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生物重组工程作业


生物重组工程
一、概述
基因重组是由于不同 DNA 链的断裂和连接而产生 DNA 片段的交换和重新 组合,从而形成新 DNA 分子的过程。发生在生物体体内基因间的交换或重新组 合,包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类,是生物遗传变 异的一种机制。在生物体体外,重新组合脱氧核糖核酸分子,并使它们在适当的 细胞中增殖的遗传操作,称之为重组 DNA

技术(recombinant DNA technique) , 即遗传工程。 这种操作可把特定的基因组合到载体上,并使之在受体细胞中增殖 和表达,因此它不受亲缘关系限制,为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的 途径。 基因重组是指非等位基因间的重新组合,能产生大量的变异类型,但只产生 新的基因型, 不产生新的基因。 基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第 一次分裂, 同源染色体彼此分裂的时候,非同源染色体之间的自由组合和同源染 色体的染色单体之间的交叉互换,基因重组是杂交育种的理论基础。基因突变是 指基因的分子结构的改变, 即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变,从而 导致遗传信息的改变。 广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作(细胞工程)和分子水平上的遗 传操作,即重组 DNA 技术(recombinant DNA technique) ,狭义的遗传工程则专 指后者。 1980 年 Hobom B.采用合成生物学(synthetic biology)的概念来表述基因重 组技术。随着基因组计划的成功,系统生物学突现为前沿,2000 年 Kool E.重新 定义合成生物学为基于系统生物学的遗传工程,从而 DNA 重组技术与转基因生 物技术发展到了人工设计与合成全基因序列、基因调控网络,乃至基因组的一个 新的历史时期。

二、步骤和技术路线
重组 DNA 技术一般包括五个步骤:①获得目的基因;②与克隆载体连接,

形成新的重组 DNA 分子;③用重组 DNA 分子转化受体细胞,并能在受体细胞 中进行复制和遗传;④对转化子进行筛选和鉴定,并从具体工作中选择合适的技 术路线;⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养, 获得所需的遗传性状或表 达出所需要的产物,主要取决于基因的来源、 基因本身的性质和该项遗传工程的 目的。 1、重组 DNA 片段的取得 主要的方法有:①利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端的 DNA 片段; ②用机械方法剪切取得具有平整末端的 DNA 片段, 例如用超声波断裂双链 DNA 分子;③经反向转录酶的作用从 mRNA 获得与 mRNA 顺序互补的 DNA 单链, 然后再复制形成双链 DNA(cDNA) 。例如人的胰岛素和血红蛋白的结构基因都 用这方法获得。 这样获得的基因具有编码蛋白质的全部核苷酸顺序,但往往与原 来位置在染色体上的基因在结构上有区别, 它们不含称为内含子的不编码蛋白质 的间隔顺序;④用化学方法合成 DNA 片段,从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知 道它的遗传密码,依照这密码用化学方法可以人工合成基因。 2、DNA 片段和载体的连接 DNA 片段和载体相连接的方法主要有四种:①粘性末端连接,每一种限制 性核酸内切酶作用于 DNA 分子上的特定的识别顺序,许多酶作用的结果产生具 有粘性末端的两个 DNA 片段。例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的限制酶 EcoRI 作用于识别顺序↓…GAATTC… …CTTAAG…↑(↑指示切点) ,产生具有粘 性末端…G …CTTAA 和 AATTC… G…的片段。 把所要克隆的 DNA 和载体 DNA 用同一种限制酶处理后再经 DNA 连接酶处理,就可以把它们连接起来。②平整 末端连接, 某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端。例如来 自副流感嗜血杆菌(Hemophilus parainfluenzae)的限制酶 Hpal 作用于识别顺序 ↓…GTTAAC… …CAATTG…而产生末端为…GTT …GAA 的 DNA 片段。 用机械 剪切方法取得的 DNA 片段的末端也是平整的。在某些连接酶(例如感染噬菌体 T4 后的大肠杆菌所产生的 DNA 连接酶)的作用下同样可以把两个这样的 DNA 片段连接起来。③同聚末端连接,在脱氧核苷酸转移酶(也称末端转移酶)的作 用下可以在 DNA 的 3’羧基端合成多核苷酸低聚物。如果把所需要的 DNA 片段 与腺嘌呤核苷酸低聚物连接, 而把载体分子接上胸腺嘧啶核苷酸低聚物,那么由

于两者之间能形成互补氢键,同样可以通过 DNA 连接酶的作用而完成 DNA 片 段和载体间的连接。④人工接头分子连接,在两个平整末端 DNA 片段的一端接 上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段,这里面包含有某一限制酶的识别位点,经 这一限制酶处理便可以得到具有粘性末端的两个 DNA 片段,进一步便可以用 DNA 连接酶把这样两个 DNA 分子连接起来。 3、导入宿主细胞 将连接有所需要的 DNA 的载体导入宿主细胞的常用方法有四种:①转化, 用质粒作载体所常用的方法。②转染,用噬菌体 DNA 作载体所用的方法,这里 所用的噬菌体 DNA 并没有包上它的外壳。③转导,用噬菌体作为载体所用的方 法,这里所用的噬菌体 DNA 被包上了它的外壳,不过这外壳并不是在噬菌体感 染过程中包上,而是在离体情况下包上的,所以称为离体包装。④注射,如果宿 主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组 DNA 分子导入。 4、对转化子进行筛选和鉴定 用以上任何一种方法连接起来的 DNA 中既可能包括所需要的 DNA 片段, 也可能包括并不需要的片段, 甚至包括互相连接起来的载体分子的聚合体,所以 这些 DNA 的宿主细胞中间只有小部分是真正含有所需要的基因的。一般通过三 种方法可以取得所需要的宿主细胞:①遗传学方法,对于带有抗药性基因的质粒 来讲, 从被转化细菌是否由敏感状态变为抗药的状态就可以知道它有没有获得这 一抗药性质粒。一个抗药性基因中间如果接上了一段外来的 DNA 片段,就使获 得这一质粒的细菌不再表现抗性。 把一个带有两个抗性基因氨苄青霉素抗性和四 环素抗性的质粒 pBR322 用限制酶 Bam HI 处理,由于 Bam HI 的唯一的识别位 点是在四环素抗性基因中,所以经同一种酶处理的 DNA 分子片段就可以连接在 这一基因中间。 在被转化的细菌中选择只对氨苄青霉素具有抗性而对四环素不具 抗性的细菌,便可以获得带有外来 DNA 片段的载体的细菌,这是一种常用的遗 传学方法。 ②免疫学方法和分子杂交方法,当一个宿主细胞获得了携带在载体上 的基因后, 细胞中往往就出现这一基因所编码的蛋白质,用免疫学方法可以检出 这种细胞,分子杂交的原理和方法同样可以用来检测这一基因的存在。 5、基因表达 在构建重组体 DNA 分子和选择宿主细胞时, 还须考虑外源基因表达的问题。

就是说要求外来的基因在宿主细胞中能准确地转录和翻译, 所产生的蛋白质在宿 主细胞中不被分解,而且最好还能分泌到细胞外。为了使外源基因表达,需要在 基因编码顺序的 5’端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺 序。 两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达:①在形成重组 体 DNA 分子时在载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接 外源基因。 例如将兔的 β-珠蛋白基因或人的成纤维细胞干扰素基因分别连接到已 经处在载体上的大肠杆菌乳糖操纵子的启动基因后面, 便能使它们在大肠杆菌中 顺利地表达; ②将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上,转录和翻译 的结果将产生一个融合蛋白。 这种融合蛋白质被提纯后,还要准确地将两部分分 开,才能获得所需要的蛋白质。在早期的遗传工程研究中,生长激素释放抑制因 子和小鼠胰岛素基因的表达都是通过将它们连接在 β-半乳糖苷酶基因中的方式 实现的。

三、应用
从 20 世纪 70 年代初发展起来的基因工程技术,经过 30 多年来的进步与发 展,已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言,生物学将成为 21 世纪最重 要的学科,基因工程及相关领域的产业将成为 21 世纪的主导产业之一。基因工 程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。随着遗传学 研究的深入,人们逐渐发现细菌的结合、转导、转化、转座等现象,在这些事件 中存在明显的遗传物质转移, 而这种转移与生物繁殖过程中的遗传物质的转移有 显著区别。这些现象后来成为基因工程的基因转移技术,可以用于细菌、真菌和 动、植物的基因工程体构建。 1、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。 农作物生物技术的目 的是提高作物产、量,改善品质,增强作物抗逆性、抗病虫害的能力,基因工程 在这些领域已取得了令人瞩目的成就。 2、基因工程应用于医药方面 目前, 以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产 业之一,发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激

素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、 包括艾滋病在内的各种传染病、 类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑 难病症上, 基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟 悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子,在临 床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种生理 疾病。 3、基因工程应用于发酵工业 用大肠杆菌生产人的生长激素释放抑制因子是第一个成功的实例。 在 9 升细 菌培养液中这种激素的产量等于从大约 50 万头羊的脑中提取得到的量,这是把 人工合成的基因连接到小型多拷贝质粒 pBR322 上, 并利用乳糖操纵子 β-半乳糖 苷酶基因的高效率启动子,构成新的杂种质粒而实现的。现在胰岛素、人的生长 激素、人的胸腺激素 x-1、人的干扰素、牛的生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口 蹄疫病毒抗原等都可用大肠杆菌发酵生产, 其中有的还可在酵母或枯草杆菌中表 达,这就为大规模的工业发酵开辟了新的途径。还有些很重要的基因,如纤维素 酶的基因等也已在大肠杆菌中克隆和表达。 利用遗传工程手段还可以提高微生物本身所产生的酶的产量。 例如可以把大 肠杆菌连接酶的产量提高 500 倍。 4、基因工程的理论研究 应用重组 DNA 技术可以克隆和扩增某些原核生物和真核生物的基因,从而 可以进一步研究它们的结构和功能。重组 DNA 技术的成就和提出的问题促进了 遗传学、生物化学、微生物学、生物物理学和细胞学等学科的发展,并且有助于 这些不同学科的结合。 目前正在形成一门新兴的学科——生物工艺学或生物工程 学,就是这种趋势的反映。 5、基因工程应用于动植物育种和基因治疗 已经有一些研究工作明确地预示着重组 DNA 技术在这些方面的潜力。例如 把来自兔的 β-血红蛋白基因注射到小鼠受精卵的核内, 再将这种受精卵放回到小 鼠输卵管内使它发育, 在生下来的小鼠的肝细胞中发现有兔的 β-血红蛋白基因和 小 兔 的 β- 血 红 蛋 白 。 还 有 人 把 包 括 小 鼠 的 金 属 巯 基 组 氨 酸 三 甲 基 内 盐 I (metallothioneine I) 基因的启动子及大鼠生长激素结构基因的 DNA 片段注射进

小鼠受精卵的前核中, 由此发育得来的一部分小鼠由于带有可表达的大鼠生长激 素基因, 所以明显地比对照鼠长得大, 这些实验结果为基因治疗展现了可喜的前 景。固氮的功能涉及 17 个基因,分属 7 个操纵子,现在已能把它们全部引入酵 母菌,而且能正常地复制,不过还没有能使这些基因表达。改造玉米胚乳蛋白质 而使人畜营养必需的赖氨酸和色氨酸成分增加的工作也在着手进行, 大豆的基因 已能通过 Ti 质粒引入向日葵。因此,可以预期随着时间的推移在能源、农业、 食品生产、工业化学和药品制造等方面都将会取得巨大的成果。


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