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应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法


中国国境卫生检疫杂志 2004 年 12 月第 27 卷第 6 期   Chin J Frontier Health Quarantine Dec. 2004 , Vol 27 , No. 6

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〔 实验室研究与疾病监测〕

应用胶体金免疫层析技术建立炭疽 杆菌芽孢的快速检测方法
李     

  伟 王 静 胡孔新   姚李四   陈维娜   中国检验检疫科学研究院 ( 北京   100025)              闫中强       周 蕾 军事医学科学院微生物流行病研究所
   摘要   目的〕 建立 1 种炭疽杆菌芽孢的快速检测方法。 方法〕 利用胶体金免疫层析技术 ,采用双抗体夹心法检 〔   〔   测炭疽芽孢杆菌 ,对该方法进行特异性、 敏感性等评价 ;在面粉、 淀粉、 奶粉等材料中掺入炭疽疫苗株芽孢模拟 “白色粉 末”评价该法检测炭疽生物恐怖和环境样品的可行性。 结果〕 该法能在 20min 内完成检测 ,多种不同的芽孢菌及其它 , 〔   菌检测评价显示该法特异性良好 ,检测灵敏性为 1 × 6cfu/ ml ,环境样品的检测敏感性也相同。 结论〕 建立的检测炭疽 10 〔   芽孢杆菌的胶体金免疫层析方法 ,能快速、 特异、 灵敏的检测炭疽芽孢 ,适用于现场的快速检测。 关键词   芽孢杆菌 ,炭疽 ; 胶体金 ; 免疫层析法 〔 中图分类号〕R517. 2   文献标识码〕 〔 B

   炭疽 ( anthrax) 是由炭疽芽孢杆菌 ( Bacillus an2 thracis) 引起的人兽共患病 , 是牧区食草动物的一种 常见疾病 。由于炭疽芽孢在环境中抵抗力极强 , 在 军事上一直被列为是头号生物战剂 1 。快速检验和 于炭疽生物恐怖和环境样品的可行性 。
1  材料与方法 1. 1   材料 1. 1. 1   菌株   实验用国产炭疽芽孢杆菌疫苗株 、 鼠

微生物流行病研究所提供 ( 2 者均经腊样芽孢杆菌 吸收) 。2 抗购自鼎国生物制品公司 。 1. 1. 3   层析测试条耗材   结合垫 ( 玻璃纤维) 、 硝酸 ( 型号 HiFlow Plus HFO9002) 、 纤维素膜 样品垫及吸 水垫滤纸购自 Minipore 公司 。
1. 2   方法 1. 2. 1   细菌培养 ( 1) 炭疽芽孢杆菌 ( 疫苗株) 芽孢制备 : 炭疽芽苞

鉴定炭疽芽孢杆菌无论是对人和食草动物炭疽病诊 断 ,还是对可能出现的生物恐怖袭击都十分重要 。 本研究应用双抗体夹心胶体金免疫层析法检测炭疽 杆菌芽孢 ,评价方法的灵敏性 、 特异性 ; 通过检测掺 入炭疽芽孢 ( 疫苗株) 的 “白色粉末” 评价该法应用 ,

杆菌接种于芽孢培养基 ,37 ℃ 培养 2 ~ 3 周 , 孔雀绿 沙黄芽孢染色 , 镜检观察 , 当芽孢占菌体数 95 %以 上时收获芽孢 ,灭菌生理盐水冲洗 2 遍 ,生理盐水重 悬后 ,用平板活菌计数法确定芽孢拷贝数 ,10 倍稀 释 ,4 ℃ 保存备检 。 ( 2) 炭疽芽孢杆菌滋养体细胞及对照菌株培养 : 炭疽芽孢杆菌 、 鼠疫耶尔森菌疫苗株 ( EV76 ) 、 腊样 芽苞杆菌 、 枯草芽孢杆菌 、 巨大芽孢杆菌 、 苏云金芽 孢杆菌 、 覃状芽孢杆菌 、 单增李斯特菌 、 摩登变形杆 菌、 奇异变形杆菌 、 绿脓杆菌 、 粪链球菌 、 鲍志贺菌 、 粘质沙雷菌 、 副溶血性弧菌 、 鼠伤寒沙门菌 、 乙型副 伤寒沙门菌 、 伤寒沙门菌 、 大肠埃希菌 、 肺炎克雷伯 菌、 产气肠杆菌接种于普通液体培养基 ,37 ℃ 培养过 7 夜 ,离心收集菌 ,生理盐水重悬 , 计数为 10 拷贝/ ml ( 比浊计数) 。

疫耶尔森菌疫苗株 ( EV76 ) 、 腊样芽孢杆菌 、 枯草芽 孢杆菌 、 巨大芽孢杆菌 、 苏云金芽孢杆菌 、 覃状芽孢 杆菌 、 假结核耶尔森菌由中国疾病预防控制中心传 染病预防控制所提供 。单增李斯特菌 、 摩登变形杆 菌、 奇异变形杆菌 、 绿脓杆菌 、 粪链球菌 、 鲍志贺菌 、

粘质沙雷菌 、 副溶血性弧菌 、 鼠伤寒沙门菌 、 乙型副 伤寒沙门菌 、 伤寒沙门菌 、 大肠埃希菌 、 肺炎克雷伯 菌、 产气肠杆菌购自中国生物制品检验研究所 。 1. 1. 2   免疫血清   抗炭疽 IgG 由军事医学科学院
国家质量监督检验检疫总局重大科研基金项目

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中国国境卫生检疫杂志 2004 年 12 月第 27 卷第 6 期   Chin J Frontier Health Quarantine Dec. 2004 , Vol 27 , No. 6

1. 2. 2   胶体金颗粒的制备   应用柠檬酸三钠还原法

μ μ 5mg/ ml ,1 l/ cm ; 质控带 : 1mg/ ml , 1 l/ cm) 、 吸水垫依

制备胶体金 ,100ml 双蒸水加热至沸腾 , 加入质量分 次贴上带有粘合剂的底衬卡 , 切成 0. 4cm 的条 , 干燥 数为 1 %的 HAuCl41ml ,加入质量分数为 1 %柠檬酸三 室温贮存备用 。 模拟 检测   称取白色粉末 0. 01g 钠 1. 5ml ( 胶体金颗粒直径 25nm) ,加热 30min ,至溶液 1. 2. 6   “白色粉末” ( 面粉 、 淀粉 、 、 奶粉 脱脂奶粉 、 腻子粉 、 胰蛋白胨粉 、 琼 颜色变为酒红色 ,冷却 ,4 ℃ 避光保存 。 μ 1. 2. 3   确定最低蛋白稳定量   采用分光光度计测定法。 脂粉) ,混入芽孢 ,加入溶解缓冲液 500 l ,使得最终浓 度 1 × 3~1 × 8cfu/ ml ,样品混匀 ,静置 10min ,吸取 10 10 μ L K CO3 调节胶体金 pH 值为 8. 3 ,羊抗炭疽 IgG 抗体高 上层液体 80 l 按下述方法检测 。 2 μ 速离心除去聚集物 ,抗体用 0. 01 的 PB 缓冲液 (pH8. 0) 稀 1. 2. 7  样 品 检 测  将 80 l 样 品 加 在 样 品 垫 上 。 释至 0. 2mg/ ml ,稀释后的抗体与其他试剂按表 1 操作。 15min 后观察结果 。阳性结果为检测带和质控带均 有条带为阳性 ,仅质控带出现条带为阴性结果 , 如没 表1  分光光度计法测定稳定胶体金最小蛋白计量 有出现质控线则为体系失效 。 试          剂 类 别 利用比色法确定金标记最适 pH 为 8. 3 , 用 0. 1 mol/
试验管
1 2 3 4 5 6 7 8 9 对照管 ( H2O)

  抗体 (μ )    l 缓冲液 (μ )    l 胶体金 ( ml )   NaCl (μ ) l 90 10 1. 0 100 80 20 1. 0 100 70 30 1. 0 100 60 40 1. 0 100 50 50 1. 0 100 40 60 1. 0 100 30 70 1. 0 100 20 80 1. 0 100 10 90 1. 0 100 100 100 1. 0 100

2  结果 2. 1   特异性评价   利用上述步骤检测炭疽芽孢杆菌

同属的腊样芽孢杆菌 、 枯草芽孢杆菌 、 巨大芽孢杆菌 、 苏云金芽孢杆菌 、 覃状芽孢杆菌结果阴性 , 同样检测 常见 菌 , 如 : 单 增 李 斯 特 菌 、 疫 耶 尔 森 疫 苗 株 鼠 ( EV76) 、 摩登变形杆菌 、 奇异变形杆菌 、 绿脓杆菌 、 粪 链球菌 、 鲍志贺菌 、 粘质沙雷菌 、 副溶血性弧菌 、 鼠伤 寒沙门菌 、 乙型副伤寒沙门菌 、 伤寒沙门菌 、 大肠埃希 菌、 肺炎克雷伯菌 、 产气肠杆菌等 , 方法特异性良好 。 部分特异检测结果见图 1 。

注: ① 抗体 、 缓冲液 、 胶体金需摇匀 ,放置 2min 后测定 。 ② NaCl 的质量分数为 10 % 。

   按上表加入试剂 ,静止 2h ,含蛋白质量小的管呈 现出由红变蓝的聚沉现象 ,而加入蛋白质达到或超过 最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变 。使红 色保持不变的蛋白含量即为蛋白质最适保护量 ( 5 号 管) ,在此基础上增加 20 %为稳定胶体金的蛋白质的 μ 实际用量 。实验确定蛋白用量为 12 g/ ml 胶体金 。
1.2. 4  免疫胶体金的标记  用质量分数为 1 % 的 K2CO3 调节 100ml 胶体金溶液 pH 为 8. 3 ,羊抗炭疽 IgG

层析条带 1~13 分别为炭疽芽孢杆菌 , 腊样芽孢杆菌 , 枯草芽孢杆菌 , 巨大芽孢杆菌 ,苏云金芽孢杆菌 ,覃状芽孢杆菌 ,鼠疫耶尔森菌疫苗株
( EV76) ,绿脓杆菌 ,粪链球菌 , 鲍志贺菌 , 副溶血性弧菌 、 鼠伤寒沙门

抗体用 0. 01mol/ L , 相应 pH 的 PB 缓冲液稀释至 0.
2mg/ ml ,10 000r/ min ,4 ℃ 离心 1h ; 取上清 ,加入相应体

菌 ,大肠埃希菌 ,C 代表质控带 ,T 代表检测带 ( 下同) 。

图1  胶体金免疫层析法特异性实验结果

μ 积的稳定胶体金的最小蛋白质量 (12 g/ ml 胶体金) ,快

2. 2   敏感性评价   用上述免疫层析试纸条检测炭疽

速搅拌下将抗体逐滴加入胶体金中 ,放置 5min ,加入过 芽孢 ,实验敏感性为 1 ×106cfu/ ml , 换算为反应体系 滤后的 10 %BSA , 继续搅拌 10min ,13 000r/ min 4 ℃离 中的芽孢数 ,体系可最低检测出 8 × 4 个芽孢 ,结果 10 ( TBS ,pH8. 2 含 见图 2 。用炭疽杆菌滋养体细胞检测评价敏感性为 1 心 ,小心弃去上清液 , 用 0. 01mol/ LT ris ) 100ml 将沉淀重新悬浮 ,1000r/ min ,4 ℃离心 × 7cfu/ ml ( 图 2) 。 1 %BSA 10
10min ,留上清液 , 弃去底部的沉淀 , 重复纯化步骤 1 2. 3   “白色粉末” 检测   模拟含炭疽芽孢的粉末 , 用 次 ,底部疏松沉淀用 10ml TBS (含有质量分数 0. 02 %叠 免疫层析方法检测面粉 、 淀粉 、 奶粉 、 脱脂奶粉 、 胰蛋 氮钠 ,1 %蔗糖) 重悬浮 ,4 ℃ 贮存备用。 白胨粉 、 琼脂粉中均为阳性反应 , 检测底线仍为 1 × 1. 2. 5   免疫层析测试条的制备   样品垫 、 结合垫 ( 加 106cfu/ ml ,图 3 为上述粉含 1 × 7cfu/ ml 炭疽芽孢的 10 入标记好的胶体金 , 干燥 ) 、 硝酸纤维素膜 ( 检测带 : 结果 。含炭疽芽孢的腻子粉检测结果显示体系实效 。

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的敏感性弱。掺入腻子粉的环境样品检测失效 ,原因 是腻子粉 (pH12) 影响了反应的正常进行。盲法考核结 果提示 ,该法准确性较高。 炭疽芽孢杆菌的抗原成分分为芽孢抗原 、 荚膜 抗原 、 菌体多糖抗原 、 炭疽毒素抗原等 。其中炭疽芽
条带 1 ~ 8 分 别 为 1 ×108cfu/ ml ; 1 ×107cfu/ ml ; 1 ×106cfu/ ml ; 1 ×
105cfu/ ml ;1 × 4cfu/ ml ;1 × 3cfu/ ml ; 阴性对照 2 组 。 10 10

图2  胶体金免疫层析法特异性实验结果

条带 1~10 为炭疽芽孢 、 含炭疽芽包的面粉 、 淀粉 、 奶粉 、 脱脂奶粉 、 胰蛋白奶粉 、 琼脂粉 、 腻子粉 ,阴性对照 2 组

图3  检测含炭疽芽孢粉末的结果

2.4   盲法考核   选取芽孢菌株 (1 × 7cfu/ ml ;) ,包括炭 10

疽杆菌疫苗株芽孢、 炭疽杆菌疫苗株滋养体细胞、 腊样芽 孢杆菌、 枯草芽孢杆菌、 巨大芽孢杆菌、 苏云金芽孢杆菌、 覃状芽孢杆菌 ,打乱次序 ,双盲检测 ,准确率为 100 %。
3  讨论

   免疫层析是一种快速免疫分析技术 , 最早应用 于早早孕诊断 ,现已用于多种传染病 、 寄生虫感染的 检测 , 如 : 应用免疫层析技术检测狂犬病毒 2 、 恶性 疟原虫 。免疫层析技术是以微孔膜为固相载体 , 膜 上包被已知抗原或抗体 ,加入待测样本后 ,经微孔膜 的毛细虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被 的抗体或抗原结合 ,通过胶体金标记物 ( 或其它指示 剂) 标示反应结果 。 免疫层析实验的特异性决定于所选用抗原、 抗体 的特异性。本实验采用双抗体夹心法检测炭疽杆菌芽 孢 ,实验用抗体为腊样芽孢杆菌吸收后的炭疽杆菌芽 孢多克隆抗体。通过特异性评价 ,说明该抗体特异性 良好 ,具有较强的炭疽芽孢专一性。本实验通过抗体、 胶体金标记物及样品处理缓冲液的优化 ,较好地避免 了假阳性或假阴性。纯芽孢及模拟 “白色粉末” 检测的 敏感性为 1 × cfu/ ml ,敏感性评价中 ,检测纯芽孢 1 × 10
10 cfu/ ml 时可见较质控带弱的条带 ,出于提高把握度
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和特异性的考虑 ,本实验仍将敏感性定为 1 × 6cfu/ 10
ml 。此法检测炭疽杆菌滋养体细胞敏感性较检测芽孢

孢抗原由芽孢的外膜 、 皮质等组成 ,是炭疽芽孢的特 异性抗原 ,具有免疫原性和血清学诊断价值 。成熟 的炭疽芽孢具有多层膜结构 , 芽孢的核心 ( core ) 是 芽孢的原生质体 ,含有细菌的主要生命基质 ,外膜系 统从外到内依次为外衣 ( exosporium) 、 芽孢壳 ( coat ) 、 外膜 (outer membrane) 、 皮质 ( cortex) 、 内膜 ( inner mem2 brane) 。炭疽芽孢的外衣为气球样松散结构 , 对炭 疽芽孢的抗原性非常重要 ,其中的 BclA 蛋白对芽孢 的免疫反应起决定作用 。本实验用羊或兔的炭疽抗 体均为炭疽杆菌芽孢经甲醛灭活后免疫实验动物所 得的抗体 ,其针对性强 ,适于炭疽芽孢的检测 。 炭疽芽孢杆菌强毒株和炭疽疫苗菌均能在有氧 条件下形成芽孢 ,国产炭疽疫苗株和强毒株相比 ,前 者缺失 pXO2 质粒 ,pXO2 质粒主要编码荚膜合成酶 , 对炭疽杆菌侵染宿主后逃避巨嗜细胞吞噬与炭疽侵 袭力有关 。因此炭疽疫苗株芽孢的检测和评价能代 表炭疽杆菌强株芽孢的检测 。一个强毒菌侵入敏感 宿主 ,在动物死亡之前每毫升血液中超过 108 个细 菌 。 9? ” “ 11 之后的 “炭疽白色粉末邮件” 中活炭疽芽 孢量更大 。通过采集粉末或表面采样 , 空气中芽孢 富集等 ,该法完全可用于实际样本的检验和筛查 。 本实验建立的炭疽芽孢杆菌的胶体金免疫层析 方法适用于现场快速检测 , 尤其是对生物恐怖袭击 的含炭疽芽孢的白色粉末检测 , 具有简便 、 快速 、 特 异、 灵敏 、 稳定等特点 , 对环境样品的筛检亦有效 。 该法通常能在 15 ~ 20min 完成检测 , 样品处理方法 简便 ,操作灵活 , 不需要其它辅助仪器 , 结果可直观 判断 ,因此应用前景广阔 。 (致谢 :感谢中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所人兽共患病室提供芽孢等对照菌株。感谢军 事医学科学院微生物流行病研究所提供抗炭疽 IgG) 。
参考文献
1  俞东征 . 第三界国际炭疽学术会议简介 . 中国媒介生物学

及控制杂志 ,1999 ,10 (3) :219~224

2  徐葛林 ,胡巧玲 ,吴杰 ,等. 检测狂犬病毒的胶体金免疫层析

法的建立及应用. 中国人兽共患病杂志 ,2004 , (3) :236~240
〔 收稿日期 :2004 - 11 - 10〕


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