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无选择标记转基因植物研究进展[1]


安徽农业科学。Jotu.ml ofAnhui Agri.Sci.2009.37(12l:5390-5392-5405

责任编辑李占东责任校对况玲玲

无选择标记转基因植物研究进展
张洁,郑文永,王冬梅*
(河北农业大学生命科学学院,河北保定071001)

摘要综述了近年来国内外在植物无选择标记转基

因技术方面的发展和研究成果,包括共转化法、转座ff-法(&/Ds转座子系统)、位点

特异性重组系统法(nP/陌r、Cre/I.oxP、fvIiS)等。
关键词无选择标记;转基因植物;位点特异性重组;共转化 中图分类号S188 文献标识码A 文章编号0517—661l(2009)12—05390—03

Progress缸M如搬噩锄鳓Plants 珏IANG
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Marker-free;Transge血plants;Site-specific nu:ombination;Co-tramfonmtion 子系统(Transposable element)、位点特异性重组系统(Site-spe.
cific recombinafion bination

近年来,随着商品化转基因作物的不断出现,人们对遗 传工程生物的环境安全和食品安全问题的关注越来越多。
在植物基因转移过程中,一般都使用选择性标记基因来鉴定

system)、不可逆重组系统(irreversible栅一

外源目的基因是否导人植物体。然而.当获得了真正的转基 因植株后,选择标记基因就失去了存在的价值,其继续表达
的产物也会对环境及植物体的生长发育产生不良影响,从而 对人类自身及生存环境和生态平衡造成潜在的威胁。如对 于抗生素类选择标记基因的应用,人们最担心的是,这类基 因的使用有可能被转移到微生物中,如果增加了这些微生物 在人或动物消化道内的数量,这将危及抗生素在临床及兽医 上的应用。再如对除草剂抗性基因的使用,如果这类基因流

1.1共转化法共转化是将标记基因和目的基因分别构建 在不同载体或同一载体的不同区域,共同转化受体细胞.通

过筛选和分子鉴定获得共整合植株,在后代分离中选择只含
有目的基因而不舍有标记基因的转化植株。这主要是由于 两个基因不可能完全位于同一个整合位点,因此转基因植株 在其后的自交过程中,目的基因和标记基因会发生分离和重 组,通过有目的筛选鉴定,可获得只含目的基因而不带抗性 标记基因的转化植株,从而达到去除标记基因的目的。这个

动到危害粮食作物生长的杂草中就会使其获得抗除草剂性
能,而成为现有除草剂无法将其杀死的“超级杂草”uJ。目前 关于选择标记基因对健康和环境的影响问题尚无定论,直接 影响了转基因植物在市场中的投入【2J。另外,在对转基因植 物进行二次或多次转化时。每一次转基因的插入都需要进行

系统要求共转化频率高,且共转化的DNA在受体细胞中处 于不连锁状态,才可以满足剔除标记的需要。De Block等∞o
用两个农杆菌转化油菜,共转化率达60%一80%。McKnight 等[7]在烟草的转化中用两个分别带有不同基因的农杆菌进 行转化,对后代进行筛选获得了只带有一个基因的转化体。 刘峰等18j8利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择 标记转磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的水稻植株。在实际

转化筛选,但可用于植物转基因筛选的标记基因非常有限,
难以满足再转化时对多个标记基因的要求【3j。所以,人们期 望建立一个可操作系统去除选择标记基因,以便通过重复转

应用中,由于不同转化质粒载体中的转基因共整合频率偏 低,且常整合在受体基因组的同一位点上,使共转化系统的
应用受到了限制。为了提高共转化效率,不同的研究者对共 转化方法进行了改进[9。13l。目前一般认为,双T-DNA载体

化来增加转基因的数目E4J。尽管安全性评估部门已报道。使

用新霉素磷酸转移酶(^啊Ⅱ)作为选择标记基因不存在健康
或安全方面的问题L5J,然而要对其他每一个选择标记基因及 其产物进行安全性评价,将耗费大量人力、物力、财力及时 间,影响转基因植物投入市场。因此,如何去掉转基因植物

方法比混和菌株方法的共转化率高得多。在双T-DNA的策
略中,Komari等i9]进行的Ti质粒的构建需要在农杆菌内同源 重组后才能完成,且质粒非常大,不利于基因克隆;Xing

体内的筛选标记,培育不带选择标记基因的转基因植物
(marker-free

tra瓣试a出,MEres)已成为当前植物基因工

等…10、Breifler等㈨11构建的质粒无需同源重组,质粒较小,且 操作简便,便于基因克隆,是较好的方法。h等112]将标记基 因与关注基因设计在带双右边界序列(double

程研究的迫切需要。笔者就当前国内外在植物无选择标记

转基因技术方面的研究进展作一概述。

1获得MF协的方法
构建无选择标记基因的遗传转化系统是获得生物安全
的转基因植物的有效途径。目前构建无选择标记基因的转 基因系统的方法主要有:共转化系统(Go-transformation)、转座

ri出.蛐,

DI璐)的T-DNA单元中,由于少了一个左侧边界,质粒更小, 便于基因克隆,获得了带水稻齿裂矮缩病毒基因组中第5个 基因片段s5的无选择标记转基因水稻,且效率很高。2006

年,张秀春等㈣用双T-DNA法获得了9株只含有功能基因
(△6-脂肪酸脱氢酶基因,D6D)而不含有筛选标记基因 (BAR)的转基因大豆,使T-DNA载体方法在转化频率相对较 低的大豆转化体系中得以成功应用。 1.2转座子法转座子成分能够利用保守的切割粘连机

河北省科技攻关计划项目(042401116D-I);河北省教育厅 项目(2008460);河北农业大学科研发展基金资助。 作者简介张洁(1974一),女,河北冀州人。讲师,从事植物遗传转化 方面的研究工作。*通讯作者。 收稿日期2009-01.22

基金项目

制,从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位。利用

万方数据

37卷12期

张洁等无选择标记转基因植物研究进展

5391

这一特性把标记基因或目的基因与转座子相连,当转座子在

发生了选择标记基因的删除,表明该系统在获得无选择标记 基因的转基因植株中有很好的应用价值。
1.3.2 nmgtes

基因组移动时使标记基因或目的基因通过遗传分离随机插
入到其他位点或丢失,然后在子代中筛选所需要的转基因植

R/RS系统。R/RS系统是从接合酵母(Zygos砒

株,去除转基因植物中的选择标记基因和其他多余序列,获
得安全的、无选择标记基因的转基因植株。目前已报道的用 于转基因植物标记基因剔除的转座系统主要来源于玉米的 Ac/Ds系统。应用Ac/I)s转化体系在相连的两个基因整合 后,将标记基因或关注基阂转移到新的位点上,两者相距足 够远可以通过杂交将目的基因与选择标记基因分离,在子代

mufti)中的环形质粒pSal中分离而来的,包括重组酶

R和2个重组酶识别位点憨。冗s是一段3l bp的DNA序
列,由2个12 bp的反向重复序列和1个7 bp的不对称间隔

序列组成。在重组酶R的作用下,特异位点骼发生同源重 组,切除2个船位点间的标记基因。1995年Onouchi等L21] 用含R重组酶基因的转化植株与含标记基因的植株进行有
性杂交。获得了无选择标记基因而只含报告基因的拟南芥转 基因植株。1997年Ebinuma等L3j采用一个称为多元自主转化 载体系统(MAT vector:multi.auto tmnsfonmtion)来获得不含选 择标记基因的转基因植物。2000年sI埔ta等L22J把诱导表达

水平上得到无选择标记的转基因植株Ll引。Ac/Ds转座子系
统存在于多种植物中,可移动的转座子系统能分解为不移动 的转座酶基因和可移动的末端重复序列,几乎能在所有的异

源寄主植物细胞中自由转座。刚捌妁u曲等.15?将标记基因
插入到Ds的反向重复序列之间.把GUSA构建到Ds反向序

系统和MAT载体结合,将尺基因构建在由除草剂“safener”诱 导表达的启动子之后,两侧有重组序列胚,获得了14%含有
报告基因GUS≯I的无选择标记植株,其中多数为单拷贝整

列之外,利用该载体转化番茄,在后代植株中获得了只带 C,U34基因而无抗性标记NPTII基因的植株。Ebinu哪等03J
将IPTII作为选择标记基因插入到Ac因子中,随着Ac从转 化细胞中的转座移动而丢失,最终获得了无选择标记基因的

合,使MFrefl的产生频率大大提高。这种化学诱导表达的载 体系统不再需要有性杂交过程即可将选择标记基因切除,可 以用于木本或无性繁殖植物,也使对某种植物进行多次转化
成为可能。
1.3.3


转基因番茄植株。Cot.saftis等。16-和金维正争17?先后利用
Ac/Ds转座子系统在水稻上获得了无选择标记的转基因植
株。但是.因为大多数被修饰过的转座因子被切除后又重新 插入基因组中的其他位置,只有那些发生了转座失误的细胞 才能形成表型正常的转基因苗。所以通过这种方式产生 MFI甲¥的频率较低,且操作繁琐、周期较长,只适用于有性繁 殖以及生活周期短的植物。 1.3位点特异性重组系统法位点特异性重组系统是利用 重组酶催化特异的重组位点间发生重组,导致莺组位点间相 互交换的一种精确重组形式。通过在标记基因的两端插入 DNA重组系统的识别序列,即构成一个剪切单元,在重组酶 的作用下将筛选标记基因除去。目前已使用的重组系统包 括:FLP/FRT、Cre/I.oxP、R/RS及不可逆重组系统等,目前能够 在植物中发生重组反应的主要是前3类,其中对Cre/I.oxP系 统的研究最深入,应用也最广泛。
1.3.1

Cre/I.oxP系统。CRE重组酶是1981年由Stemberg首

先从噬菌体Pl中发现的,Cae/IzⅨP系统由重组酶CRE及其 识别位点LOXP组成。CRE重组酶是位点特异性重组酶中 最重要和应用最广泛的一种重组酶L23J,是Cae/I.oxP定位重

组系统的关键因子,其活性大小直接影响重组效率的高低, 它可以识别34 bp部分回文的LOXP序列,不需其他额外能 量和蛋白质等辅助因子的参与,便可在体内外对线性、环状
甚至超螺旋的DNA分子进行重组反应【24]。由于这种简单高

效的作用方式,‰/I.oxP定位重组系统在遗传操作中发挥了
重要作用,该系统在CRE重组酶的介导下,可将两个方向相 同的LOXP位点间的DNA片段删除。1990年Dale等瞄1首次 将一个嵌合体的荧光素酶基因(LUC)作为报告基因插入到

含有选择标记基因(HPT)的载体中,两个相同方向的卿

nP/FRT系统。nP为酿酒酵母(融幽a瑚竹忧s

ceFe.

序列位于HPT基因两侧。发生在LOX间的重组使HPT基因 被切除。CRE重组酶基因与朋叩Ⅱ基因同时连接到另一质 粒上,通过二次转化.进入经过第一次转化的转化体中,eRE 表达,剧叩被切除,但同时又将另一选择标记基因(M叩Ⅱ)带 进转化植株中,然后将转基因植株进行有性杂交以彻底去掉 选择标记基因。Cleave和Mitra等。驯在此基础上又采用了一 个条件致死显性基因及利用c冗E基因的瞬时表达,从而不 通过有性杂交即可获得无筛选标记的转基因植物。2001年
Tine

v/s/ae)2”环状质粒编码的位点特异性重组酶,被首次用于切 除转基因植物中的选择标记基因,该系统是最早创建的位点 特异性系统。1989年Cregg等-18-克隆了酵母的RFL重组酶 所作用的位点FRT之间的ARG基因,将ARG+.FRT结构引 入酵母中,经筛选得到了ARG转化株.然后二次转化导入 FLP重组酶,又获得了ARG一的转化子,从而证明了重组事件 的发生。Lyznik等L19一将f1LP/矸11'系统用于玉米和水稻的原

生质体转化。单晓等【20,通过多步骤重组,建立了可在植物
中广泛应用的FLP/FRT位点特异性重组系统。该系统包括 含有FRT位点的植物表达载体pCAMBIAl300-BETA—FRT- ALS-FRT和含有由热诱导启动子HSP启动的FLP重组酶基

H毋等l驯利用Qe/IJ0xP原理构建了pc麟载体系统,利

用热诱导型启动子HSP81.1启动a暖重组酶基因,用GU¥

作为报告基因,将CRE重组酶和卡那抗性基因TN903连接 共同位于两个同向重复的位点之间构建了pCz锨载体,在拟
南芥中验证了将系统的可用性。同时,Zuo等l驾一驯又发展了 一个化学诱导表达系统,以XVE控制CRE基因的表达,从而

因的植物表达载体pCA^忸队130阻嬲P_肛卢删叩。利用二次
转化的方式将两者先后转入烟草植株,热激处理后,热诱导 型启动子lISP调控的重组酶咒尸基因的表达催化位于选择 标记基因AIS两侧同向用盯位点间的重组反应,有效地删 除了选择标记基因ALS。41%的经热激处理的二次转化植株

剔除LOXP序列之间的选择标记基因,获得了高频率的无选
择标记的转基因拟南芥。这种化学诱导表达的位点特异性

重组系统,可以特异瞬时的表达重组酶基因,高效切除标记

万方数据

5392

安徽农业科学

2131)9篮

基因和重组酶本身,防止重组酶提前表达过早切除选择标 记,也能避免重组酶过量表达对植物带来的潜在危害。2006 年高尚等。30在常用植物组成型表达载体pBIl21的选择标记 基因NPTII两侧插入同向的LOXP位点并用多克隆位点取

破瑚j。另外,目前建立的基因叠加技术利用噬菌体和细菌

DNA发生重组交叉的特异A邢和A珊位点,将后续基因
逐一重组到同一特定位点.再由可逆的重组系统将同时转入 的选择标记基因删除。可以实现基因叠加,为多基因复合性

代了GUS基闪序列,构建r NPTII基因可被去除的和町插入 目的基因的通用植物表达载体pBll21.LOX-MCS。替换
pBll21.LOX.MCS中驱动目的基因表达的35S启动子,构建了 韧皮部特异表达载体pBDENP-IDX.MCS。为方便地筛选去 除选择标记基因的转基因植物,还构建了绿色荧光蛋白 (GFP)表达框与NPTII表达框连锁pBll21.GFP-LOX-MCS载 体,这些植物表达载体可广泛地应用于培育选择标记可去除 的转基因植物。2007年Zhongsen Li等。3¨首次利用胚胎发育 特异表达启动子与Cre/LoxP系统结合,构建了一种胚状体发 育期诱导表达的筛选标记基闪自动删除系统,该方法进一步 验证了Cre/LoxP系统地高效性。总之,Cre/I_oxP系统相对于 其他方法更能有效消除筛选标记基因,是当前新的研究 方向。 1.3.4不可逆重组系统。除以上3种重组系统外,还有两种 不可逆的重组系统L32J。一种是阻six和Ya--res重组系统,该 重组系统的重组酶只能催化DNA片段的删除,不能催化 DNA的整合,所以重组反应不可逆。另一种是phiC31和 TP901.1重组系统.该重组系统的特点是重组反应发生后形 成新的酶切位点(ATTL及AT/'R),而蘑组酶只能识别最初的 两个不同重组位点(A刀田和AT/P),不能催化新生成的位点 间的重组反应,重组反应不可逆。有研究表明,PhiC31重组 系统中的INT重组酶,除了能将外源DNA整合到靶基因组,

状的转基因技术提供.r理论依擗37一。总之.以上转化系统
还有待进一步发展和完善,研究开发出新型高效安伞的转基 因方法、培育无选择标记的转基因植物是转基因领域发展的 必然趋势。 参考文献
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还能有效删除质体基因组中的标记基卧33j。
1.4其他方法除上述方法外,直接转化筛选法和采用安 全标记基因法也可用于无选择标记转基因植物的培育。直 接筛选法获得的转化植株需要通过PCR反应等技术进行系

gen∞ation



marker-free tmusgerlic plaras

in three

diretatltivwsdflee(0r)Ⅲsat/va
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歹悭定,筛选工作量巨大,成功的可能性小,相关报道较
少134j。为了避免使用抗牛素或除草剂等抗性标记基因.越
来越多的安全标记基因被用于植物的遗传转化。这一系统 主要是利用无毒副作用的选择剂抑制非转细胞,促使转化细

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er-frye吣enic

re-positioning and sUb6ⅨIut州diuination d

illlrkeF genes

from tnn弹蚵c ttl'm

胞处于某种有利的代谢或发育条件而存活下来。目前应用
的安全标记基因有甜菜碱脱氢酶基因(BADH)、葡萄糖醛酸 酶基因(GUS)、木糖异构酶基因(XYIA)、磷酸甘露糖异构酶 基因(PM!或MANA)、来源于农杆菌的IPT基因和ROL基因

lJj.Bklechnology(N Y),199"3.1l:1286—1292. 【16]COISAHIS O,SMJAu)C。BREITIER J C.el
elation d

J【.Mol酬.2002,10:165—180.

T-DNA'and

marker-free rice

o‰s

a1.矗mspM—mediated


gen-

expressing

Bt

endotlrdn gme

以及甜椒类铁氧还蛋白基因(腑P)等。利用这些安全标记
基因不仅可以获得无抗性标记基冈的转化植株,缓解抗性标 记基因的生物安全问题,而且可以提高难以转化的物种的转

[17]金维正,段瑞君,吴平,等.利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选 择柄可己丰{基冈植株的方法[J].生物下程学报,20ff4,19(6):669—673. 118 J CREGG J M,MAI)[hEN K R.Use d sile-spedfic re“mbination to regenerate
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conifinase 9-/5.
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v喇F"睁

化效挚蚓。然而这砦标记基因作为外源DNA片段仍存在于
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F,GOF'AL'I.D N,VAN

o铅ucture



rMnbinase a.nplexed

和整合的转基因技术筛选优良株系的过程烦琐、费时费力;
高效位点特异性重组反应介导外源基因在特定位点的导入

site-specific recmiination

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或删除,并进行稳定表达和遗传,是转基因技术的最新突

(下转第5405页)

万方数据

37卷12期

伊西庆等黑龙江流域黑斑狗鱼遗传多样性的cyIb基因初探

裸鲤属鱼类(G胂,10c巾一s)【18]的兀值,显示出黑龙江流域3个 地理群体黑斑狗鱼的遗传多样性非常贫乏。研究发现。白斑

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狗鱼群体的遗传多样性水平也非常低下,Maes等对欧洲6个
国家12个Cytb基因55l bp的序列研究中,只发现了3个变

异位点,共定义2种单倍型,其群体单倍型多样性(日)为
0.167,核苷酸多样性7c值则仅为O.0130 9,远低予其他淡水鱼 类¨9|。Matsuo认为,种群出现高日值低,c现象的原因一方 面是种群曾遭受严重的瓶颈;另一方面是因为种群分化时间 不长未积累足够的变异[203。笔者研究得到的黑斑狗鱼种群 单倍型多样性数值较高(0.763
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ariindatlyts

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性较低(O.001 26),表明黑斑狗鱼曾遭受过严重的瓶颈效应。 Nieod也认为,小种群自避难所后的扩散或者数量有限种群 的广泛人工移植是欧洲白斑狗鱼种群低水平线粒体DNA变

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异的原因【2lJ。黑斑狗鱼的遗传多样性如此贫乏可能与第四 纪冰川有关.冰期使很多淡水鱼类遭受了灭顶之灾倒22,狗鱼
种群也遭遇了严重的破坏,少数幸存下来的黑斑狗鱼,自冰 期避难所扩散出来后,虽然种群数量在一定时间内大幅增

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长,但瓶颈效应和建群者效应限制了黑斑狗鱼遗传多样性的
发展。 由于历史原因.黑斑狗鱼的遗传多样性已经非常贫乏, 而环境污染及人类的酷渔滥捕,造成黑斑狗鱼种质资源不断 衰退,其栖息范围不断缩小,种群数量急剧下降.遗传多样性 也不断降低,而较小的群体数量又导致近交频繁发生从而加 剧了黑斑狗鱼种群遗传多样性的丧失,形成了恶性循环。因 此,要阻止黑斑狗鱼走向濒临灭绝的境地,采取有效的保护

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[18]程起群,马春艳,庄平,等.基于线粒体砸基因标记探讨凤鲚3群体

目前黑斑狗鱼的种质资源衰退严重,而遗传多样性丰富
与否决定了未来生物适应变幻莫测环境的能力。但笔者的 研究受限于取样地点和样本的数量。未能全面反映黑龙江流 域狗鱼遗传多样性的地理分布。因此,需要进一步调查取样 黑龙江水系更多大样本的地理群体并采用AFLP、微卫星等 多种分子标记,以更加准确和详细地了解黑斑狗鱼的遗传多 样性,为建立黑斑狗鱼的种质资源库和制定相应的保护措施 奠定基础。

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(上接第5392页)
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无选择标记转基因植物研究进展
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 被引用次数: 张洁, 郑文永, 王冬梅 河北农业大学生命科学学院,河北保定,071001 安徽农业科学 JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES 2009,37(12) 0次

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相似文献(10条)

1.学位论文 陈松彪 植物无选择标记转化系统的研究及无选择标记高效抗虫转基因水稻的培育 2004
植物转基因研究中通常都要使用选择标记基因来筛选转化细胞并获得转基因植株,然而选择标记基因也引起了安全性方面的担心。因此建立高效、 简便、短周期的无选择标记植物转化系统,对提高转基因植物的安全性、加快转基因植物商品化进程有重要意义。本研究对共转化和Cre/lox介导的无选 择标记转化系统进行了研究和比较分析,旨在建立高效实用的无选择标记转基因植物培育体系,结合水稻抗虫基因工程研究,进一步培育高效抗虫的无 选择标记转基因优良水稻新材料。 构建了植物表达载体pCALHGUS,pCUBACloxHpt和pCACrebar。pCALHGUS中潮霉素磷酸转移酶基因hpt表达结构的两侧连着两个同向lox位点,并位于水 稻actin1启动子和β-葡萄糖酸苷酶(GUS)基因gusA之间。当hpt结构在Cre酶作用下被剔除时,actin1启动子可以和gusA基因融合在一起从而驱动gusA表 达。pCUBACloxHpt同样含有(lox-hpt-lox)结构,同时携带修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因sck和苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白基因 cryIAc。pCACrebar含有cre基因结构。通过农杆菌介导转化明恢86,然后利用有性杂交方法将cre基因导入已整合有lox-hpt-lox结构的植株中。在4个转 pCALHGUST0植株×转pCACrebarT0植株所配组合的30个杂交F1植株中,12个(40%)植株表达GUS活性,9个(30%)表现潮霉素敏感。在9个转 pCUBACloxHptT2代纯合植株×转pCACreBarT2代纯合植株所配组合的77个杂交F1植株中,56个(72.7%)植株表现潮霉素敏感。分子分析证实在这些对潮霉 素敏感的植株中hpt基因已经被剔除。 本研究同时对Ti质粒载体共转化系统进行研究。以分别仅含有新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ和报告基因gusA的普通载体pCNPT-Ⅱ和pCDMARGUS的混合 菌株共转化烟草(cv.Xanthi)。在混合菌株转化获得的植株中,共转化频率仅为9.1%,共转化自交T1代GUS阳性与卡那霉素抗性发生分离的株系为 50.0%。本研究同时构建了双T-DNA植物表达载体pCDTNGUS。载体中,选择标记基因nptⅡ和报告基因gusA分别位于两个独立的T-DNA。以含有pCDTNGUS的 农杆菌转化烟草(cv.Xanthi),获得的转化植株中,共转化频率为62.1%。共转化T0植株自交产生的T1株系中,41.7%的株系GUS阳性与卡那霉素抗性发 生分离,产生无选择标记的转基因植株。实验结果表明,双T-DNA载体方法具有更高的共转化频率,能更高效地获得无选择标记转基因植物。综合比较双 T-DNA载体系统法和有性杂交方法的Cre/lox系统介导法可见,利用双T-DNA载体系统法能比Cre/lox系统介导法在更早世代,更快速获得无选择标记转基 因植物。 构建了双T-DNA抗虫单子叶植物表达载体pCDMARUBAC-Hyg。载体中的一个T-DNA携带潮霉素磷酸转移酶基因hpt为选择标记基因,另一个T-DNA同时携 带双价抗虫基因sck和cryIAc。通过农杆菌介导转化籼稻优良恢复系明恢86,获得138个独立来源的转化植株,其中74个(53.6%)共转化了sck和 cryⅠAc基因。对18个T1代株系进行遗传分离分析,6个(33.3%)株系中sck和cryIAc与潮霉素抗性发生分离。PCR和Southern检测证实分离植株为无选择 标记转基因植株。Northern、ELISA检测表明外源基因在无选择标记转基因植株中得到有效表达。对来源于T0植株PK105的T2后代植株和T3纯合株系进行 田间抗虫性鉴定,结果表明无选择标记转基因水稻对鳞翅目害虫有显著抗性。双价抗虫的无选择标记转基因水稻为国际上首次获得,这些材料为进一步 培育更安全的抗虫杂交水稻新组合奠定了基础。 进一步构建了携带gfp基因的双标记双T-DNA植物表达载体pCDTGNGUS。载体中的一个T-DNA含有nptⅡ以及绿色荧光蛋白(GFP)基因mgfp5,另一个TDNA含有gusA。通过农杆菌介导转化烟草(cv.Xanthi),采用常规法和GFP辅助法筛选再生芽进行生根。常规方法获得的芽中,75.6%(62/82)可以在含卡 那霉素培养基中生根,GFP辅助筛选的苗则100%(55/55)能够生根。T0代植株中,共转化频率为56.3%。对29个共转化T1株系的遗传分析表明,除1个株 系检测不到GFP表达外,其余28个株系的GFP阳性与卡那霉素抗性呈完全连锁遗传,41.4%(12/29)的株系GUS阳性与双标记表达性状(卡那抗性及GFP阳性 )发生分离,产生无选择标记的转基因植株。实验结果表明,利用双标记双T-DNA载体系统,在转化过程中能够通过GFP辅助筛选提高烟草转化的效率;在 T1后代筛选过程中,能够通过检测GFP表达快速筛除具有选择标记基因的分离植株,大量减少后代筛选的工作量,进而提高获得无选择标记转基因植株的 效率。

2.期刊论文 王东双.李成琼.宋洪元.刘艳玲.WANG Dong-shuang.LI Cheng-qiong.SONG Hong-yuan.LIU Yan-ling 培育无选择标记的转基因植物 -生物技术通讯2006,17(3)
目前,几乎所有的植物遗传转化都要通过使用选择标记基因,如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子,虽然没有研究结果表明选择标记基因影响人 类健康或环境安全,但近年来也引发了人们对转基因产品安全性的担心.为了消除公众对转基因食品的安全性顾虑,无选择标记的转基因植物应运而生.本 文综述了共转化系统、位点特异性重组系统(包括FLP/FRT、Cre/lox、R/RS及Gin/gix系统)和转座子系统(Ac/Ds转座子系统)在培育无选择标记转基因植 物中的应用.

3.期刊论文 雷桅.刘昕 无选择标记技术与转基因植物食品安全性 -中国食品学报2009,9(5)
转基因技术已被公认为提高农作物产量、改良农产品品质的革命性技术.转基因食品已越来越多地进入人们的日常生活.目前植物转基因操作中广泛 使用选择标记基因,如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子.虽然尚无研究表明选择标记基因会影响人类健康,但近年来人们对转基因植物安全性问题 的担心日益严重.为了消除公众对选择标记基因引起的转基因植物安全性的顾虑以及向已转化的植物中重复叠加外源基因等问题,无选择标记技术应运而 生.这种全新的安全性转基因技术有巨大的应用潜力.本文对6种主要的无标记转基因技术及其在转基因植物食品安全性控制领域的应用做一综述.

4.会议论文 孙磊.张启翔 无选择标记转基因植物研究进展 2005
在基因转移过程中,筛选标记基因常被用于筛选转化细胞或组织,给转基因工作带来很大方便,但在获得转基因植物之后,常用的筛选标记基因尤其是 抗生素抗性基因的使用往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且不利于使用相同标记基因进行多重转化.为了消除这些弊端,培育无选择标记的转 基因植株已成为植物基因工程研究中的热点.本文主要综述了近年来有关获得无选择标记转基因植物的原理与方法、研究进展及存在的问题,并对该技术 在转基因观赏植物中的应用进行了展望.

5.学位论文 侯敬尧 利用无选择标记表达载体获得转TPS1基因的百脉根 2008
近年来,非生物胁迫特别是低温、干旱和盐害对农作物产量的影响日益加重,如何提高农作物抵抗不良外界环境的能力在农业生产上具有重要意义 。利用植物分子生物技术提高植物的抗寒、抗旱和耐盐能力是近几年研究的热点。在几个关键的逆境因子中,干旱尤其值得重视,因为随着全球水资源 的不断恶化,干旱问题将会越来越突出,而随着抗旱新基因的不断发现,有关转化抗旱相关基因并得到抗性植物的报道越来越多。 在转基因植物中,标记基因常被用于筛选转化细胞或组织,给转基因工作带来很大方便,但在获得转基因植物之后,筛选标记基因的存在可能对植 物的生长发育产生不良影响,这也是目前公众担心转基因植物安全性的最重要原因。把选择标记基因去掉,将提高转基因植物的环境安全性和食用安全 性,更易被广大消费者所接受,也有利于对同一个植物品种进行多次转基因操作。近年来,科学工作者已经在建立无选择标记基因转化系统方面作了大 量尝试,获得了无标记基因的转基因植物(MFTPs:Marker-Free Transgenic Plants)。 本研究中,我们以啤酒酵母基因组DNA为模板,利用PCR的方法从中分离得到与抗旱相关的海藻糖-6-磷酸合酶(TPS1)基因,以一种可化学诱导的 Cre/loxP位点特异性DNA重组体系pX6-GFP载体为基础,对其进行改造,将其中的绿色荧光蛋白(GFP)基因替换成为TPS1基因,构建新的pX6-TPS1载体。利 用农杆菌介导法将新构建的载体pX6-TPS1转入豆科模式植物百脉根中,经抗生素筛选后获得转基因植株。这些植株在5μM/L β-雌二醇的诱导下,载体 上两个loxP位点中间的抗生素选择标记基因连同Cre、XVE片断在酶的作用下从转基因百脉根基因组中切除,获得无选择标记的转基因植物并通过了PCR分 子鉴定。叶片保水力实验结果证明,转基因植株叶片失水速度明显比对照缓慢,说明保水能力增强,可以提高抗旱能力。本研究的结果对于其它重要农 作物转基因研究具有重要的借鉴意义。

6.期刊论文 陈松彪.李旭刚.王锋.朱祯.CHEN Song-biao.LI Xu-gang.WANG Feng.ZHU Zhen 无选择标记转基因植物 的培育 -中国生物工程杂志2005,25(2)
植物转基因研究中通常都要使用选择标记基因来筛选转化细胞并获得转基因植珠.但是当转基因植株育成后,选择标记基因就失去了存在的意义.为了 消除由选择标记基因引起的安全性隐患,人们发展了一些培育无选择标记转基因植物的策略.这些策略主要包括共转化、位点特异性重组和转座子转座等 .去除选择标记基因将促进公众对转基因作物的接受.评述了无选择标记转基因植物的研究进展.

7.学位论文 周红艳 利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因植物的研究 2002
该实验由部分组成:1,采用携带质粒pDLBRBbarm的单一根癌农杆菌LBA4404和携带有质粒pCDMARGUS-NPT-Ⅱ的单一根癌农杆菌LBA4404分别转化模式

植物烟草(NicotianatabacumL.)(Xanthi).质粒pDLBRBbarm含有两个T-DNA区域,分别包含选择标记nptⅡ基因和作为目的基因看待的抗除草剂基因 bar;质粒pCDMARGUS-NPTⅡ含有两个T-DNA区域,分别包含选择标记nptⅡ基因和作为目的基因看待的报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,gus)基 因(uidA).以选择标记nptⅡ基因作为筛选标记,在获得的转化植株中,检测另外一种基因bar或gus的存在情况.2,采用携带有质粒pCNPTⅡ和携带有质粒 pCMasBarm的根癌农杆菌混合菌液共同转化烟草,质粒pCNPT-Ⅱ的T-DNA区域上有选择标记nptⅡ基因,质粒pCMasBarm上有目的基因bar,共转化频率为 20﹪~58﹪,低于使用双T-DNA转化的共转化频率.该实验说明利用双T-DNA载体系统获得无选择标记基因的转基因植物是可行的.

8.学位论文 李旭刚 Ⅰ植物转基因失活及MAR功能研究Ⅱ无选择标记转基因植物研究 2000
该研究将作为报导基因的β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)导入植物,然而在一些思索基因植株中检测不到GUS活性.通过 Southern杂交分析,发现外源嵌合基因启动子部分发生了DNA甲基化现象和多考贝整合事悠扬.进一步的Nothern杂交结果显示,失活植株检测不到的报导基 因转录的mRNA.另一项工作从玉米基因组分离的MAR样序列,此序列长667bp,位于乙醇脱氢酶基因启动子区域,在碱基组成上与同源序列有一定的差异.该研 究还从豌豆基因组分离了745bp的长的MAR样序列.将此序列分别构建在uidA及mptII两侧(-MAR-nptII-uidA-MAR-)和构建在uidA的两侧(-nptII-MAR-uidAMAR-),通过农杆核辐射介导转化烟草.GUS活性检测表明,豌豆基因组来源的MAR样序列在两种构建形式中均可以提高外源报导基因的表达水平.与不含 MAR样序列转基因烟草相比,MAR样序列的存在可以使报导基因的表达水平提高2倍,并且稳定基因的表达水平.此DNA序列含有MAR序列中常见的保守序列,但 与已知同源序列相比有较大差异,缺失了115bp的重复序列.与玉米基因组来源MAR样序列相同,豌豆来源MAR样序列在瞬时表达中也不影响报导基因的表达 活性.结查询证明,此MAR样序列尚未见报导.

9.期刊论文 叶春雷.魏兵强.杨随庄.YE Chun-lei.WEI Bing-qiang.YANG Sui-zhuang 用共转化法培育无选择标记 转基因植物研究进展 -甘肃农业科技2007,""(12)
介绍了用农杆菌介导的共转化法培育无选择标记基因转基因植物的原理、方法、影响因素以及其国内外研究进展.

10.学位论文 杨爱馥 无载体骨架无选择标记玉米转化体系的优化 2009
植物转基因技术的研究和新产品的开发已取得了突破性进展,在解决人类面临的环境污染、资源短缺等问题显示出巨大的作用。但是,近年来随着 人们对生物安全性的关注,载体骨架序列和选择标记基因作为“垃圾DNA”影响着转基因植物的安全性评价。因此,建立无载体骨架无选择标记的转基因 技术已成为植物基因工程领域的研究热点。虽然花粉管通道法可以将线性DNA片段导入植物基因组,直接获得无载体骨架无选择标记的转基因植株,但其 转化率和可重复性有待提高。 玉米是重要的粮食兼饲料作物,在我国农业生产中占有非常重要的地位。本研究以玉米为试材,在花粉管通道法基础上建立并优化了子房滴注转化 方法,其操作要点是将DNA转化溶液直接滴加在完全去除花柱的子房上。首先通过苯胺兰染色观察花粉管确定转化操作开始时间为授粉后16 h,然后利用 子房滴注法转化无载体骨架无选择标记的线性GFP基因转化元件(GFP基因表达框两侧分别包含25bp T-DNA左右边界序列)。对FITC标记的线性转化元件进 行显微观察和示踪,结果表明子房滴注法与花粉管通道法相比,缩短了外源DNA进入胚囊的路径和时间;转化缓冲液0.05% Silwet L-77+5%sucrose缩 短了外源DNA进入胚囊的时间并加大进入量。通过PCR检测,确定适合子房滴注法转化的玉米品种为9818,最佳转化时间为授粉后18~20 h,最佳转化缓 冲液成分为0.05% Silwet L-77+5% sucrose,在此条件下PCR阳性率达到6.47%。 本研究进一步对线性GFP基因转化元件在转基因植物基因组中的整合方式、拷贝数、表达情况和后代遗传规律进行了分析。Southern blot结果表明 GFP基因以低拷贝数、简单的方式(1~3条Southern杂交带)整合到玉米基因组;Northern blot结果表明GFP基因在转录水平上表达;在转基因植株的根和 幼胚中观察到GFP表达;转基因植株的后代遗传分析表明GFP基因能够遗传至T2代并正常表达,部分转基因株系中的GFP基因以孟德尔遗传方式传递给T1代 ,但T2代不符合孟德尔分离比。 为了验证玉米子房滴注法的可重复性,本研究将分别包含T-DNA边界和LKR/SDH(lysine-ketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase)边 界的线性GUS基因转化元件(LKR/SDH基因5’端部分序列-CaMV35S-GUS基因-nos-LKR/SDH基因3’端部分序列)转化玉米,PCR阳性率分别为7.2%和 11.5%。结果表明,玉米来源的LKR/SDH基因部分序列作为线性转化元件的边界可提高转化率;子房滴注法由于规范了操作要点、确定了最佳转化时间和 转化缓冲液而具有较高的转化率和良好的重复性。对包含LKR/SDH边界的线性GUS基因转化元件在转基因植物中的整合、表达和遗传规律也进行了分析 ,Southern blot结果表明GUS基因以简单的方式(1~2条Southern杂交带)整合到玉米基因组;RT-PCR结果表明GUS基因在转录水平上表达;组织化学染色 结果表明GUS基因在转基因植株的根、叶和幼胚中正常表达;对4个T1代转基因株系的组织化学染色和PCR检测结果表明,GUS基因以孟德尔分离方式遗传 并正常表达。 由于子房滴注法的转化率受到不同玉米品种子房外部形态的影响,为了完善无载体骨架无选择标记的玉米遗传转化体系,本研究利用花粉管通道法 转化线性GFP基因转化元件,并建立了简便、高效的检测方法。首先确定玉米花粉管通道法的操作要点:授粉后17~18 h,与穗轴顶部相齐切掉花柱和苞 叶,将转化元件溶液滴加在花柱上。通过观察GFP在幼胚中的表达确定花粉管通道法的转化部位(籽粒位于玉米果穗的5~8圈);然后利用PCR检测和观察 GFP表达从位于转化部位的籽粒中筛选转基因植株,检出率提高到4.96%,并进一步验证了花粉管通道法的转化部位;Southern blot结果表明GFP基因以 简单的方式整合到玉米基因组;Northern blot结果表明GFP基因在转录水平上表达。 本研究建立了具有较高转化率的子房滴注转化法和适用于花粉管通道转化的简便、高效的检测方法,这两种方法互相补充,初步完善了无载体骨架 无选择标记的玉米遗传转化体系。通过分析外源基因的整合方式、拷贝数、表达情况和后代遗传规律,为子房滴注法在生产实践中的广泛应用提供理论 依据。

本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_ahnykx200912028.aspx 授权使用:河南农业大学(hnnydx),授权号:eb7a13f8-dafc-42c6-8a67-9e59014d9397 下载时间:2010年12月27日


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