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改进的CTAB提取植物DNA方法


  28 卷 第 9 期 第  2009 年 9 月

实 验 室 研 究 与 探 索
RESEARCH AND EXPLORATI N I LABORATORY O N

Vol 28 No. 9   . Sep. 2009  

? 实验技术 ?

改进的 CTAB提取植物 D NA 方法
李荣华 ,   夏岩石 ,   刘顺枝 ,   孙莉丽 ,   郭培国 ,   缪绅裕 ,   陈健辉
1 2 1 1 1 1 1

( 1. 广州大学 生命科学学院 ,广东 广州 510006; 2. 华南理工大学 轻工与食品学院 , 广东 广州 510640 )

摘   : 根据 DNA 分子的物理化学特性及植物材料的特点 , 改进了传统利用十六烷基三甲基溴化铵 要 ( CTAB )法提取植物叶片中 DNA 的操作方法 ,采用新鲜配制的 CTAB 溶液 、 液氮快速研磨植物材料 、 添 加适量还原剂和适量吸取提取液中核酸层等措施 ,减少了提取过程中提取液的褐变和杂质对 DNA 产质 量的影响 。同时 ,列出了提取过程中各操作步骤的注意事项和关键点 。该方法操作简便 、 快捷 ,提取出 的 DNA 质量较好 ,能很好地用于 DNA 的分子遗传特性分析 , 可作为教学和研究工作中植物 DNA 的提 取方法 。 关键词 : 植物 ; DNA 分子 ; DNA 提取 中图分类号 : Q 5 2     33 文献标识码 : A     文章编号 : 1006 - 7167 ( 2009 ) 09 - 0014 - 03
1

基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30871526) ; 教育部留学归国人 员科研启动基金 资助项 目 ( 2007 2 1108 ) ; 广东 省 科技 计 划资 助 项 目
( 2008B050300003)

子生物学和生物化学的教学和研究工作 。

子生物学和生物化学的教学与科研 。

L I R ong 2hua ,  X IA Yan 2sh i ,  L IU S hun 2zh i ,  SUN L i2li ,   GUO Pei2guo ,   M IAO S han 2yu ,  CHEN J in 2hu i
2 1 1 1 1

( 1. College of L ife Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China;

2. College of L ight Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China )

p rovement of DNA isolation m ethod w ith CTAB was made. The p rogresses in the im p roved method mainly include: ① to

Abstract: On basis of the physical and chem ical characteristics of DNA molecule and the traits of p lant tissues, an i 2 m use fresh CTAB solution, ② to grind p lant tissues w ith liquid nitrogen, ③ to add suitable reducant in extraction solution tion solution and reduce im purities In addition, notes and key points for the p rocedures of DNA isolation were described . sis of DNA molecular genetic characteristics Therefore, it is a suitable m ethod for p lant DNA isolation in teaching and . research p rogram.

1    引 言

and ④ to p ipette app rop riate nucleic acid solution from supernatant These measures can p revent brown stain in extrac2 . Key words: p lant; DNA molecular; DNA isolation

   生命科学史上有几个著名的实验证明了生命的遗

in the method. Its operation is simp le and rap id, the DNA isolated w ith this method can be efficiently used for the analy2

收稿日期 : 2008 - 11 - 04

作者简介 : 李荣华 ( 1966 - ) , 女 , 云南个旧人 , 实验师 , 主要从事分
Tel : 020 2 . 88531563; E 2 mail: ronghua@ gzhu. edu. cn 通信作者 : 郭培国 ( 1963 - ) , 男 , 湖南黄冈人 , 教授 , 研究方向为分 Tel : 020 2 . 88531563; E 2 mail: guopg@ gzhu. edu. cn

CTAB 2i p roved M e thod of DNA Extrac tio n in P lant m
[1] [3]

1

传物质是 DNA。 Griffith 用肺炎双球菌对小鼠进行 活体实验 , 为发现 DNA 是遗传物质打下了坚实基础 ; [2] Os wald 领导的一个研究小组所作细菌转化实验 , 基 本上否定了一直以来认为蛋白质是遗传物质的观点 ; 在此基础上 , Hershey 确定出 DNA 分子就是生命的 遗传物质 。至此 ,生命科学研究进入一个崭新的研究 时代 ——DNA 时代 。为了进一步认识和了解 DNA 的 — 本质和特征 ,研究人员摸索出多种分离提取 DNA 的方 [3] 法 ,如氯化铯法 、 法和一管法等 ,并在动 、 SDS 植物和 微生物的 DNA 研究中运用 。由于这些 DNA 提取方法 有的成本高和使用会造成环境污染的化学诱变剂溴化 乙淀 ,有的不稳定和效果不够理想 。我校本科教学实

  9期 第

李荣华 ,等 : 改进的 CTAB 提取植物 DNA 方法   

15

验中难以开出这样的实验 。随着这一技术逐步改进 , 如 Saghai2 aroof 等 研 发 出 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 M ( CTAB )法用于提取植物 DNA [ 4 ] 等 , 使得 DNA 的提取 相对较为快捷 ,提取的质量提高 。近几年来随着我校 对实验设备大量投入 , 一批适合于现代生命科学教学 和研究需要的仪器和设备能够满足要求 。 较为理想的提取植物 DNA 的方法
[5]

4  D NA 提取材料及步骤
   一般以鲜嫩的植物叶片为宜 , 其中以随收集随提 取最佳 ; 如不能做到 ,则应及时贮藏在液氮中或 - 20 ℃ 的冰箱中尽快提取 。 在开展 DNA 提取工作前 ,需要完成 4 方面的准备 工作 : ①水浴锅温度升至 65 ℃; ②将提取缓冲液置于 水浴锅中预热 ; ③ 在冰箱中预冷异丙醇和 24 ∶ 的氯 1 仿∶ 异戊醇混合液 ; ④ 学生 2 人一组 , 每组分有 1. 5、 2 mL 无菌离心管各 1 支 ,并作好标记 。之后可按下列操 作步骤和注意事项进行 。 ( 1 ) 称取 0. 5 ~1. 0 g的植物幼嫩叶片 , 搁置于研 钵中 ,加入约 30 mL 的液氮 ,轻轻捣碎叶片 , 等液氮快 挥发完时 ,快速研磨到粉状 (越细越好 ) , 把粉末转移 到有标记的 2 mL 无菌离心管中 。此步操作应戴手套 , 防止皮肤冻伤 。 ( 2 ) 加入 650 μL 预热的 DNA 提取缓冲液 , 用力 振荡 1 ~2 m in, 马上放入 65 ℃水浴锅中保温 45 m in 以上 ,其间 ,每隔 15 m in用手轻微振荡 3 或 4 次 。 ( 3 ) 从水浴锅中取出样品管 ,加入 650 μL 预冷的 24 ∶的氯仿 ∶ 1 异戊醇 ,盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动 5 ~10 m in。 ( 4 ) 在 10 000 r/m in 下离心 10 m in。 ( 5 ) 用移液枪缓慢吸取上层清液约 500 ~700 μL 到做好标记的 1. 5 mL 离心管中 。此步操作应非常小 心 ,注意不要吸得过多 、 过快 ,避免振荡 ,以免造成蛋白 质污染 ; 如果离心层因振荡引起上清液浑浊 ,将影响提 取效果 ,此时须要再离心 。 ( 6 ) 在获得的上清液中加入预冷的异丙醇 , 加入 量按吸取上清液体积的 2 /3 计 , 约 330 ~470 μL。轻 轻上下摇动离心管 , 注意观察 DNA 将从溶液中析出 。 如溶液中 DNA 含量较少 ,将会观察到管中含有白色悬 浮的 DNA 颗粒 ; 如样品中 DNA 含量较高 ,则可观察到 白色絮丝状的 DNA 悬浮于溶液中 。 ( 7 ) 此步可根据学时数灵活掌握 。或静置此样品 于 4℃ 冰箱 1 h,或过夜 ,或马上在 8 000 r/m in 条件下 离心 5 m in,继续提取 DNA。 ( 8 ) 离心后 ,小心倒掉上清液 ,用纸吸去管壁处多 余的溶液 ,保留 DNA 沉淀于管底 。 ( 9 ) 加入 70%乙醇 600 μL 洗涤沉淀 , 振荡起沉 淀数秒钟 , 5 000 r/m in 条件下离心去上清液 。再重复 步骤 ( 9 )洗涤沉淀 1 次 。 ( 10 ) 室温下干燥 DNA 沉淀 , 在见到无色胶状物 附在管 壁 时 , 加 入 80 μL 无 菌 蒸 馏 水 溶 解 沉 淀 的
DNA。 ( 11 ) 此步用于要求较高的科研中 。一般来讲 , RNA 不影响 DNA 特性的分析 , 如想获得不含 RNA 的

在众多的 DNA 提取方法中 ,发现 CTAB 法是一种 。根据我院实验

室仪器设备的具体情况 , 我们多次使用 CTAB 法后发 现 ,这种方法还可以进一步的改进和完善 。在多次指 导学生开展教学和研究活动过程中 , 总结出一种适合 于我院学生学习和开展研究活动的 、 操作简便且效果 好的 DNA 提取方法 ,该方法可以使学生在较短时间获 得理想的实验效果 ,除了能直接观察到 DNA 的丝状沉 淀外 ,在琼脂糖电泳中还可确定出所提取 DNA 分子的 大小 。

2  基本原理

   利用 CTAB 在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质

和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物 , 但不 沉淀核酸的特性 , 用离心获得含 DNA 的上清液 ; 用氯 仿和异戊醇混合液使蛋白质变性 、 分层 ,同时除去脂类 的方法 ,从而达到提取和纯化 DNA 的目的 。

3  仪器设备与主要化学试剂

3. 1   仪器设备

   实验所需仪器设备较为简单 , 主要有研钵 、 离心

机、 水浴锅 、 、 天秤 灭菌锅 、 移液枪和电泳仪等 。
3. 2   化学试剂与用品

醇、 、 氯仿 异戊醇 、 异丙醇 、 乙醇和液氮等 。
3. 3  D NA 提取缓冲液

醇不能进行高温灭菌 ,因此 ,在配制提取缓冲液之前应 将其他成分进行高温灭菌 ,之后加入这 2 项试剂 。
表 1  D NA 提取缓冲液 ( 100 mL )的配制成分表
试剂名
CTAB

   根据 CTAB 提取 DNA 的原理 ,配制如表 1 所示的 DNA 提取缓冲液 。需要注意的是 , CTAB 和 β2 基乙 巯
  最终浓度 用  量
2 g 2% 1. 4 mol/L NaCl 28 mL 4 mL 20 mmol/L 0. 5 mol/L EDTA pH 8. 0 1 mol/L Tris2 HCl pH 8. 0 H2 O 100 mmol /L 10 mL 2 mL 2% 幼嫩组织

2. 5% ~3%成熟组织

β巯    主要有 NaCl、 EDTA、 、 l、CTAB、 2 基乙 Tris HC
β2 基乙醇 巯
2. 5 ~3 mL

定容至 100 mL

16

实              验 室 研 究 与 探 索

第 28 卷  

DNA 样品 , 在提取获得的 DNA 样品管中加入 2 μL RNase,就可得到高质量的 DNA 样品 。 ( 12 ) 得到的样品于冰箱 - 20 ℃ 保存备用 。 ( 13 ) 采用紫外分光光度计法检测 DNA 的含量 ,

检测 260、 nm 处的 OD 值 ,计算得出 DNA 的含量 。 280 如 OD260 /OD280 = 1. 8 左右 , DNA 较为纯净 ; < 1. 8, 则 有蛋白污染 ; > 1. 8, 则有 RNA 污染 。同时 , 还可进一 步用 1%的琼脂糖电泳检测 DNA 的质量 ,以得到非常 直观的效果 。图 1 是提取 DNA 样品的电泳图 ,表明获 得的 DNA 有较高的质量 。

量 ,避免蛋白质污染 ; ⑤ 去除样品中残留的 RNA。在 提取获得的 DNA 样品中加入 RNase,就可得到高质量 的 DNA 样品 ; ⑥对 DNA 提取的各项操作步骤进行了 较为详细的描述 ,给出了注意事项 ,减少学生的操作失 误 。利用此改进方法 , 步骤简单 , 学生容易学习和掌 握 ; 实验现象明显 ,能够获得理想的实验效果 , 达到教 学目的 。在实践中 , 已用此方法提取出高质量 DNA , [ 62 ] 10 用于更深入的研究并已发表了多篇研究论文 。因 此 ,这种方法是适合教师在教学 、 学生在学习和科研中 使用 。 参考文献 ( References) :
[ 6]  李荣华 , 郭培国 , Bai G. 小麦中与低脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量

[ 1 ]  Griffith F. The significance of pneumococcal types [ J ]. Journal of [ 2 ]  Avery O T, MacLeod C M , McCartyM. Studies on the chem ical na2 ture of the substance inducing transformation of pneumococcal types [ J ]. Journal of Experim ental Medicine, 1944, 79: 137 2 159. [ 3 ]  Hershey A D , Chase M. Independent functions of viral p rotein and iology, 1952, 36: 39 2 56. ing, 2008, 22: 1 2 13. [ 4 ]  Saghai2 Maroof M A , Solim an K M , Gorgensen R A , et a l R iboso2 . [ 5]  席在星 . 三叶木通 RAPD 最佳反应体系的研究 [ J ]. 实验室研究 [ 7 ]  Guo P, Bai G, L i R , et a l Resistance gene analogs associated with . FHB resistance in wheat[ J ]. Euphytica, 2006, 151: 251 2 261. ing drought[ J ]. Euphytica, 2008, 163: 203 2 214. [ 9 ]  Guo P, Baum M , Varshney R K, et al QTL s for chlorophyll content . Hygiene, 1928, 27: 113 2 159. 8014 2 8018. 2006, 5 ( 6) : 45 2 51.

泳道 1 — 标准相对分子质量 λ2 DNA 泳道 2 ~7 — 从大麦不同品种中提取的 DNA

图 1  用改进的 CTAB 法提取到的大麦叶片中的 DNA
( 1%的琼脂糖电泳检测 )

5    讨 论
   高质量的 DNA 是进行植物分子生物学研究的基 础 。由于植物组织 , 如叶片中含有较高的多酚 、 蛋白 质、 、 脂类 多酯的角质等不利于 DNA 提取的干扰物质 , 利用常规的 CTAB 方法等难以获得高质量 DNA。究 其原因 ,主要是提取所得的 DNA 样品中含有较高含量 的蛋白质 ,甚至具有多酚氧化的褐色物等 ,从而影响利 用 DNA 进行进一步的特性分析 (如酶切 , PCR 反应 等 ) 。针对这种情况 , 根据我们的实验条件和多年来 在提取植物 DNA 技术上的经验 ,对 CTAB 法进行了如 下改进 : ① 尽量随采随收幼嫩的植物组织作为提取 DNA 的材料 ; ②采集的样品及时放入液氮中 , 减少植 物组织中 DNA 的降解 ; ③对较老的植物组织 ,适当加 大β2 基乙醇的用量 (可达 2. 5% ~3% ) ,减少组织的 巯 褐 变 ; ④减少在 DNA提取步骤 ( 5 ) 中吸取上清液的

   建立网络化的实验教学和实验室管理信息平台 , 实现网上辅助教学和 网络化 、 智能化管理。

[ 10 ]  Varshney R K, Thiel T, Sretenovic2 Rajicic T, et a l Identification .

[ 8 ]  Guo P, Bai G, L i R, et al Molecular characterization of atlas 66 2 . erance[ J ]. Agricultural Sciences in China, 2007, 6 ( 5) : 522 2 528. ers for assaying functional diversity in barley[ J ]. Molecular B reed2 derived wheat near2isogenic lines contrasting in alum inum (A l) tol2 and chlorophyll fluorescence parameters in barley under post2flower2 and validation of a core set of infor mative genic SSR and SNP mark2

与探索 , 2006, 25 ( 6) : 608 2 610, 630.

关联的抗性基 因类 似 物 [ J ]. 广 州 大 学 学 报 (自 然科 学 版 ) ,

mal DNA spacer2length polymorphis in barley: Mendelian inherit2 m ance, chromosomal location and population dynam ics[ J ]. Proceed2 ings of the National Academy of Sciences of the USA , 1984, 81,

nucleic acid in grow th of bacteriophage[ J ]. Journal of General Phys2

摘自《 教高 [ 2005 ] 8 号文件 》



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