梭质粒: 43. Ti 质粒:根癌农杆菌含有一种内源质粒,当农杆菌同植物接触时这种质粒会引起植物产生 肿瘤。 44. T-DNA:ti 质粒进入植物细胞的只有一小部分,把这种能转移到植物细胞内的 DNA 片段成 T-DNA.。 45. 中间质粒克隆载体:T-DNA 的部分序列插入大肠杆菌质粒克隆载体,由此构件的克隆载体 承受外源基因后,须先在辅助质粒推动下进入农杆菌,再在农杆菌介导下送入植物细胞。因 此,把这类克隆载体叫中间质粒克隆载体。 46. TA 克隆:PCR 的赖热 DNA 聚合酶具有一种非模版依赖性活性,这种活性可在 PCR 产物的 3` 端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷。根据这一特点研制出一种线性质粒,其 5`端各带一 个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷,采用该质粒可将 PCR 产物以 TA 连接的方式直接进行克隆。 47. cos 位点:λ 噬菌体的 DNA 在噬菌体中是线状 DNA 分子,左右两端各有 12 个核苷酸组成的 5`突出黏性末端,而且两者的核苷酸序列互补。λ DNA 进入宿主细胞后,黏性末端连接后形 成环状 DNA 分子。把此能连接的末端称 cos 位点。 48. Cosmid 克隆载体:根据λ 噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的性质,取长补短,设计由 质粒和含有 cos 位点的这种λ DNA 片段组装成一类新的克隆载体。 49. 病毒质粒克隆载体: 克隆载体含有 SV40 完整早期转录区 DNA 序列和 DNA 复制起始位点, 以 及质粒 DNA 的复制起始位点和选择标记基因。 50. 定位整合克隆载体:除了一般质粒克隆载体必须具备的元件外,韩必须含有一个或两个与 整合平台 DNA 区域核苷酸序列同源的 DNA 片段。

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51. 整合平台:受体细胞基因组上给定的一个 DNA 区域,是外源 DNA 定位整合的位置。 52. 基因打靶:利用基因整合平台系统转基因的方法。 53. YAC 克隆载体:将酵母染色体 DNA 的端粒,DNA 复制起点和着丝粒以及必要的选择标记基因 序列克隆到大肠杆菌质粒 pBR322 中,构建成 YAC 克隆载体。 54. 诱导型表达克隆载体:启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性 的表达克隆载体。 55. 反义核酸技术:利用人工合成的或组成的与靶基因互补的一段反义 DNA 或 RNA 片段,特异 性的与靶基因结合,达到封闭其表达的目的。 56. 目的基因:从现有的生物群体中,根据需要分离出用于克隆的基因。 57. 重叠基因:不同基因共同用同一段 DNA 核苷酸序列,它们的核苷酸系列是彼此重叠的,这 样的基因称重叠基因。 58. 基因组文库: 某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌群体之中, 这个群体及为这种生物的基因组文库。 59. cDNA 基因文库:某种生物基因组转录的部分或全部 mRNA 经反转录产生的各种 cDNA 片段分 别与克隆载体重组,储存在一种受体菌群体中,这样的群体叫 cDNA 基因文库。 60. RACE:是指 mRNA 为模版,反转录合成 cDNA 的第一条链,然后用 PCR 技术扩增出从某个特 定位点到 3`端或到 5`端之间的未知核苷酸序列。 61. 套式 PCR:是指用两对引物扩增同一个样品的方法。在两对引物中,一对引物与靶序列的 复性结合位点处于另一对引物扩增的 DNA 序列内, 前者称为内部引物, 后者称为外侧引物。 62. 锚定 PCR:指通过增加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。 63. 多重 PCR:利用多对引物同时扩增模版上的多个靶序列,以确定待检测的基因片段存在与 否及其数量。 64. 定量 PCR:通过 PCR 扩增来定量扩增体系中的 DNA 或 RNA 的起始拷贝数量。 65. 功能互补克隆技术:利用被克隆的 DNA 片段与寄主细胞的染色体 DNA 在功能上有同源互补 性来进行目的基因直接分离。 66. 表达序列标签:基因序列中一段能特异的标记或表征基因的序列,通常它含有足够的结构 信息以显示出该基因与其他基因的差异。 67. 代表差别分析: 通过突变型与野生型基因组之间的差异比较来分离和鉴定突变基因的方法。 68. CG 岛:人类基因组大多数 CG 位点都是高度甲基化的,但仍有少数的 CG 位点是低甲基化或 非甲基化的,这种低甲基化或非甲基化的 CG 位点就是 CG 岛。 69. 剪接位点筛选法:利用与剪接位点序列一致的简并寡核苷酸作为探针来筛选目的基因。 70. 表面展示技术:将目的基因克隆在特定的表达载体中,使其表达产物显示在活的噬菌体, 细胞或细胞表面, 然后根据表达产物的某些生物学活性的检测来筛选, 富集和克隆带有目的 基因的噬菌体,细菌或细胞。 71. 转化:重组质粒 DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞,并在受体细胞内稳定维持和表 达的过程。 72. 感受态细胞:处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态的细胞。 73. 转导:通过λ 噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源 DNA 分子转移到受体细胞内的过程。 74. 原生质体:除去细胞膜的剩余细胞部分。 75. 基因枪法:利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞内的现象,将包裹在金属颗粒 表面的外源 DNA 分子随之带入细胞进行表达的基因转化方式。 76. 脂质体:由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构,可以将 DNA 包在其内,并通过脂质 体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬作用,把外源 DNA 转运到细胞内。 77. 转化子:导入外源 DNA 分子后能稳定存在的受体细胞。

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78. 克隆的筛选: 79. 报告基因:在植物转基因研究中,载体携带着选择标记基因通常称为报告基因。 80. 杂交探针:具有一定序列的核苷酸片段,它与能互补的核苷酸序列复性杂交并且通过适当 标记进行检测。 81. 亚克隆:将克隆片段进一步片段化后再次克隆。 82. 增强子:能够增强启动子转录活性的 DNA 顺式作用序列。 83. 衰减子:基因表达调控的精细调控装置,它利用原核生物转录与翻译相偶连的特性,依赖 自身巧妙的特征序列和相应的 RNA 二级结构, 对基因转录进行开关式的微调作用, 从而保证 原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个基底水平合成氨基酸, 核苷酸和抗生素 等。 84. 绝缘子:是基因表达调控元件,也是一种边界元件,它能阻止临近的调控元件对其所界定 基因的启动子起增强或抑制作用。 85. 反义子:一类与特定 DNA 序列互补的小分子 RNA 成为反义 RNA,编码反义 RNA 的 DNA 称为 反义子。 86. 反义 RNA:一类与特定 DNA 序列互补的小分子 RNA 成为反义 RNA。 87. 外源基因表达系统:目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞,并能在其中有效 的表达,产生目的基因产物。 88. 包涵体:在一定的条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起, 形成无膜的裸露结构。 89. 融合蛋白:将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起, 但不改变两个基因阅读框, 以这种方式表达的蛋白叫融合蛋白。 90. 自主复制型质粒载体:该质粒含有酵母基因组的 DNA 复制起始区,选择标记和基因克隆位 点等关键元件。 91. 表达盒:酵母表达载体的重要元件,它由启动子,分泌信号序列和终止子等组成。 92. 着丝粒型质粒载体:该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的,增加了酵 母染色体有丝分裂稳定序列元件, 因而能保证质粒载体在细胞分裂是平均的分配到子细胞中 去,同时提高质粒在宿主细胞中稳定性。 93. 酵母人式染色体:该载体包含酵母染色体自主复制序列,着丝粒序列,端粒序列,酵母菌 选择标记基因以及大肠杆菌的复制子和选择标记基因等。 94. 转基因动物:人类按照自己的意愿有目的,有计划,又根据,有预见的将外源基因导入动 物细胞内。 95. 基因芯片: 采用原位合成或显微印刷技术, 将数以万计的 DNA 探针固定于支持物的表面上, 产生的二维 DNA 探针阵列。 1.基因工程最突出的优点是什么? 基因工程最突出的优点,是打破了常规育种难以突破物种之间的界限,可以使原核生 物和真核生物之间|、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。人 的基因可以转移到大肠杆菌中表达,细菌的基因可以转移到植物中表达。 2.基因工程的理论依据是什么? (1)不同基因具有相同的物质基础。 (2)基因是可以切割的。 (3)基因是可以转移的。 (4)多肽与基因之间存在对应关系。

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(5)遗传密码是通用的。 (6)基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 3.作为克隆载体的 DNA 分子必须具备的主要条件是什么? (1)作为克隆载体 DNA 分子合适的位置有一至多个克隆位点供外源 DNA 片断组入克隆 载体 DNA 分子。 (2)克隆载体能携带外源 DNA 片段进入受体细胞,或者停留在细胞质中能自主复制。 (3)克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因。 (4)克隆载体必须是安全的,不应含有对受体细胞有害的基因,并且不会任意转入除了 受体细胞以外的其他生物的细胞,尤其是人的细胞。 4.构建质粒克隆载体的基本策略是什么? (1)构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制,并且作为质 粒克隆载体希望在受体细胞中有较多的拷贝数。 (2)构建的质粒克隆载体必须含有允许外源地 DNA 片段克隆的位点并且这样的克隆位 点应该尽可能的多。 (3)构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。 (4)构建的质粒克隆载体 DNA 分子应尽可能的小。 (5)根据特殊需要,使得构建的质粒克隆载体中组装各种“元件” ,构建成不同用途的 质粒克隆载体。 5.质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则是什么? (1)选用合适的出发粒。 (2)正确获得构建治理载体的元件。 (3)组装合适的选择标记基因。 (4)选用合适的启动子。 (5)在能达到预期目的的前提下,构建的质粒克隆载体的过程应力求简单。 6.简述再生 TA 克隆载体的方法? (1)克隆载体线性化。 (2)克隆载体末端补平反应。 (3)克隆载体末端加 T 反应。 7.构建λ 噬菌体克隆载体的基本策略是什么? 在λ DNA 上切去部分非必须的区域,抹去多余的限制核酸内切酶切割位点,插入可供选 择的标记基因, 建立外包装系统 。 8.构建λ 噬菌体克隆载体的基本技术路线是什么? 1.用限制性核酸内切酶切去λ DNA 上的非必须区。 2.在λ DNA 上的非必须区内组入选择标记基因。 3.建立重组λ DNA 分子体外包装系统。 9.构建 cosmid 克隆载体的策略是什么? cosmid 克隆载体结合了质粒克隆载体和λ 噬菌体克隆载体的优点。研究表明,只要保留λ
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DNA 片段两端不少于 280bp 并含有 cos 位点以及与包装相关的核苷酸序列, 当插入外源 DNA 片段 后总长度大于 36.4kb,小于 51bp,这样的重组λ DNA 分子就能进行包装和转导受体细胞。但λ DNA 片段本身不能进行体外包装和增值, 不能作为克隆载体使用。 但是质粒克隆载体克隆能力一 般不能超过 10kb.由质粒和含有 cos 位点的这种λ DNA 片段组装成一类新的克隆载体。 即 cosmid 克隆载体。 10.cosmid 克隆载体的特征是什么? 1.构建的 cosmid 克隆载体是一种环形双链 DNA 分子,大小不超过 36.4kb,一般在 10kb 以下。 2.具有质粒的性质,可以在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制,具有转化大肠杆 菌的功能,还有一些克隆位点。 3.克隆载体上有一个 cos 位点。 4.构建的 cosmid 克隆载体较小,因此能承受较大的外源 DNA 片段。 11.使用 cosmid 克隆载体的基本程序是什么? 先用一种限制性核酸内切酶切割 cosmid 克隆载体,再用 DNA 连接酶连接。出现具有两个 cos 位点的二联体线性 DNA 分子, 然后选用在两个 cos 位点之间具有识别序列的限制性核酸内切 酶切割二联体线性 DNA 分子和部分切割待克隆的外源 DNA 片段,两者混合,用 DNA 连接酶连接, 就成为可用于体外包装的样品。 使用 cosmid 克隆载体也可以先用两种限制性核酸内切酶分别切 割 cosmid 克隆载体,获得各有一个 cos 位点的线性 DNA 片段,为防止自行连接,分别在碱性磷 酸酶处理,使其 5`端脱去磷酸基团,然后再用另一种限制性核酸内切酶切割两种线性 DNA 片段 和部分切割待克隆的外源 DNA 片段,三者混合,再用 DNA 连接酶连接,就可用于体外包装。 12.构建 CaMV 克隆载体的基本策备和途径是什么? 如何利用 CaMV DNA 能侵入植物细胞的特性,通过对 CaMV DNA 的改造,使其能携带人们需 要的目的基因导入到植物细胞,并且消除 CaMV 对植物的致病性,这就是构建 CaMV 克隆载体的 基本策备。用 CaMV 克隆载体的主要途径如下: 1.构建互补克隆载体。 2.构建置换型克隆载体。 3.构建混合克隆载体。 4.构建 CaMV-融合基因克隆载体系统。 13.构建 RSV 反转录病毒克隆载体的策略是什么? 由于反转入病毒是一类 RNA 病毒,不能直接构建克隆载体,所以首先必须从感染的动物细胞 中分离出原病毒 DNA。然后根据不同需要删去部分序列,组入选择标记基因、目的基因和一些调 控元件,克隆到大肠杆菌源质粒复制起点的克隆载体中,转化大肠杆菌受体细胞,获得大量含 反转录病毒原病毒重组 DNA 分子,成为不同类型的反转录病毒克隆载体。 14.Ad 克隆载体构建的策略是什么? 首先构建一个含多克隆酶切位点和筛选标志的质粒, 该质粒含有病毒基因组某段早期序列, 然后将含有一个启动子—外源基因—poly(A)的表达盒子插入上述质粒中 Ad 的 E1、E3 或 E4 至 右侧 ITR 区之间,构建承载有外源基因的穿梭质粒。其次是构建一个含有非必须区基因缺失后 的环状腺病毒 DNA 的质粒,该质粒可在菌体内复制;最后,载有外源基因的穿梭质粒与携带环 状腺病毒 DNA 的质粒共转染细胞,通过同源重组,即获得重组腺病毒。

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15.杆状病毒转移克隆载体的构建策略是什么? 在基础质粒上插入多角体蛋白基因及其两端侧翼,并在多角体蛋白基因启动子下游去 除编码区,而插入多克隆位点,用于外源基因的克隆,外源基因插入后形成重组杆状病毒克隆 载体。重组杆状病毒克隆载体再与野生型 AcNPV DNA 一起共转染昆虫细胞,在细胞内发生同源 重组,使得外源基因整合到病毒基因组中。由于多角体基因被取代,不能形成多角体,通过病 毒空斑测定就可以识别阳性克隆。利用 AcNPV 病毒克隆载体,在昆虫细胞进行外源表达,已成 功表达多种蛋白分子。由于这类表达系统表达量高,性能稳定、操作简单,已经成为当前最佳 的表达系统之一。 16.双酶切法绘制限制性图谱的原理 17.痘苗病毒克隆载体用于表达外基因的特点是什么? 1.表达的产物具有与天然产物相近的生物活性和理化性质。 2.重组痘苗病毒具有较好的免疫原性。 3.外源基因的插入量大。 4.宿主细胞广泛。 5.表达产物可以进行各种翻译后修饰、无需佐剂就可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫、 纯化过程相对简单、产物对外界环境稳定及易于保存运输。 6.利用痘苗病毒系统表达的外源目的基因在实验动物可提供保护性免疫反应。 18.直接分离目的基因的方法有哪些? 1、限制性核酸内切酶切分离法。 2、物理化学方法有:密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法。 3、双抗体免疫法分离编码蛋白的基因。 4、利用酶促反转录法直接从特定的 mRNA 分离基因。 19.鸟枪法从基因组中分离目的基因的策略是什么? 利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制型核酸内切酶酶切等生物化学方法将生物细 胞的染色体打断,随后通过 T4 DNA 连接酶把这些片段于适当的质粒载体进行重组,转化受体菌 后进行无性繁殖,获得一大群含有不同外源 DNA 片段的克隆,再用简便的筛选方法从众多的转 化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株,从中获得索要的基因。 20.简述不经分级分离的基因组 DNA 文库的构建过程? 21.简述考斯质粒基因组文库的构建过程? 22.用考斯质粒作为构建基因组文库载体的优缺点有哪些? 1、考斯质粒比入噬菌体 DNA 能容纳更大的外源 DNA 片段,构建的完整的基因组文库所 需要的克隆数目减少,便于克隆和筛选。 2、载体本身的分子很小,便于直接分析插入片段的限制性核酸内切酶图谱。 3、缺点是:帅选困难、重组效率低、文库不易贮存。 23.YAC 克隆载体的主要组成部分?

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YAC 载体是以 pBR322 质粒 DNA 为骨架构建的,带有 pBR322 质粒 DNA 的复制位点 ori 和筛选标记 Amp,此外还加入作为酵母染色体所必需的一些组成成分:一段来自酵母染色体的着 丝粒序列、 一段控制酵母 DNA 复制的自主复制序列、 一对酵母端粒序列、 选择记号 TRP1 和 URA3、 克隆位点。 24.简述使用 pYAC4 构建 YAC 基因组文库的基本过程? 首先,选用限制性核酸内切酶,EcoRI 和 BamHI 对 Pyac4 作双酶消化,结果产生出具 有 EcoRI 黏性末端的两条臂分子和一段端粒序列片断,其中在每一条臂分子中都带有一段端粒 序列和一个选择记号。去除两端端粒序列的 DNA 片段,分离回收 YAC 双臂,勇于与基因组 DNA 片段连接重组。其次,选用适当的方法制备生物体完整的染色体 DNA,并将其去段化。 25.简述 cDNA 基因文库构建的主要步骤? 1、分离细胞总 RNA,并从总 RNA 中分离纯化出 mRNA.。 2、以 mRNA 分子为模板,合成 cDNA 第一链。 3、双链 cDNA 的合成,即将 mRNA-DNA 杂交分子转变为双链 cDNA 分子。 26.双链 cDNA 合成的方法有哪些? 1、大肠杆菌 RNaseH 酶降解取代法。 2、oligo(dG)寡聚引物引导法合成双链 cDNA。 3、PCR 法。 4、载体引物引导合成法。 5、固相支持物法。

27.简述构建λ gt10cDNA 文库的主要步骤? 待克隆的双链 cDNA 分子的两端, 必须具有能与λ gt10 载体 DNA 限制位点互补的黏性 末端。为此,先用 EcoRI 甲基化酶处理双链 cDNA,使其中可能存在的 EcoRI 限制位点得到保护, 而免于受切割;然后使用 DNA 连接酶把 EcoRI 衔接物连接到双链 cDNA 分子的两端,通常每一个 cDNA 分子的末端都会串联的连接上许多个衔接物,接着加入 EcoRIxian 限制煤彻底切割衔接物 分子,使得每个 cDNA 分子末端都只留下单一的 EcoRI 黏性末端。与此同时也用 EcoRI 限制酶切 割λ gt10 载体 DNA,并纯化所产生的噬菌体 DNA 双臂,此时他们与待克隆的 cDNA 分子只有互补 的 EcoRI 黏性末端。将两者混合并加入 DNA 连接酶,就会共价连接形成两端具有 cos 位点的串 联排列的重组噬菌体分子。 用包装蛋白质将重组噬菌体分子包装成具有感染能力的噬菌体颗粒, 感染大肠杆菌培养物后,涂布在琼脂平板上,就会产生出数千个独立噬菌斑的平板,而且每一 个噬菌斑都是由单一的重组噬菌体分子所形成的,此即λ gt10cDNA 文库。 28.与基因组文库的构建及基因分离方法相比,cDNA 克隆的优点主要有哪些? 1、cDNA 克隆以 mRNA 为材料,特别适用于某些 RNA 病毒。 2、cDNA 基因文库的筛选比较简单易行。 3、由于每一个 cDNA 克隆都含有一种 mRNA 序列,这样在目的基因的选择中出现假阳 性的概率就会比较低。 4、cDNA 克隆可用于在细菌中能进行表达基因的克隆,直接应用于基因工程操作。 5、cDNA 克隆还可用于真核细胞 mRNA 的结构和功能研究。 29.简述功能互补法克隆基因的方法?

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基因互补克隆技术是经典微生物学方法的一种地扩展和延伸。它主要是利用被克隆 的 DNA 片段与寄主细胞的染色体 DNA 在功能上有同源互补性来进行目的基因直接分离的。一种 最简单的方法是:将大肠杆菌 DNA 的克隆片段“库”重组 DNA 分子分别导入一种大肠杆菌营养 缺陷型菌株的受体细胞,然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的营养底物的培养基 上,结果只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落。 30.简述基因表达系列分析法的原理? 1、从转录物某一特定位置上分离得到一段 9~10bp 的寡核苷酸序列标签,它含有确定 一个独特转录物的足够信息量,可代表此转录物的特异性。 2、多个序列标签能以锚定酶识别位点序列相隔相互连成双标签序列的多联体,将该多 联体序列克隆到一个载体中,用连续的方法进行多联体的序列分析,再通过计算机处理,确定 每一种序列代表转录产物的种类和出现频率,由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析。 31.简述外显子捕捉法的原理? 使外源 DNA 片段中的外显子与克隆位点中已知序列的外显子在受体细胞内剪接,经逆 转录酶的作用或 RT-PCR 技术扩增得到外援 DNA 片段中的外显子, 相应的方法称为简述外显子捕 捉法的原理。 32.简述基因的定位候选法用于分离鉴定人类遗传疾病相关基因的主要步骤? 1、把疾病相关基因定位于染色体的精细区段。 2、通过数据库查找已定位于该区段各候选基因或 cDNA,即表达图谱。 3、通过对这些基因所编码的蛋白质进行功能分析,研究其调控性质,并与相应的疾病 病程对照,找出最有可能的候选治病基因。 4、对候选基因进行致病突变测试,即通过动物模型确定患者体内发生的突变是否可导 致疾病的发生,最终确定该候选基因却是与某种疾病相关。 33.简述噬菌体表面显示技术分离目的基因的原理? 当外源 DNA 片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时,如果两者读码框保 持一致,这个外源 DNA 片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达,并显示 在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物的抗体,通过亲和纯化,就能从大量的噬菌体中 富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后通过基因扩增,得到大量所要的目的基因。 34.简述酵母双杂交系统的原理? 35.受体细胞选择应符合的基本原则? 1、便于重组 DNA 分子的导入。 2、能使重组的 DNA 分子稳定存在于细胞中。 3、便于重组体的筛选。 4、遗传稳定性高、易于扩大培养或发酵生长。 5、安全性高、无致病性、不会对外界环境造成生物污染。 6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞,利于外源基因蛋白表达产物在 细胞内的积累,或促进外源基因的高效分泌表达。 7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性。 8、具有较好的转译后加工机制,便于真和目的基因的高效表达。

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9、在理论研究和生产实践上具有较高的应用价值。 36.酵母菌是外源真核生物基因最理想的表达系统,其优势有哪些? 1、酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相 对较为简单。 2、具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 3、不含有特异性的病毒,不产生毒素。 4、培养简单,利于大规模发酵生产,成本低廉。 5、能将外源基因表达产物分泌至培养基中,便于产物的提取和加工等。 37.利用 CaCl2 法制备感受态细胞的过程? 1.养生命活动旺盛的菌株。 2.淀菌体。 3.合物处理。 38.农杆菌介导的 Ti 质粒载体转化法中,供转化的外植体的选择应考虑哪些方面? 1.优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。 2. 要注意外植体的年龄, 应选择转化能力强的幼期外植体, 同时还要考虑其最佳感受时期。 3.转化外植体易便于组织培养,并有较强的再生能力。 4.应考虑外植体中易转化的分生组织感受细胞所在的部位及其数量。 39.简述农杆菌 Ti 质粒转化的基本程序? 1.外植体的农杆菌接种操作 浸泡时间过长,外植体常因农杆菌毒害而缺氧死亡。常采 用较低的菌液 OD 值和较短的浸泡时间进行外植体的接种。 2.将接种农杆菌后的外植体培养在诱导组织或不定芽固体分化培养基上,随着外植体的细 胞分裂和生长,农杆菌在外植体切口面进行着增值生长,故该培养过程之为农杆菌与外植体的 共培养。 3.脱菌培养是把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。4。 还需将外植体转移至筛选培养基上继续培养,筛选出被转化的细胞。经再分化培养成再生 植株。 40.简述叶盘法转化植物细胞的操作程序? 将试验植物材料的叶片进行表面除菌处理,用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆 形小叶, 然后接种上含有重组 Ti 质粒的土壤农杆菌, 既讲其在过夜培养的农杆菌菌液中浸泡数 秒。这种经接种处理的叶面平铺在培养平皿的滤纸上培养 2d,将滤液连同叶盘转移到含有适量 某种选择药物的“长芽”培养基中,进行筛选与再生培养。将长芽的叶盘在转移到“生根”培 养基上诱导幼芽生根。最后将小植株移栽在土壤中。 41.重组 DNA 分子导入植物细胞的方法有哪些? 1. 农杆菌 Ti 质粒转化法 叶盘法转化植物细胞 整体植株接种转化法 原生质体共培养转 化法 悬浮细胞共培养转化法 2.DNA 直接转移法 多聚物介导法 电穿孔 激光微束穿孔转化法 显微注射法 超声 波介导转化法 脂质体介导法 42.重组 DNA 分子导入动物细胞的方法有哪些? 1.病毒颗粒转导法 2。 磷酸钙转染法 3。DEAE—葡聚糖转染法 4。聚阳离子—DMSO 转 染法 5。显微注射转基因技术 6。电穿孔 DNA 转移技术 7。脂质体介导法 43.简述显色互补筛选法的原理? 的显色剂是 X—gal。具有完整乳糖操纵子的菌体能转译 Z Y A,当培养基中存在诱导物

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IPTG 和 X—gal 时可产生蓝色沉淀物,使菌落呈蓝色。如果在载体 DNA 上组入 LacZ 部分缺失的 片段 LacZ`,则重组 DNA 分子转化 LacZ`互补性菌株,会有含有 X—gal 和 IPTG 的培养基中得到 的转化子是蓝色菌落,而 LacZ`互补型菌落是白色的。当 LacZ`区插入外源基因,转化 LacZ`互 补型菌株, 由于不能转译出有功能的 Z, 再含有 X—gal 和 IPTG 的培养基中得到的转化子是白色 菌落。因此,可以根据菌落蓝白颜色的不同,筛选出真正需要的转化子。 44.简述利用 pBR322 质粒载体克隆基因时,插入失活法筛选出重组子的过程? 45.外源基因 mRNA 有效翻译须考虑哪些基因原则? 1.AUG(ATG)是首选的起始密码子。 2. SD 序列为于核糖体 16SrRNA 互补结合得位点, 该序列至少含有 AGGAGG 序列中的 4 个碱基。 3.SD 序列与翻译起始密码子之间的距离为 3~9 个碱基。 4.在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。 46.从哪些方面考虑可以避免外源基因表达蛋白质降解? 1.构建融合蛋白表达系统。 2.构建分泌蛋白表达系统。 3.构建包涵体表达系统。 4.选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。 47.高效表达外源基因须考虑哪些基本原则? 48.哺乳动物基因表达载体一般包括哪些元件? 1,在哺乳动物细胞中进行基因转录的元件,即转录的启动子,增强子、终止子、poly(A)信 号和内含子剪接信号等。 2.用于筛选转化子的选择标记。 3.在细菌中进行复制和筛选的元件。 4.基因表达的调控元件。

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