当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

核外遗传与质体基因工程


核外遗传与质体基因工程
陈穗云

第一部分 概述
? 一、概念 ? 核 外 遗 传 (Extranuclcar inheritance) 又叫染色体外(extrachromosomal)遗传、 非孟德尔 (nou—Mendelian)遗传、细胞 质(cytoplasmic)遗传、母性(maternal)遗 传和细胞器(organelle)

遗传等。染色体以 外的遗传因子所表现的遗传现象。

植物正反杂交子代的某些性状都相 同于母本,这是最早发现的染色体外遗 传现象。这里性状相同于母本的原因是 由于控制这些性状的遗传因子是在细胞 质中,而高等植物的合子的细胞质又几 乎全部来自雌性配子。母体影响在现象 上相似于染色体外遗传或母体遗传,即 正反杂交子代的某些性状相同于雌性亲 本,不过这是由于核基因的产物积累在 卵细胞的细胞质中造成的,因此不属于 染色体外遗传的范畴。

例如在地中海粉螟中,基因A使幼虫 含色素,基因a使幼虫不含色素。正反杂 交aa♀×Aa♂和Aa♀×aa♂的子代的基 因型都是Aa和aa两种。基因型Aa的幼虫 含有色素。但是基因型aa的幼虫则因正反 交而不同,由前一杂交得来的aa幼虫不含 色素而由后一杂交得来的则含有色素。原 因是后者的卵来自Aa雌性亲本,由于卵母 细胞中A基因的存在,因而经减数分裂产生 的卵不论基因型是A或是a,它们的细胞质 中都含有A基因的产物,即色素的前体以及 由前体所合成的色素。

二、研究简史
? 1900年德国植物学家兼遗传学家C.E.科伦斯 重新发现孟德尔定律后,又于1909年报道了 不符合于孟德尔定律的遗传现象。他发现在 紫茉莉(Mirabilis jalapa)中黄绿色叶♀×绿 色叶♂的杂交子代都是黄绿色叶,绿色叶 ♀×黄绿色叶♂的杂交子代都是绿色叶。德 国学者E.鲍尔在同一年中报道了天竺葵 (Pelaronium zonale)中的类似现象,并且认为 这是由于叶绿体的独立自主性所造成的。

孟德尔的五个定律和孟德尔遗传的机制 ? 孟德尔遗传模型仍然是大多数核基因遗 传的重要特征为人接受的观点。对于生 物模型来说,孟德尔模型有极大的通用 性,虽然我们现在了解许多例外(如连 接)。课本通常谈到孟德尔的第一个和 第二个定律,但是他用于解释他的数据 模型实际上有五个组成部分在他的论文 中明示或者暗示出来。1909年,Erwin Baur发现Pelargonium的叶绿体基因违 反了孟德尔五个规律中的四个:

(一)在无性繁殖中,核基因的等位基因不能 分离:杂合细胞产生杂合子代。我们现在知道 这是因为核基因组是约束性基因组,在其中 (a)所有染色体只复制一次而且只在间期复 制一次;而且(b)有丝分裂确定了子代细胞 都得到每个染色体的一个复本。通过对比,异 质细胞中的细胞器基因的等位基因在有丝分裂 期分离。这种营养分离发生是因为细胞器是松 弛型基因组,细胞器基因组的一些拷贝能比其 他复制的更频繁,出于偶然性或者与选择压力 或复制中的固有优势相对应,而且等位基因能 在胞质分裂中能偶然分离。

(二)核基因的等位基因在减数分裂过程中

一直在分离,配子半数得到一半等位基因, 其他配子得到另一半。细胞器基因的等位 基因在减数分裂时或分裂或不分裂,机制 与营养分离相同。
(三)核基因的遗传是双亲的。相比来说, 细胞器基因经常是从一个亲本遗传而来的 (即单亲遗传)。

(四)不同核基因的等位基因独立地分离 (孟德尔的第二个规律),作为减数分裂时染 色体独立分离的结果和相同染色体上基因之间 重组的结果。相比而言,细胞器基因几乎总是 在一个单个染色体上,而且由于单亲遗传或者 细胞器融合及交换基因组失败而导致的重组常 常十分有限。
1)

(五)关于配子基因型的受精是随机的。这是 孟德尔模型唯一一个应用于细胞器和核基因的 部分。

1924 年德国学者 R.von 韦特施泰因报道了 葫芦藓(Furnaria)中的母体遗传现象,并提出 细胞质基因组这一名词,用来概括细胞质中的 全部遗传物质。
P.米凯利斯从 20年代开始对柳叶菜属 (Epilobium)植物连续进行了二、三十年的研究, 分析了若干种性状的母体遗传现象。

E .hirsutum ♀ × E .roseum ♂ F1 花器官发育不正常

E. hirsutum ♂ × E. roseum ♀
F1发育正常

E. roseum ♀ × E. hirsutum ♂ F1 ♀ × E. hirsutum ♂ BC25 回交25代 (核成分应该完全是E. hirsutum,
胞质完全是E. roseum )

BC25♀(h核r质) × E. hirsutum ♂

BC25♂(h核r质) × E. hirsutum ♀

可育

不育

不育性状是由E. hirsutum 的胞质中的某种遗传因子决定的

在这一段时期中还出现了一些有关细胞质 遗传的名词。例如1937年日本学者今井提出质 体基因,用来指叶绿体中的遗传因子;1939年 英国细胞学家C.D.达林顿提出细胞质基因,用 来泛指细胞质中的独立自主的遗传因子。1937 年法国学者P.莱里蒂埃报道了果蝇对于二氧化 碳敏感性状的非孟德尔式遗传现象。随后证实 这种现象是果蝇被σ病毒感染所致。

1943年美国学者M.M.罗兹在玉米中报 道一种白色条纹叶──埃型条纹性状的非孟 德尔式遗传现象。后来知道埃型条纹性状来 源于核基因突变,这是核基因和细胞质基因 相互作用的第一个例子 40年代中微生物遗传学研究广泛开展以 后又陆续在酵母菌、脉孢菌等微生物中发现 染色体外遗传现象。1943年美国学者T.M.索 恩本在双小核草履虫中发现放毒性的遗传属 于非染色体遗传,而且证明这是由一种和草 履虫共生的微生物卡巴带来的性状。


1949年法国学者B.埃弗吕西等在啤酒酵 母中发现了小菌落突变型 (petite,)它的线 粒体中缺少某些细胞色素成分。小菌落突 变型有染色体外遗传和染色体遗传两类, 前者称为营养型小菌落,后者称为分离型 小菌落。这两类突变型的存在说明线粒体 的形成同时受核基因和线粒体本身的控制。

1952年美国学者J.莱德伯格继 50年 代初大肠杆菌中的F因子和λ 噬菌体中的 溶源性的发现之后,提出了质粒这一名词, 用来指染色体外的全部独立自主的遗传 因子,包括σ 因子等共生生物、线粒体 和叶绿体等细胞器以及F因子这一类单纯 的DNA分子。不过现在质粒这一名词已用 来专指最后一类遗传因子了。1963~ 1964年分别确证了线粒体和叶绿体中存 在着DNA,从此以后染色体外遗传的研究 已逐渐成为分子遗传学中的重要领域。

三、判断依据
? (一)正反交结果不同 这是最早在高等植物 中发现的判断染色体外遗传的依据。这一依据 在某些微生物如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 中同样适用。因为杂交可以通过将一个菌株的 分生孢子放到另一菌株的原子囊果上的方式进 行。在这样的杂交中,细胞质几乎全部由原子 囊果所提供,可以把它比作高等植物的雌性配 子,而分生孢子几乎不提供细胞质,可以比作 高等植物的雄性配子。例如对于一种和线粒体 的缺陷有关的生长缓慢的突变型po来讲, po♀×+♂和+♀×po♂正反交结果完全不同, 前者的杂交子代都生长缓慢,而后者的杂交子 代都是正常的。

(二)不分离现象 多数微生物是单倍体, 染色体基因在杂交子代中按 1:1分离。例 如啤酒酵母的分离性小菌落和野生型的杂 交子代中双亲的类型按 1:1分离,这说明 分离性小菌落的遗传属于染色体遗传范畴。 可是表型同属于呼吸缺陷的营养性小菌落 和野生型的杂交子代全部都属于野生型, 说明营养性小菌落的遗传属于染色体外遗 传。脉孢菌的po突变型除了表现正反交结 果不相同现象以外,实际上也表现不分离 现象。

(三)性状随着染色体以外的细胞质成分的 转移而改变 按照生物的特性,可以通过不同的途径把 一个生物的细胞质转移到另一生物中,如果 后一生物因此而获得前一生物的某些性状, 说明这一性状的遗传方式属染色体外遗传。 细胞质可以通过多种方式转移。

1、注射 在某些种类的果蝇中有一种称为性比 的因子。它使子代中只出现雌性个体。把 具有这一性状的果蝇的体液注射到正常的 雌蝇体内,可以使后者变为只产雌蝇。黑 腹果蝇(Drosophila melano aster)中的另 一性状──对二氧化碳敏感也属于同一类型。 关于粗糙链孢霉菌的po性状,也曾用注射 去核的细胞质的方法证明它的遗传方式属 染色体外遗传。

2、接合转移 大肠杆菌(Escherichia coli)可以通过 细菌接合在不发生染色体转移的情况下 转移它的 F因子,而且使接受F因子的 细菌的后代都具有F因子,说明F因子的 遗传属染色体外遗传。同样证实属染色 体外遗传的还有草履虫的放毒性、大肠 杆菌以及其他一些细菌的抗药性等。

3、通过形成异核体的转移 放线菌的菌丝细胞很容易联接在一起。 如两个核基因有区别的菌株的菌丝相互联接, 从联接处长出的菌丝中便有两种核,这样的菌 丝体称为异核体。如果这是一种产生单核分 生孢子的生物,那么在形成分生孢子时异核 体的两种细胞核分别出现在不同的分生孢子 中,但是已经混合的细胞质则不再分开。按 照核基因标记分离两种单孢子菌株,如发现 有性状转移,就说明这一性状的转移和细胞质 的混合有关,因而属于染色体外遗传。马铃薯 疮痂病链霉菌 (Streptom ces scabies)黑色素的 遗传可以说明这一原理。

(四)性状并不随着染色体的转移而转 移 这是反面的依据。染色体的转移可 以通过两种方式进行: 1、多次回交 通过多次和雄性亲本回交,最后可 以得到细胞质来自一个品系而染色体则 几乎全部来自另一品系的杂交子代。如 果雌性亲本的某些性状并不由于通过多 次回交后染色体被取代而改变,便可以 认为这些性状的遗传属于染色体外遗传。 在柳叶菜和脉孢菌中,都曾用此法证明 了一些性状的遗传属于染色体外遗传。

2、核移植 通过显微操作可以把一种变形虫的核取 出,将另一种变形虫的核注入,然后观察 某些性状是否因此而发生变化。如在盘状 变形虫(Amoeba discoides)和巨大变形虫 (A.proteus)之间进行核移植实验的结果。 说明链霉素抗性的遗传属染色体外遗传。 在高等真核生物中,用细胞松弛素B可以得 到去掉细胞核的胞质体,然后把它和另一 个没有去核的细胞融合(,得到细胞质来 自一个品系而细胞核和少量细胞质来自另 一品系的核质杂种细胞。

如果去核的胞质体中的某一性状的维持 并不因为引入另一品系的细胞核而改变, 说明这一性状的遗传属于染色体外遗传。 通过这种方法曾证明小鼠和人的海拉细 胞中的氯霉素抗性的遗传属于染色体外 遗传,而且还进一步证明抗性和线粒体 有关。

(五)消除 某些性状可以由于一些环境因素的 处理而被消除,这也是判断染色体外遗 传的一种依据。例如吖啶类染料可以使 一些抗药性细菌变为敏感的细菌;加速 草履虫放毒品系的分裂速度可以使它变 为非放毒品系等。染色体基因突变型可 以通过回复突变而成为原来的野生型, 可是被消除的性状不再重新出现,说明 这些性状的遗传依赖于染色体外的遗传 因子。

四、物质基础
? 染色体外遗传是染色体外的遗传因 子(细胞器、内共生生物和质粒)传递 的结果。 1、细胞器的存在只限于真核生物,是 真核生物生命活动不可缺少的细胞成分。 例如线粒体是细胞进行有氧呼吸所必需 的,叶绿体是细胞进行光合作用所必需 的,中心粒是细胞分裂所必需的。

2、共生生物在真核生物和原核生物中都 有发现。质粒虽然最初是在原核生物的 细菌中发现的,而且大量的质粒都是在 细菌中发现,但在低等的真核生物如酵 母菌中也有发现。内共生体和质粒虽然 也编码某些蛋白质,并且控制宿主细胞 的某些遗传性状,但都不是生命活动所 必需的。

3、内共生体 草履虫的放毒性状是由于 放毒品系细胞中有一种卡巴(k)颗粒。卡巴 粒长约1~5微米,外面有双层膜,革兰氏染 色阴性,富尔根染色阳性,含有DNA、RNA 以及一些酶系和细胞色素。每一细胞中的 卡巴粒数目可以少到几个,多到几百个。 卡巴粒还可以发生突变。虽然卡巴粒的离 体培养还没有成功,可是一些和它相似的 颗粒如λ和μ都可以离体培养。已经公认它 们是一类和细菌相类似的共生生物。

同样地已经证明果蝇的性比因子 是一种螺旋体。果蝇的二氧化碳敏感 因子是一种病毒,呈炮弹形,和水泡 性口膜炎病毒很相似。
4、质粒 见质粒。

5、线粒体 酵母菌的小菌落突变型就 是线粒体发生缺陷的结果。 酵母菌中呈现染色体外遗传的性状 除了小菌落突变型以外,还有氯霉素抗性 (chloramphenicol resistance,cap)、红 霉素抗性(erythromycin resistance, ery)、寡霉素抗性(oligomycin resistance,oli)、巴龙霉素抗性 (paromomycinresistance, par)等。线粒 体遗传学研究主要通过三个方面进行:

重组分析 分析方法在原则上和测定减数 分裂中基因重组频率的基因定位方法相同。 缺失分析 小菌落突变型可以通过溴化乙 锭(EB)等诱发,这样产生的小菌落突变型常 常是线粒体DNA缺失的结果。邻接的基因 常常同时缺失,所以通过许多菌株的抗性 基因或其他基因的共缺失的分析,可以测 定各个基因的相对位置。

分子杂交和限制性核酸内切酶物理图谱分 析 结合基因定位和通过分子杂交和限制 图谱等研究,可以初步画出啤酒酵母的线 粒体的遗传学图。

6、叶绿体 最早发现的染色体外遗传是高 等植物的叶绿体的遗传。目前叶绿体的遗 传学分析仍以莱因哈德衣藻(Chlam domonas reinhardi)最为详尽,它的研究 从1954年美国学者R.塞杰取得呈现不分离 现象的抗链霉素突变型Sr-500开始。

叶绿体的遗传学分析主要通过基因重 组分析和纯合化分析。纯合化分析的原理 和利用体细胞重组进行基因定位的原理相 同,不过在体细胞重组分析中,基因离着 丝粒愈远则纯合化频率愈高,而在这里则 假定环状的叶绿体 DNA以某一特定部位附 着在叶绿体的膜上,任何基因离这一部位 愈远则纯合化频率愈高或进程愈快。通过 这些研究并结合分子杂交等方法的运用, 绘出了环状叶绿体基因的遗传学图。

? 衣藻的抗链霉素遗传 ? 莱因衣藻(Chlamyolomonas reinhardi) 是单细胞藻类,营养细胞只有一个单倍性的 核(现已知16个连锁群,交配型由其中一对 核基因决定一个叶绿体和大约20多个线粒体) ? 生活史:在有性期mt+mt -;两种不同交配型 (外型一致)融合,形成合子,再减数分裂 形成新的个体(核基因2;2分离) ? 1954年R, Sager得到两种突变体,野生型是 链霉素敏感

? Smr-100(抗100ng/ml链霉素)核基因突变 引起 ? Smr-500(抗500ng/ml链霉素)核外遗传特 点

mt+ Smr-500× mt- Sms(野生) mt- Smr-500× mt+ Sms(野生)

F1
全为Smr-500

F1 全为Sms

F2 仍不分离 F2 仍不分离 说明抗性是由mt+亲本传递,也表现母性遗传。通常 母性遗传是由于精细胞不带胞质,即合子的胞质几乎全 部来源于母本而造成的,但衣藻是通过融合,即合子具 有双亲的等量胞质。 假说:合子中存在一种酶能破坏来自于mt-亲本所提供 的胞质因子,后来证明这种酶类似于限制性内切酶,来 自于mt+细胞 。

大量正反交时发现,后代中有0.07%的异质体 (heteroplasmon),即含有双亲的核外基因,它们减数 分裂时,核外基因没有分离,但却在随后的有丝分裂中 发生分离,如果亲本带有两个核外基因标记时,还有重 组子细胞出现,证明染色体外基因也可发生分离、重组。 mt+ 配子(UV或其他处理) × mt- 配子

异质体频率大大提 F1 高甚至达到100%

推测:UV的作用或许就是使mt+ 细胞中的限制性内切酶
不能合成,也可能是对限制性酶的mRNA具有破坏性。

五、染色体外遗传因子和染色体 基因的相互作用
? 关于它们的相互作用关系的研究主要依 靠下列几种方法:
? ①遗传方式的分析。玉米的白色条纹叶性 状的出现是基因突变的结果,可是它的遗 传却是非孟德尔式的。酵母菌的小菌落突 变型有分离性的(即染色体的)和营养性的 (即染色体外的)两类。草履虫的卡巴颗粒 的遗传方式属于染色体外遗传,可是核基因 K的存在对于保持染色体外的卡巴颗粒却 是必要的。这些都说明保持这些遗传性状 都需要核基因和细胞质基因的相互作用。

玉米的埃型突变(iojap mutant)(叶片 上出现绿白相间的条纹花斑) ? 1924年,M.T.Jenkins 指出iojap(ij) 是一个染色体隐性基因突变,属于第7 连锁群

②分子杂交。一个RNA分子只能和转录 它的这部分DNA进行分子杂交。因此通 过DNA-RNA分子杂交,可以测定编码某 一细胞器成分的基因是在这一细胞器的 DNA分子上还是在染色体上。例如,分子 杂交结果说明梨形四膜虫(Tetrah menap riformis)的一部分线粒体 tRNA由染色体 基因所编码


③蛋白质合成分析。例如已经知道啤酒酵母 的细胞色素C氧化酶是在线粒体的内膜上,由 三个大亚基和四个小亚基构成。离体的酵母 菌的线粒体能合成三个大亚基而不能合成四 个小亚基,说明前者由线粒体基因编码而后 者并不由它编码。此外,已经知道抑制剂亚 胺环己酮抑制细胞质中的蛋白质合成而红霉 素则抑制线粒体中的蛋白质合成。在红霉素 存在的情况下酵母菌的细胞色素氧化酶三个 大亚基的合成被抑制,而亚胺环己酮则不。 上述事实都说明同一线粒体的一个部分为线 粒体基因编码,而另一部分则为染色体基因 编码。

现在已经知道线粒体中由染色体基因 和线粒体基因共同参与合成的成分至少有 tRNA、腺苷三磷酸酶、细胞色素氧化酶、 细胞色素b;叶绿体中染色体基因和叶绿体 基因共同参与合成的至少有核糖体蛋白质、 tRNA、叶绿体的外膜以及片层结构和光 合作用酶系Ⅰ、Ⅱ。对烟草叶绿体中核酮 糖磷酸羧化酶合成的控制也曾进行比较深 入的研究。

染色体基因和染色体外基因的相互 作用还涉及细胞器的装配问题,在衣藻 中发现了不少于20个影响线粒体核糖体 装配的基因,而且其中的 7或 8个是在染 色体上。它们中的一部分突变型不能装 配核糖体大亚基,一部分不能装配小亚 基,另外一部分不能装配大小两种亚基。 叶绿体的形成同样是一个极为复杂的过 程,在大麦中曾发现86个染色体基因和 叶绿体的形成有关。

细胞器的形成还受环境的影响,在缺 氧条件下生长的酵母菌形成原线粒体。同 样,在无光条件下植物只形成原叶绿体, 在有光条件下原叶绿体又转变成为叶绿体。 细胞器的装配机制和它们的双重控制机制 都有待于深入的研究。

六、演化
? 早在1890年德国组织学家R.阿尔特曼便认 为线粒体来自共生的细菌,1905~1910年K.C. 梅列日科夫斯基同样认为叶绿体来自共生的生 物。在细胞器遗传的研究取得迅速发展以后, 1970年L.马古利斯提出了更为完整的共生假设, 认为在原始的缺氧环境中首先出现了厌氧的原 核生物。随着营光合作用生物的出现,地球上 出现了好氧的原核生物和原真核生物,这些原 真核生物不具备呼吸酶系。以后好氧原核生物 在原真核生物中进行共生,共生体逐渐发展成 为好氧的真核生物;营光合作用的原核生物在 真核生物中进行共生,共生体逐渐发展成为营 光合作用的真核生物。

1972~1975年R.A.拉夫和H.J.马勒提 出非共生进化学说,认为原始的真核生物 具备呼吸酶系,而且这些酶系和细菌一样 是在细胞膜上。当细胞变大时,膜向里面 折叠,并且终于脱离细胞,这些膜把细胞 中的带有某些染色体基因的质粒包裹起来 而成为线粒体。另外一些假设并不假定先 有共生生物或质粒的存在。例如L.赖恩德 斯在1975年提出假说,认为线粒体中的DNA 来源于原核细胞本身,被它本身的膜所包 被起来,然后通过演变而成为线粒体DNA。

虽然每一种假设的提出都根据了一些事 实,但是同样也都面临着一些难以解释 的现象。细胞器遗传本身就是个复杂的 过程,它们的演化问题也只能留待今后 再作结论。 细胞质遗传研究的最重要的实践应 用是雄性不育。

第二部分 叶绿体与线粒体
一、叶绿体育叶绿体基因组 (一)结构 一个细胞中的叶绿体数目因 植物种类或细胞种类的不同有很大差异, 在单细胞藻类中一般只有一个叶绿体, 高等植物的细胞中可能有十多个,几十 个或上百个不等,高等植物的叶绿体一 般呈扁椭圆形,直径月5-10微米,厚约 2-3微米。

叶绿体外周由两层厚度和结构性质不同的单位膜包围, 在膜内充满流动状态的基质,基质中有许多片层结构, 每个片层结构由周围闭合的两层膜组成,呈扁囊型, 成为类囊体,大的贯穿在两个或两个以上的基粒之间, 小的互相堆积在一起形成基粒。

(二)基因组
在叶绿体基质中有4-8个DNA区,每个DNA 区通常由10-100个叶绿体DNA分子组成,有人根 据超速离心处理时密度均一,电镜下观察长度相 同的事实,认为同一区内的各个DNA分子可能 是同一分子的复制品,因此认为叶绿体DNA是 多倍性的,其基因组是一个裸露(无组蛋白)的 环状双螺旋分子,大小一般在120-217kb之间, 一个叶绿体中可能含一至几十个这样的DNA分 子,叶绿体基因组的碱基序列中不含5’-甲基胞 嘧啶,这一特点可以作为鉴定叶绿体DNA提纯 程度的指标。

叶绿体基因组含有它自己的转录翻译系统, (真核80s(40s;60s))它的核糖体属于70s型,组 成50s和30s小亚基的23s、4.5s、5s和16srDNA基 因均由叶绿体DNA编码,核糖体蛋白质基因组 中约1/3也是叶绿体DNA编码,另外,也绿体基 因组中还含有30多个tRNA基因的编码序列。

(三)叶绿体DNA的物理图谱及定位
眼虫、衣藻、地钱、玉米、菠菜、豌豆、 水稻等的叶绿体DNA绘制了物理图谱,并定位 了部分基因,烟草和地钱的叶绿体DNA进行了 整个核苷酸序列的分析,将之比较发现,他们 含有几乎完全相同的叶绿体基因组。

(四)叶绿体的复制
叶绿体由原质体发育而成,但依靠自身的 分裂来增加数目,成熟的叶绿体从叶肉细胞中 分离出来放在人工培养及上培养,可以看到分 裂,一般是类似于无丝分裂的缢裂。

叶绿体的分裂与细胞分裂并不同步,叶绿 体DNA的复制也是半保留式的,在细胞周期的 G1阶段进行,在高等植物中也同样,在幼叶基 部的分裂细胞中,先是叶绿体DNA复制,然后 核DNA复制,继而细胞分裂。在细胞分裂停止 的细胞生长部位,核DNA停止复制,但叶绿体 DNA的合成却旺盛进行。在细胞分裂的初期, 叶绿体仍可继续分裂,最后达到叶绿体DNA和 核DNA的比值大体一定的程度。在细胞分裂过 程中,叶绿体分配完全是随机的,即每个子细 胞得到的叶绿体数目不完全相等。

? 二、植物线粒体和线粒体基因组 ? (一)线粒体的结构 ? 线粒体也是双层膜组成的,外膜在外, 内膜则在不同部位向内腔折叠型成嵴, 在内膜周围充满了基质,主要成分是蛋 白质和脂类,蛋白质中,一半是结构蛋 白,另一类是多种酶类,存在于基质或 膜上。

线
?形态结构 ?功能 ?半自主性





——能量转换器

线粒体的形态结构
嵴 基质 膜间隙

外膜

内膜

线粒体的主要功能
线粒体是细胞进行氧化呼吸, 产生能量的地方,在线粒体中进行 的代谢途径主要有

? 三羧酸循环
? 氧化磷酸化

? 参与脂肪酸代谢

(二)线粒体基因组
线粒体的DNA通常与内膜结合存在,只有在线 粒体分裂前DNA复制时,才出现在基质中,分裂后 的线粒体DNA又与内膜结合,故一般不易看到。

线粒体基因是裸露的DNA双链分子,主要呈环状,但 也有线性分子。各种物种的线粒体基因组大小不一,一般动 物为14-39kb,真菌类17-176kb,都是环状,四膜虫属和草履虫 等原生动物为50kb,是线性分子。植物的线粒体基因组比动 物的大15-150倍,也复杂的多,大小可以从200kb-2500kb。 植物的线粒体DNA是由大小不同的环状、线状分子组成的, 是杂集合体。通常环状的少(例如玉米、大豆中,仅有5%) 环状分子中也不均一,玉米中有7大类大小不同的环状分子, 小到1.8kb,大至68kb,含量也各不相同,初步肯定mtDNA 是一个主基因组和和通过重组,由它衍生的一系列大小不同 的分子组成( mtDNA 中无重复核苷酸序列)

真核生物每个细胞内含众多的线粒体,每个线 粒体又可能具有多个线粒体DNA分子。通常, 线粒体愈大,所含的DNA分子愈多。在线粒体 DNA的组成方面,绝大多数的mtDNA中没有重 复核苷酸序列,这是mtDNA一级结构的重要特 点。其基因组中,除与呼吸相关的蛋白、酶 外,还有线粒体自身蛋白合成系统中的3个 rRNA(5s, 18s, 26s)基因和一些tRNA基因,并 且其中还有ORF(open read frame); URF(unknown read frame),并有大量的非编 码序列。

植物线粒体DNA不仅特别大(动物14-39kb, 植物200-2500kb), 而且还表现出诸多复杂性,混 杂DNA就是植物线粒体基因组的复杂现象之一, 所谓复杂DNA是指来源于其他基因而在本基因 组稳定遗传的混杂片段,植物mt基因组中含有 源出于叶绿体基因组的混杂DNA, eg., 玉米 mtDNA中含有带16srRNA和两个tRNA以及 RUBP羧化酶大亚基单位的基因组片段,有的 mtDNA中也有源于和基因组的片段,从目前情 况看,在进化过程中,线粒体和叶绿体以及细胞 核之间的遗传信息交流是很频繁的,只是叶绿体 基因组受到交严格的约束,混杂DNA的量也就 很少。

植物线粒体基因组大而复杂,它有大量的人们尚 不清楚的序列,看来式保留了较多进化过程的信 息,因而近年来日益激起人们的兴趣。

(三)线粒体的复制
mt DNA的复制有三种,θ型(E.coli一致), D环(半保留复制),滚环方式复制。 mt DNA无 论在分裂或静止的体细胞中, mt DNA的合成常常 是活跃进行的,但这种复制并不均一, mt DNA与 核DNA的复制的调节是彼此独立的,然而线粒体 DNA的复制仍受核基因的控制,其父之所需的聚 合酶是由核DNA编码的,在胞质中合成的,线粒 体的分裂方式多种多样(缢裂、出芽等等,但其 如何分裂,机制均不清楚)

第三部分 植物细胞质雄性不育 的遗传
一、植物雄性不育遗传的方式 (一)核不育 eg. 湖北光敏核不育水稻;山西的太谷核不育 小麦。 多数由隐性基因(ms)控制,ms/ms表 现为雄性不育,其不育性被相对的显性基因 Ms所恢复,杂和体Ms/ms后代呈简单的 Mondel式分离,因此,普通的遗传学方法不 能使核不育型的整个后代群体保持不育性, 这是核不育型的一个重要特征,也正是由于 这一点,核不育类型的利用受到很大的限制。

(二)质-核不育
核质互作雄性不育类型是细胞质基因与细 胞核基因共同作用的结果。核质互补控制假说。 这个假说认为,细胞质不育基因在线粒体上。 在正常情况下(N)线粒体DNA携带着能育基 因的遗传信息,能正常转录mRNA,因而在线 粒体的核糖体上能合成各种蛋白质(酶),以 保证雄蕊发育的正常进行,最终形成功能正常 的花粉。当线粒体DNA的某个(或某些)阶段 发生了突变,质基因就进入了S状态,通过转录 形成不正常的mRNA,不正常的mRNA携带着 不育性的信息,这样mRNA不能形成某些酶, 最终破坏花粉的正常代谢过程,导致花粉败育。

需要注意的是,当质基因处于S状态后, 花粉是否能育,还要取决于核基因的组成。当 核基因为R时,可通过mRNA的转录,把可育 的遗传信息转移到细胞质的核糖体上,进而翻 译成促使花粉正常发育的各种蛋白质(酶), 从而形成了可育的花粉。由于核基因能补偿细 胞质不育基因S的不足,所以当R存在时,线 粒体DNA不论正常与否,都可以形成正常的可 育花粉。当核基因为r时,由于它不能补偿细 胞质不育基因S的不足,从而形成不育花粉。

另一方面,当细胞质基因N存在时,由于它 能补偿核基因r的不足,不论核基因是R还是r, 只要有N细胞质基因存在,就能形成正常可育花 粉。如果细胞质基因N和核基因R同时存在,由 于N一方面可控制可育性,同时还有调节作用, 通过调节作用能产生某种抑制物质,使R处于阻 遏状态。因此不会形成促进花粉正常发育的多 余物质而造成浪费。细胞质基因S不能产生抑制 物质,所育S与R同时存在时,R能正常执行机 能形成可育的花粉。

高等植物质体基因工程研究

? ? ? ?

1.质体基因转化的优越性 2 叶绿体遗传转化的特点 3 外源基因导入质体的方法 4 外源基因与质体基因组的整合及其表 达 ? 5 质体基因转化的筛选标记 ? 6 已导入叶绿体并且表达的外源基因 ? 7 问题及展望

? 引言 ? 在高等植物的细胞中,细胞核、质体和线粒体都 含有DNA ,它们构成了既相对独立又相互联系 的三个遗传系统。自70 年代初基因工程技术诞 生以来, 核基因转化一直是植物基因工程的主 要研究方向。然而,随着研究的深入进展,人们 逐渐认识到核基因转化有其难以克服的弊端,例 如:细胞核基因组大,背景复杂; 导入的外源基因 难以控制;外源基因表达效率低,后代不稳定;对 于来自原核的基因必须加以修饰改造等等,这些 问题严重影响着核基因转化技术的实际应用。

? 为了克服核基因转化存在的某些不足,1988 年 Boynton 等人独辟蹊径, 以莱茵衣藻( chlamy domonas reinbardii ) 为材料用基因枪进行外源 基因对叶绿体的转化,使突变体成功转化为能进 行光合作用的正常莱茵衣藻,首次证实了叶绿体 转化的可行性。后来, Svab 等人将此技术应用 于烟草获得了稳定的质体转化体,由此带来了高 等植物质体基因转化的研究高潮。质体基因转 化在一定程度上克服了核基因转化的不足,具有 独特的优越性,例如:将未经改造的苏云金杀虫 蛋白基因(Bt基因) 转化烟草叶绿体,其表达量比 核基因转化提高了50 倍以上。近几年来,质体 基因转化技术发展迅速,已开始成为植物基因工 程中新的热点。

1. 质体基因转化的优越性 ? 质体基因转化技术之所以显示出它旺盛 的生命力,是因为与核基因转化相比,它有 以下优点:

? ①高效表达 由于质体基因组的拷贝数非常大, 整合在其中的外源基因也会以高拷贝数存在,这 就必然为外源基因的高效表达提供了条件。例 如Mcbride等人将Bt 毒素基因转入烟草叶绿 体,Bt 毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3~ 5 % ,而通常的核转化技术只能达到0.001~0.6 %。 ? ②原核基因无需修饰改造 由于质体大多数基 因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似, 因此,对于来自原核生物的有重要价值的外源基 因,无需改造和修饰就可在质体内高效表达,这 是核基因转化无法做到的。

? ③安全性好 外源基因整合进质体基因 组后,只能进行母系遗传,不像核基因那样 可以随花粉而扩散,从而保证了基因工程 的安全性。 ? ④便于遗传操作 质体基因组小,结构简 单,烟草、水稻、欧龙牙草等几种高等植 物的质体基因组全序列已被测定,其它植 物也有许多质体基因被定位和测序,遗传 背景较清楚,便于遗传操作。

? ⑤可以实现定点整合 外源基因可通过 同源重组定点整合进质体基因组,这方面 已有许多成功的报道,定点整合有利于控 制外源基因的表达,维持植物基因的正常 功能,对植物的生长发育也不会造成任何 不利影响,这一点目前在核基因转化中还 很难做到。 ? ⑥易保持纯系、后代不分离 一旦得到 纯合而稳定的质体转化体,由于外源基因 的母系遗传特性,这种纯系的种子后代将 永远保持为纯系,不会因为有性杂交而发 生分离。

2 叶绿体遗传转化的特点 ? 叶绿体作为遗传转化受体具有如下独特 性。

? ①目的基因转化效率高且后代表达稳定 植物 细胞中含有多个叶绿体,每个叶绿体中又含有多 个基因组拷贝。以显花植物为例,其每个叶肉细 胞中约有100 个叶绿体,每个叶绿体中又含有 100 多个质体基因组拷贝。如果将外源基因导 入叶绿体基因组中,并达到同质化,该基因在植 物细胞中的拷贝数将增加到约10000 个,增加基 因拷贝数并结合使用叶绿体特异性表达的强启 动子,可大大提高转基因的表达量。由于叶绿体 对表达产物的积累具有较强的承受力,因而为外 源基因在叶绿体中的大量表达提供了保障。同 时, 由于叶绿体具有母系遗传性,整合的目的基 因不遵循孟德尔规律在后代中表现性状分离,故 转基因可在子代中稳定地遗传和表达。

? ②基因表达原核性 叶绿体基因组的遗 传表达具有原核性。其基因组基因的排 列方式、调控方式、GC 碱基对含量及翻 译所偏爱的密码子与原核生物相接近,这 有利于直接表达来自原核生物的基因,无 需进行繁琐的优化密码子改造。Mcbride 将苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白(Bt) 基因 导入烟草叶绿体,得到的毒蛋白占可溶性 蛋白的5 % ,杀虫性在90 %以上,表达量比 将改造后的Bt 基因转入植物核基因组中 的最高表达量提高了50 倍。

? ③利于同时进行多基因转化 多个外源 基因可以以多顺反子的形式同时在叶绿 体中转录和表达。在叶绿体基因组中,许 多功能相近的基因聚合在一起,共用同一 个启动子,组成操纵子,这种结构为在同一 启动子的调控之下同时表达多个外源基 因提供了可行性。此外,由于多个基因可 以在同一个启动子调控下完成转录和表 达, 因此可以避免因多个相同的启动子调 控多个基因在表达时产生基因沉默现象。

? ④便于定位整合 由于一些植物的叶绿 体基因组遗传背景较清楚,因此在转化叶 绿体时通过在载体上设计相应的同源片 段,可将外源基因定位整合到叶绿体基因 组中,从而减少由于外源基因整合位点的 不确定性以及由此而产生的位置效应对 表达造成的不利影响,并简化外源基因转 化后的筛选工作。

? ⑤环境安全性高 绝大多数植物的叶绿体遗传 为母系遗传(松树为例外, 其叶绿体的遗传为母 系和父系双亲遗传) ,不通过花粉传递,因此不会 发生转基因花粉传递而可能造成的环境安全性 问题。叶绿体外部包被有双层膜,将叶绿体与基 质分开,形成相对独立的小环境。目的基因的表 达具有叶片组织特异性, 不会在转基因植物果 实中大量积累,以子实为产品的转基因植物的食 用安全性增强。 ? 此外, 叶绿体基因组具有分子量小、结构简单、 不结合组蛋白等特点,有利于实现分子操作。

3 外源基因导入质体的方法 ? 外源DNA 穿过质体的双层膜比穿过有孔 的核膜要困难得多,因此,质体基因转化面 临的一个关键问题,就是如何使DNA 进入 细胞质后进一步穿过质体的双层膜。根 据已有的报道,DNA 导入质体的方法有以 下几种:

? ①花粉管导入法 刘博林等曾报道,将含 有龙葵抗阿特拉津的pabA 基因的pBR322 DNA ,经花粉管通道注入大豆子房,检测 到子代植株水平的阿特拉津抗性,并在分 子水平上检测到pBR322 DNA 存在于叶 绿体中,但未证明外源DNA 是否已整合进 叶绿体基因组。

? ②农杆菌介导转化法 De Block 等人曾 将构建在Ti 质粒上的CAT 基因转化烟草, 获得了稳定的氯霉素抗性植株,并证明抗 性符合母系遗传规律, CAT 基因已整合进 叶绿体基因组。Venkates warilu 等利用 T2DNA 双元载体,在NPT Ⅱ嵌合基因两 端加上叶绿体5s rDNA ,叶盘法转化烟草, 结果表明5s rDNA 和NPT Ⅱ基因都已定 点整合到叶绿体基因组上,并得到卡那霉 素抗性植株。由于农杆菌法转化成功的 例证较少,该方法是否真正适用于叶绿体 转化,有待于进一步研究。

? ③PEG 介导转化法 Sporlein 等利用PEG 介导的方法转化烟草原生质体,证明由菠 菜叶绿体启动的GUS 和NPT Ⅱ基因能进 入叶绿体并得到瞬时表达。随后,又有 O’neil 等人和Golds 等人分别利用该方法 获得了稳定的叶绿体转化体。该方法虽 然有效,但由于原生质体的制备和再生比 较困难,从而限制了这一方法的普遍应用。

? ④激光微束转化法 Weber 等人曾用波 长为343nm 的激光照射处于DNA 溶液中 的油菜离体叶绿体,观察到叶绿体膜上出 现了持续时间为1.2秒的小洞,并证明外源 DNA 已进入叶绿体中。该方法虽然可应 用于离体叶绿体转化,但能否用激光微束 直接照射植物的细胞、组织或器官以获 得稳定的叶绿体转化植株,目前还未见报 道。

? ⑤基因枪法 由于高速基因枪在莱茵衣 藻的叶绿体转化中获得成功,人们很快将 这一技术应用于高等植物的叶绿体转化。 1990 年,¨yhDaniell 等首先用基因枪转化 培养的烟草细胞,获得了CAT 活性在叶绿 体内的瞬时表达。同一年,Svab 等第一次 用基因枪实现了高等植物质体的稳定转 化,他们直接用烟草叶片作为轰击受体,突 变型16s rDNA作为抗壮观霉素的筛选标 记,获得了稳定的叶绿体转化体,由此在高 等植物建立起了方便而实用的叶绿体转 化模式。

? 近几年来,关于高等植物的叶绿体转化工 作大多由美国新泽西州立大学的Maliga 实验室完成。由于基因枪法转化频率高, 重复性好,Maliga 及其它的实验室几乎无 一例外地使用了基因枪转化法。从目前 来看,基因枪打靶是质体基因工程中最常 用和最有效的DNA 导入技术。至于转化 材料,目前还仅仅局限于模式植物---烟草, 用基因枪转化其它植物叶绿体并获得稳 定转化体的工作还未见报道。

4 外源基因与质体基因组的整合及其表达

? 外源基因进入质体以后,面临的第二个问题就是 与质体基因组的整合及有效表达。为了实现外 源DNA 的整合,构建质体转化载体时,一般都在 外源DNA 两侧各连接一段质体的序列,称为定 位片段(targeting fragment )。当转化载体被导入 质体后,通过定位片段与质体基因组的同源片段 之间发生两次同源重组,就可将外源基因定位到 基因组的特定位点,从而实现定点整合。如果同 源片段位于基因组的反向重复序列区内,整合到 其中一个拷贝上的外源基因会通过拷贝矫正作 用(copy correction) 使两个重复序列保持一致。

? 作为定位片段, 一般要求具备下面三个条件: (1) 足够的长度,以保证外源DNA 的有效整合。根 据文献报道,定位片段的长度在1~2kb 比较合 适,过短会降低重组频率,而过长虽能增加转化 频率,但操作不便。(2) 合适的插入整合位点。 要求同源重组发生以后,外源基因的插入既不引 起质体基因组原有序列丢失,又不致于干扰邻近 基因的正常功能。为满足这一要求,已有的工作 都选用了相互毗邻的两个片段作为定位片段,例 如rbcL/ ORF512 , 16st rnV/ rps7rps12以及rbcL/ accD等,两个片段之间一般为非功能区,正是外 源基因合适的插入位点。(3) 具有合适的限制 性酶切位点。要求片段两端的酶切位点是单一 的,以防止在克隆时该片段被切成几段。

? 为了使外源基因整合进质体基因组后能 够高效表达,构建转化载体时,一般选用质 体来源的强启动子和终止子。最常用的 启动子是光系统Ⅱ作用蛋白基因psbA 的 启动子和核糖体RNA 基因rrn的启动子, 常用的终止子是psbA 终止子。由于应用 了质体来源的启动子和终止子,从而保证 了外源基因在质体中的正常表达。

5 质体基因转化的筛选标记 ? 质体基因组以高拷贝数存在(叶细胞中 可高达10,000个拷贝), 同时转化这么 多基因组是不可能的,极易出现转化的与 未转化的质体组成的异质体,无法保证获 得的性状稳定遗传下去。因此,质体基因 转化所面临的第三个关键问题就是去除 未转化的基因组和未转化质体。这个问 题的解决是通过向质体中转入筛选标记 基因、进行抗菌素抗性筛选、淘汰掉未 转化的质体来实现的。在实际工作中所 用到的筛选标记基因主要有下列三种:

? ①突变型16s rRNA 基因 这是在质体基 因转化中最早用到的筛选标记,它们来自 烟草的突变细胞系。由于突变型16s rRNA 基因的导入,使得转化细胞能抗壮 观霉素、链霉素或林可霉素对叶绿体蛋 白质合成的抑制。所以在早期的质体转 化工作中都应用了此种筛选标记,但转化 频率较低。

? ②NPT Ⅱ基因 来自于细菌的NPT Ⅱ基 因编码新霉素磷酸转移酶,能赋予细胞抗 卡那霉素的能力,这是核基因转化中常用 的一种筛选标记。1993年,Carrer 等人将 NPT Ⅱ基因构建进质体转化载体,首次用 作质体转化的筛选标记。实验发现在 50μg/ ml 卡那霉素的选择压力下,能同时 筛选得到质体转化体和细胞核转化体。 但在500μg/ ml 压力下,由于细胞核转化体 不抗如此高的浓度而被淘汰掉。结果表 明,在较高选择压力下,NPT Ⅱ基因也可以 作为质体转化的筛选标记。

? ③aadA 基因 aadA 基因来自于原核生物, 编码氨基糖苷-3-腺苷酸转移酶,能产生 壮观霉素和链霉素抗性。已有的工作表 明,用aadA 作筛选标记,平均每个被轰击 的叶片就可获得1 个稳定的质体转化植株, 它比用16s rRNA 基因的转化频率高大约 100 倍,比NPT Ⅱ基因的转化频率高20 — 30 倍。因此, addA 基因是目前质体基 因转化中最常用、最好的筛选标记。

? 无论用哪种标记进行筛选,为了得到稳定 的质体转化体,Maliga 认为,在选择压力下 至少要使细胞分裂16 —17 次,以便在此过 程中不断淘汰未转化的质体及未转化的 细胞, 最后得到同质的转化细胞。Svab 等 人和Carrer 等人在烟草质体转化工作中一 般采用两轮再生方案,即烟草叶片轰击→ 选择压下再生→切下再生苗的叶片→选 择压下再生。这样得到的绿苗大部分为 稳定的质体转化体。

6 已导入叶绿体并且表达的外源基因 ? 目前,已在烟草、拟南芥、马铃薯、番茄 和油菜5种双子叶植物中实现了叶绿体转 化,至于单子叶植物,仅在水稻中有相 关报道,但没有获得稳定纯合的转化体。 到目前为止,已有7-8种筛选或报告基因、 20种左右的目的基因被引入叶绿体基因 组并实现了表达。

? ①筛选或报告基因 在叶绿体转化技术出现的 早期阶段,人们主要将筛选标记基因(如:cat、 aadA、nptII)或者报告基因(如:uidA、gfp) 导入叶绿体,从而证明了外源基因对叶绿体转 化的可行性,这些工作为叶绿体转化技术的发 展和完善作出了贡献。 ? ②抗虫基因 在叶绿体转化研究中,以转移抗虫 基因的报道最多。这是由于毒素会集中在绿色 叶子中表达,对杀死食叶害虫非常有利。到目 前为止,来自苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因 cry1Ac、cry2Aa2、cry1Aa10等均已转入叶绿体 基因组,并且获得了很强的抗虫能力。

? ③抗除草剂基因 Daniell 等(1998)和 Ye等(2001)分别将抗除草剂(草甘瞵) 的5 - 烯醇式丙酮酸莽草酸- 3 - 磷酸合酶 基因( EPS PS) 构建在烟草叶绿体表达载 体中并转入叶绿体基因组,转基因烟草对 除草剂表现出很强的抗性。最近, Iamtham等(2000)和Lutz等(2001)又 将bar基因转入烟草叶绿体,转基因烟草 对阿特拉津类的除草剂表现出高抗。

? ④药用蛋白(多肽) 基因 由于叶绿体可超 量表达外源蛋白,植物的叶绿体有可能成 为工业用酶或药用蛋白等产品的“生物 反应器”。例如,具有多种医用价值的多 肽药物“GVGVP”目前已在烟草叶绿体 中得到了超常量表达,其表达量为细胞核 表达的100 倍。最近,Staub 等将人的生长 素基因转入烟草叶绿体,发现该基因在叶 绿体的表达量高达可溶性蛋白的7 % ,比 细胞核转化高300 倍。这些研究结果对人 们利用叶绿体生产蛋白质药物的努力是 极大鼓舞。

? ⑤光合调控基因 叶绿体的主要功能是光 合作用,通过叶绿体转化,改变或替换与光 合作用调控有关的基因,可望增强作物的 光合效率,提高产量。最近, Kanevski 等在 这方面做了一些探索性的工作,他们将向 日葵的rbcL 基因转入烟草叶绿体,以取代 烟草自身的rbcL ,发现在转基因烟草中由 向日葵的Rubisco 大亚基和烟草的Rubisco 小亚基构成了完整而有活性的酶,这项工 作为优化Rubisco 酶的结构,提高光合性能 奠定了基础。

? 7 问题及展望 ? 从1990年高等植物中第一个稳定的叶绿 体转化体(烟草)获得至今,叶绿体遗 传转化展示了非常诱人的应用前景。但 与细胞核转化相比,叶绿体转化的发展 速度是比较慢的,主要表现在转化的植 物种类少,参与的人数少,报告的数量 少。之所以出现这样的局面,主要是由 于该技术目前存在着以下几个关键的限 制因素。

? ①再生体系的限制 在叶绿体转化中, 叶组织的反复再生和筛选是获得纯合转 化体的关键。而有些植物,特别是具有 重要经济价值的禾谷类作物,只能从非 叶绿体的胚性细胞而不是叶细胞获得再 生植株。非绿色胚性细胞中只含有体积 很小的前质体(Proplastids),很难被基 因枪击中。另外,在这些前质体中基因 组拷贝数较少,蛋白质合成效率低,造 成筛选标记基因表达水平低,不易获得 抗性转化体。这是目前禾谷类难以获得 叶绿体转化体的重要原因之一。

? ②基因组信息的限制 目前大多数植物的 叶绿体基因组序列还不清楚,因此难以 确定转基因在基因组上的整合位点,也 难以克隆同源重组片段用于载体构建。 目前提出的“通用载体”以及“异源载 体”的概念,可能有助于这一问题的解 决。另外参考其它植物的已测序的基因 组序列,从目标植物中克隆同源序列作 为定位片段,可能是解决这一问题的另 一个有用方法。

? ③转基因方法的限制 由于叶绿体体积较 小、双层膜、膜上无孔,将外源基因导 入叶绿体比导入细胞核要困难的多。目 前将外源基因导入叶绿体最成功的方法 是基因枪法,但该方法需要昂贵的仪器, 实验成本高,限制了它的普遍应用。因 此急需开发方便低廉的新型叶绿体转基 因方法。

? ④获得纯合体的难度大 依据植物组织的 类型不同,每个植物细胞大约含有10- 100个质体,每个质体含有10-100个质 体基因组。如此计算,每个植物细胞可 含有100-10000个质体基因组。要获得 同质化(纯合)的叶绿体转基因植株, 必须将植株的每一个细胞中如此众多的 基因组都整合上外源基因,其难度是非 常大的。这也是限制叶绿体遗传转化快 速发展的重要原因。

? 尽管叶绿体遗传转化技术存在以上种种 限制,但由于该技术的独特优越性,它 必将引起更多学者的关注和浓厚的研究 兴趣。一旦以上问题得到解决和克服, 叶绿体转化技术将跨入快速发展的新航 程。最近,叶绿体转基因在抗除草剂、 抗虫、抗病、抗干旱以及在生物制药方 面所取得的一系列成就,表明了生物技 术的新时代即将到来。

草履虫卡巴粒的核外遗传

1.草履虫的形态特征
? 草履虫(Paramoecium)是一种常见 的原生动物,几乎在各处的淡水中都 能找到。因外形(平面观)与草鞋相 似而得名。 草履虫的分类如下:

?

原生动物门(Protozoa)
纤毛亚门(Ciliophora)

寡膜纲(Oligohymenophorea) 膜口亚纲(Hymenostomatia) 膜口目(Hymenostomatida) 咽膜亚目(Peniculina)
草履虫属(Paramecium)

草履虫呈圆筒形,长为宽的数倍,前端 较圆,后端稍宽,然后变尖。
以纤毛为运动器官在水迅速游动,通常 以较钝的一段向前移动,因此把这一端叫前 端。 从身体的前端开始向后并稍向侧伸延有 一个凹陷的沟称为口沟,有口沟的一侧为草 履虫的口面或腹面,口沟的长度超过身体长 度的一半,其后端为一漏斗形的通道导入细 胞内部,这一通道叫做胞咽,其起点叫做胞 口。

草履虫的主要食物是细菌,也吃一些 其他的小的有机体和腐败的有机物小颗粒。 这些食物微粒在胞咽的末端形成食物 泡并被流动的内质携带着在胞内转运,同 时其中所含的食物就被草履虫所分泌的酶 所消化。 不能消化的食物残渣通过表膜上叫做 胞肛的开口排出。

2.草履虫的遗传生殖
? ? 草履虫含有大、小两种细胞核。 大核是多倍体是细胞营养生长时期 基因表达的实际位置,是对细胞生长必 需的RNA的转录的主要场所,它决定细 胞的表现型,并可能专管无性生殖期间 细胞全部的遗传活动。

?

小核是二倍体在细胞营养时期仅表 现出十分微弱的作用或无转录活性,它 是细胞有性生殖时期的功能核。 ? 遗传信息贮存在小核中,小核通过 有性生殖形成配子核,产生新的小核和 分化生成新的大核。 ? 有的草履虫含有两个小核称为双小 核草履虫。

草履虫的无性生殖
? ? 草履虫可由二裂法进行无性生殖。 在这一过程中,小核先从原位置移 开,然后小核与大核各自延长并分裂为 两个相等的部分,每种核的两部分分别 向细胞两端移动,然后细胞中部收缩, 最后缢断为两半,每部分发育为一个新 的个体。

二裂法无性生殖 示意图

草履虫的有性生殖
? 草履虫的有性生殖可分为结合生殖和自 体受精生殖两种

1结合生殖:以双小核草履虫为例

两个亲本中小核首先进行减数分裂各形成8个小核

其中7小核个消失,只留下一个

剩下的一个经一次有丝分裂形成两个小核

两个亲本结合,大核消失,互换一个小核

然后两个小核融合

融合后的小核进行两次有丝分裂形成4个小核

最后大核重新形成每个亲本分裂为两个个体

2自体受精生殖: 单独的一个草履虫也可以进行自体受精 生殖。

自体受精中的细胞变化与结合受精很相 似,仅是没有细胞间的配对和交换而已

自体受精生殖

示意图

3.草履虫放毒者及卡巴粒的 核外遗传
? 草履虫的放毒型由Sonneborn于1938 年发现。在某些双小核草履虫的细胞质 中存在一种颗粒叫做卡巴粒( kappa particles),含有卡巴粒的放毒型草履虫能 将一种类蛋白质R-body排出到周围环境 中,不含卡巴粒的敏感型草履虫在取食 到R-body后就会死亡,而放毒型草履虫 却对此有抗性。

显微镜下的卡巴粒

现已公认草履虫的放毒者性状的染色体外遗传的 物质基础卡巴粒是共生生物,主要依据有以下几点 : (1)在显微镜下可以看到放毒者草履虫细胞中有形状、大小 和细菌相类似的颗粒(卡巴粒),敏感者草履虫细胞中则没 有这些颗粒 (2)在电子显微镜下可以看到这些卡巴粒为二层膜所包围, 里面一层是典型的细胞膜结构,外面一层可能是细胞壁 (3)卡巴粒有呼吸作用,能利用葡萄糖并含有糖酵解, 五碳糖支路和三羧酸循环中的大部分酶 (4)卡巴粒都含有DNA、RNA、蛋白质和脂质类,而且 它们的含量和一般的细菌含量相似

(5)卡巴粒的DNA碱基比和草履虫的核DNA和线粒体DNA 碱基比不同 (6)卡巴粒含有核糖体RNA,这些核糖体RNA沉降系数和 细菌核糖体RNA沉淀系数相同而和草履虫细胞质中核糖体 RNA不同 (7)卡巴粒有突变的报道

卡巴粒已经被定名为一种细菌Caedobacter Toeniospiralis(Preer,1974)(意为“有螺旋形带子的放毒 菌”),每个细胞中的卡巴粒数目可从几个到几百个。
卡巴粒通常有1-5μm长,直径约0.2μm,有双层膜包围 着,属于革兰氏阴性和富尔根阳性,含有DNA和RNA,还 有各种酶,进行呼吸,但缺少在草履虫以外人工培养基上 生长的能力这一重要性质(其它共生物(lambda和mu)可以)。

对敏感型草履虫有毒性的R-body是由卡巴粒的质粒 DNA编码合成的。

卡巴粒的复制与草履虫核基因 的关系
? 卡巴粒复制依赖于核基因K,没有基 因K,卡巴粒将不能复制,放毒型草履虫 将会失去放毒特性 ? 可是除非卡巴粒通过结合引入,否 则一个具有基因K的敏感细胞不会自行产 生卡巴粒 ? 这也说明卡巴粒不是基因产物,它 必定来源于共生生物

所以草履虫放毒型的遗传基础有两 个: ●一个是细胞质中有卡巴粒 ●另一个是核内有显性基因K

两者必须同时存在,才保证放毒型的 稳定。
卡巴粒的作用是产生毒素 显性K基因的作用是使卡巴粒在细胞 质内继续存在。

自然情况下,草履虫通过结合得到卡 巴粒

在结合过程中,由于取食停止,所 以敏感型草履虫可以不被放毒型草履虫杀 死
纯和放毒型(KK+卡巴粒)与敏感型 (kk+无卡巴粒)的结合可能出现两种情况

一种是:当两种类型草履虫交配接合时 间短,两个亲本交换各自两个小核中的一个 小核。然后每个亲本的保留的小核与换来的 小核在各自体内相接合,于是交换后的两个 亲本基因型都是Kk。
但由于接合的时间较短,两个亲本没有 来得及交换细胞质及其所含的卡巴粒,原来 放毒型亲本仍保持放毒特性。原来敏感型的 亲本虽然已经改变为Kk基因型,却没有卡巴 粒,仍然为敏感型。

成为Kk杂合体的 放毒型,自体受精后 代中KK个体仍为放毒 型;kk个体由于从上 代得到部分卡巴粒, 经过多代无性繁殖后, 由于没有显性K基因, 并且由于卡巴粒逐渐 减少而成为敏感型

在已经成为Kk杂 合敏感型自体受精的 后代中,无论是KK个 体,还是kk个体,由 于体内不含卡巴粒, 不能产生毒素,仍然 保持敏感型的特征。 这是因为显性K基因 不能决定卡巴粒的形 成

另一种情况是:如果放毒型和敏感 型接合的时间较长,不仅发生了K和k的 互换,细胞质中所含的卡巴粒也进行了 相互交流,则不仅接合的亲本都能放毒, 它们的自体受精后代,不管是KK还是kk 基因型也都能放毒。在经过若干代无性 繁殖之后,KK个体仍保持放毒特性,kk 个体则变为敏感型。

综上所述:

卡巴粒是存在于草履虫中的内共生 细菌,能使草履虫获得放毒性状。
卡巴粒的复制需要核基因K的存在, 但存在核基因K不能使草履虫产生卡巴 粒。 草履虫的放毒性状必须有卡巴粒和 核基因K的同时存的情况下才能稳定遗 传


相关文章:
第八章 核外遗传
第八章 核外遗传 重点:掌握核基因和细胞质基因的遗传特点 ? 细胞质基因 ? 母性影响 ? 核外遗传的性质与特点 ? 细胞内敏感性物质的遗传 ? 线粒体的遗传方式...
核外遗传试卷1
酵母菌的小菌落是受___线粒体___所决定的;紫茉莉的花斑 遗传是受__叶绿体(质体)___所决定的;草履虫的放毒型是受__ 基因 (K) kappa 粒__所决定...
遗传简答
9、细胞质遗传:在核外遗传中,其中由细胞质成分如质体、线粒体引起的遗传 ...11、转座因子:指细胞中能改变自身位置的一段 DNA 序列。 12、基因工程:狭义...
遗传学 试题
2 细胞质遗传:在核外遗传中,其中由细胞质成分如质体、线粒体引起的遗传现象叫细胞 质遗传。 3 基因工程:狭义的遗传工程专指基因工程,更确切的讲是重组 DNA ...
普通遗传学第十一章 核外遗传 自出试题及答案详解第一套
普通遗传学第十一章 核外遗传 自出试题及答案详解第...细胞质基因组 10. 前定作用 11. 质粒 12.附加体...一级建造师《建设工程项目管理》 《建设工程经济》计...
遗传学期末考试重点
质体叶绿体,线粒体等细胞器,以及共生体和细菌粒等...的遗传物质又存在于细胞质中, 因此在习惯上把核外...(隐性)致死的运用 十五、基因工程中使用的载体 质粒...
遗传学期末重点
7、细胞质遗传:在核外遗传中,其中由细胞质成分如质体、线粒体引起的遗传现象...13、基因工程:狭义的遗传工程专指基因工程,更确切的讲是重组 DNA 技术,它是指...
普通遗传学第十一章 核外遗传 自出试题及答案详解第二套
普通遗传学第十一章 核外遗传 自出试题及答案详解第二套_农学_高等教育_教育专区...质基因也是按半保留方式进行自我复制,并能转录 mRNA,最后在核糖体合成 蛋白...
遗传学名词解释
细胞质遗传:在核外遗传中,其中由细胞质成分如质体、线粒体引起 细胞质遗传 ...转座因子:指细胞中能改变自身位置的一段 DNA 序列。 转座因子 基因工程(遗传...
遗传学题库答案
3、细胞质遗传:在核外遗传中,其中由细胞质成分如质体、线粒体引起的遗传现象...5、转座因子:指细胞中能改变自身位置的一段 DNA 序列。 6、基因工程:狭义的...
更多相关标签:
基因是遗传物质吗 | 核酸是遗传物质的证据 | 原核生物的遗传物质 | 原核细胞的遗传物质是 | 遗传物质的携带者核酸 | 真核生物的遗传物质 | 原核细胞的遗传物质 | 原核生物遗传物质 |