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Ag


第 39 卷

分析化学 ( F EN XI HUAXU E)   研究报告 第3期                           2011 年 3 月 Chinese Jo urnal of Analytical Chemist ry 356~360
DOI : 10. 3724/ SP. J. 1096. 2011. 00356


Ag/ Au 纳米粒子的没食子酸还原制备及其

共振瑞利散射光谱测定人血清总蛋白
王文星   黄玉萍   徐淑坤
( 东北大学理学院 ,沈阳 110004)

1    引 言

共振瑞利散射 ( RRS) 作为共振非线性光散射 ,是具有高灵敏度和简易性的分析技术 ,因其灵敏度和 精密度高 、 干扰较少 、 操作简便等优点而备受关注 。最早是以有机染料分子作探针测定核酸[ 1 ] 、 蛋白 质[ 2 ] 、 [ 3 ] 、 [ 4 ] 、 多糖 药物 无机分子[ 5 ] 等 。近年来陆续出现以纳米粒子为探针测定药物和生物样品的报 道 [ 6~10 ] ,由于 Ag/ A u 核壳纳米粒子既保留了 A u 壳层良好的生物相容性和亲和力 [ 11 ] ,同时 Ag 核又能 大幅度地提高表面增强拉曼散射和共振光散射等光检测信号[ 12 ,13 ] ,在生物分析检测方面具有明显优越 性 。Ag/ Au 核壳纳米粒子的制备主要采用以柠檬酸钠或盐酸羟胺作为还原剂的种子生长法 [ 14 ,15 ] 。本 研究以没食子酸为还原剂和稳定剂 ,用种子生长法在 Ag 晶种表面还原沉积 A u , 简单快速地制备出一 系列含有不同 Ag/ A u 摩尔比的 Ag/ Au 核壳纳米粒子 。本方法具有操作简便 , 组分比例可控 , 壳层包 覆完全 ,粒径均匀 、 分散性和稳定性好等优点 。将制备的 Ag/ A u 摩尔比为 1 ∶ 6 的 Ag/ A u 核壳纳米 1. 粒子作为探针用 RRS 技术测定人血清总蛋白 ,不仅探针不需修饰 ,操作简便 ,选择性和稳定性好 , 而且 比传统的染料法[ 16 ,17 ] 有更高的灵敏度 ,其检出限达到 0. 36 g/ L ,可满足纳克级蛋白质检测的需要 。

2  实验部分

2. 1   仪器与试剂 L S255 荧光分光光度计 ( Perkin Elmer , U SA ) ,U V22100 双光束紫外2可见分光光度计 ( 北京瑞利公 司) ,J EOL 2010 EX 高分辨透射电镜 ( H R T EM ,J apan ,工作电压 200 kV ) 携带 INCA X2sight X2射线能 量色散光谱仪 ( EDX , England) ; PB221 型 p H 酸度计 ( 北京赛多利斯仪器系统有限公司) ; SZ293 自动双 重纯水蒸馏器 ( 上海亚荣生化仪器厂) 。考马斯亮蓝 G2250 ( Amresco 公司) ,人免疫球蛋白 ( Ig G ,北京博 奥森生物技术有限公司) ,人血清白蛋白 ( HA S ,Sigma 公司) 。HAuCl 4 、 AgNO3 和没食子酸等试剂均为
  2010207215 收稿 ;2010210208 接受 本文系国家自然科学基金 ( No . 20870511) 和中央高校基本科研业务费 ( No . N100405014) 资助 3 E2mail ∶ xushukun46 @126. co m

分析纯 ,购自国药集团化学试剂有限公司 。人血清试样由东北大学医院提供 。实验用水为三次蒸馏水 。 2. 2   Ag/ Au 核壳纳米粒子的制备与表征 2. 2. 1   纳米粒子晶种的制备   Ag 参照文献 [ 18 ] 制备银纳米粒子晶种 : 先将 200 mL 三次蒸馏水置于 三口瓶中 ,水浴加热至沸 , 磁力搅拌下依次加入 1. 0 mL 0. 02 mol/ L AgNO3 溶液 ,1. 0 mL 2. 7 × - 2 10 - 4 mol/ L 没食子酸溶液和 100 L 2. 4 × 10 mol/ L HAuCl 4 溶液 , 溶液很快由无色变为亮黄色 , 反应 30

摘    要 以没食子酸为还原剂和稳定剂 , 用种子生长法制备出粒径均匀 、 单分散性和稳定性好 、 近球形的 Ag/ Au 核壳纳米粒子 。高分辨透射电镜 ( HR TEM) 与 X2射线能量色散光谱仪 ( EDX) 测试表明 ,在 Ag/ Au 摩 尔比为1 ∶ 6 时 ,Au 已完全包裹在 Ag 纳米粒子表面时 ,平均粒径为 25 nm 。以此摩尔比制备的 Ag/ Au 核壳 1. 纳米粒子为探针用共振瑞利散射光谱测定人血清总蛋白 ,在 NaAc2 HAc 缓冲液 (p H 4. 4) 及 0. 05 mol/ L NaCl 介质中 ,Ag/ Au 核壳纳米粒子与 HSA 形成稳定的复合物 ; Ag/ Au2 HSA 纳米复合物的相对散射强度Δ I390 nm 与 HSA 浓度在 01 0011 ~ 0. 35 mg/ L 范围内呈线性关系 , 其回归方程为 Δ I390 nm = - 0. 54 + 494. 82 c ( r =
01 9994) ,检出限为0. 36

一致 ,回收率在98. 2 %~102. 3 %之间 ,相对标准偏差为 2. 3 % 。

关键词   Ag/ Au 核壳纳米粒子 ; 没食子酸 ; 共振瑞利散射光谱 ; 人血清总蛋白

g/ L 。本方法有较好的选择性 ,可用于人血清蛋白分析 ,结果与考马斯亮蓝 G 250 法 2

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Ag/ Au 纳米粒子的没食子酸还原制备及其共振瑞利散射光谱测定人血清总蛋白

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min 后自然冷却 ,制得 Ag 纳米粒子 。室温避光保存 ,3 个月内无沉淀 ,颜色未变化 。 2. 2. 2   Au 核壳纳米粒子的制备   2. 2. 1 节制备的 Ag 晶种 50 mL ,加入 150 mL 水 ,水浴加热至 Ag/ 取 沸腾 ,磁力剧烈搅拌 , 逐滴加入不同体积的 24 mmol/ L HA uCl 4 及 27 mmol/ L 没食子酸溶液 , 制备了 Ag/ A u 摩尔比分别为 1 ∶ 05 , 1 ∶ 1 , 1 ∶ 2 , 1 ∶ 5 , 1 ∶ 8 , 1 ∶ 0 和 1 ∶ 6 的系列复合纳米粒 0. 0. 0. 0. 0. 1. 1.

子。 2. 2. 3   纳米粒子的表征   紫外2可见吸收光谱 ( U V2vis) : 取 3 mL 纳米粒子溶液于 1 cm 石英比色池 , 以水为参比进行扫描 。H R T EM 图像和 EDX 能谱 : 将纳米粒子溶液滴加到覆有碳膜的铜网上 ,自然干 燥后 ,置于 H R T EM 中成像 ,同时用电子束聚焦在单个纳米粒子上 ,分析单个纳米粒子的元素组成及比 例。 2. 3   Ag/ Au2 HSA 的 RRS 光谱 在比色管中依次加入 2. 4 mL Ag/ A u 核壳纳米粒子 ,0. 3 mL 0. 01 mol/ L NaAc2 HAc 缓冲液 ,0. 3 mL 不同浓度的 HSA 溶液 ,摇匀 ,室温下放置 25 min 。用光程为 1 cm 的石英比色池 , 在荧光分光光度 λ 计上以 Δ = 0 方式同步扫描 ( 200~800 nm) RRS 光谱 ,于λ =λ = 390 nm 处测定产物的散射光强度 em ex 0 0 Δ I RRS 和空白对照的散射光强度 I RRS , I RRS = I RRS - I RRS 。以上产物所得散射光强度 I RRS 均为消减至 1 % 的测量值 。

3  结果与讨论

3. 1   Ag/ Au 核壳纳米粒子的 UV vis 吸收光谱 2 文献 [ 15 ] 报道 ,在核壳型纳米粒子的合成中 ,当 Au 包裹在 Ag 纳米粒子外层时 , A u 纳米粒子的光谱性质 会随着包裹程度的增加逐渐显示出来 , 通常表现出 Ag 和 Au 两个等离子共振吸收峰 ,但是当核纳米粒子表面 形成一层厚度达到 3~4 nm 的壳层时 ,体吸收带仅显示 出一个吸收峰 , 表现为壳层金属的特征吸收峰[ 19 ] 。如 图 1 所示 ,当 Ag/ Au 摩尔比为 1 ∶ 05 时 ,其吸收峰与   1  Ag ,Au 纳米粒子及不同 Ag/ Au 摩尔比下 , 0. 图 Ag 纳米粒子的吸收峰峰形相似 , 仅峰位略有红移 , 峰强 Ag/ Au 核 壳 纳 米 粒 子 紫 外2可 见 吸 收 光 谱 ( Ag 0. 1 mmol/ L) 稍有降低 ,表明 A u 已开始包裹 Ag 纳米粒子 。当 Ag/ Fig. 1   2vis abso rption spect ra of Ag , Au nan2 UV Au 摩尔比在 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 5 范围内时 , 吸收峰明显宽 0. 0. oparticles and Ag/ Au core/ shell nanoparticles wit h 化 ,Ag 纳米粒子和 Au 纳米粒子的特征吸收带都有吸 different Ag/ Au molar ratio s ( Ag , 0. 1 mmol/ L ) 收 ,并随着 Ag/ Au 摩尔比的减小 , 在 Ag 特征吸收区域

的峰高逐渐降低 ,而在 Au 特征吸收区域的峰高逐渐增大 , 表明 A u 在进一步地包裹 Ag 纳米粒子 。当 Ag/ A u 摩尔比在 1 ∶ 8~1 ∶ 6 范围内时 ,它们在 A u 的特征吸收区域出现一个吸收峰 ,而属于 Ag 特 0. 1. 征吸收区域的吸收峰消失 ,且随着 Ag/ Au 摩尔比的减小 ,吸收峰位逐渐红移 ,吸收峰强度不断增强 ,在 摩尔比为 1 ∶ 6 时 ,纳米粒子的吸收峰强度在 523 nm 处达到最强 ,表明此时 Au 已完全包裹在 Ag 纳 1. 米粒子表面 ,此现象与文献 [ 19 ] 一致 。此外 ,随着 Ag/ A u 摩尔比的减小 ,体系的颜色由 Ag 纳米粒子的 黄色逐渐过渡到 Au 纳米粒子的红色 ,表明 Ag/ Au 核壳纳米粒子的形成 。这一规律与 Ag/ Au 合金纳 米粒子的表面等离子吸收特性存在明显差异 : Ag/ A u 合金纳米粒子仅有一个吸收峰 , 介于纯银和纯金 纳米粒子的吸收峰之间 [ 20 ] 。 3. 2   Ag/ Au 核壳纳米粒子的 HRTEM 图和 ED X 分析 由图 2A 可见 ,制备的 Ag/ A u 复合纳米粒子具有明显的核壳结构 , 形貌接近球形 , 单分散性较好 , 平均粒径为 25 nm ,比反应初期生成的 18 nm 银晶种 [ 18 ] 长大了 7 nm 。由图 2B 可知 ,单个纳米粒子上含 有 Ag 和 Au 两种元素 ,其原子比为 1 ∶ 4 ,与其参加反应的 Ag/ A u 摩尔比值较接近 。结合 UV2vis 吸 1. 收光谱结果 ,证实本方法制备的是 Ag/ Au 核壳纳米粒子 。 3. 3   Ag/ Au 核壳纳米粒子的 RRS 光谱 如图 3 所示 ,Ag/ A u 核壳纳米粒子在 390 nm 处有最强共振散射峰 , 其峰形与 Au 纳米粒子的相 似 ,表明 Au 已完全包裹在 Ag 纳米粒子表面 ,且其最大 RRS 强度介于 A u 纳米粒子与 Ag 纳米粒子之

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间 。Ag 纳米粒子和 Ag/ Au 核壳纳米粒子的 RRS 强度 为消减至 1 %后的结果 , 而 A u 纳米粒子为强度未消减 的测得结果 , 所以 Ag 纳米粒子和 Ag/ Au 核壳纳米粒 子的实际强度是 A u 纳米粒子的 100 倍以上 。可见 , 与 Au 纳米粒子相比 ,Ag/ A u 核壳纳米粒子能大幅度地提 高 RRS 光谱的检测信号 ,同时又保留了外层 A u 的生物 相容性和光学特性 。 3. 4   Ag/ Au2 HSA 的 RRS 光谱 如图 4 所示 ,当 Ag/ A u 核壳纳米粒子与 HSA 结合 后 ,其结合产物的散射强度明显增强 , 且散射强度随着   3  Ag 纳米粒子 ( A ) , Ag/ Au 摩尔比为 1 ∶ 6 图 1. HSA 浓度的增加成比例增强 , 呈线性关系 。这是由于 时 Ag/ Au 核壳纳米粒子 ( B ) 和 Au 纳米粒子 ( C) Ag/ A u 核壳纳米粒子表面吸附的没食子酸还原产物带 的 RRS 光谱 负电荷而具有亲水性 , 在水溶液中不能形成界面 , 但是 Fig. 3  Reso nance Rayleigh scattering ( RRS) spec2 当 HSA 包裹在纳米粒子外层通过静电作用形成超分子 t ra of Ag nanoparticles ( A ) , Ag/ Au core/ shell nanoparticles wit h Ag/ Au molar ratio of 1 ∶ 6 1. 聚合物后 ,纳米粒子表面的负电荷被大量中和 , 与水之 (B) and Au nanoparticles (C) 间形成明显界面 ,此固2液界面导致了 RRS 光谱增强 [ 6 ] 。 3. 5   优化 Ag/ Au 核壳纳米粒子2 HSA 体系 RRS 检测条件 由图 5 可见 ,在 0. 01 mol/ L NaAc2 HAc 缓冲体系下 , 随着 p H 值的增加 ,Ag/ Au2 HSA 复合物的 RRS 强度发生 由弱至最强再减弱的明显变化 , 且在 p H 4. 4 时达到最 强。故选择 p H4. 4 的 0. 01 mol/ L NaAc2 HAc 缓冲溶液 作为酸度介质 。固定体系中 HSA 浓度为 0. 2 mg/ L ,当 介质中 NaCl 浓度大于 0. 05 mol/ L 时 ,其 RRS 强度随着 NaCl 浓度增大而迅速降低。这是因为所制备的 Ag/ Au 核壳纳米粒子呈胶体状态 ,过高浓度的 Na + 和 Cl - 破坏体 系的稳定性 ,导致粒子凝聚沉淀。故反应体系应控制在 低离子强度下 。   4  HSA ( A ) 、 Au 摩 尔比 为 1 ∶ 6 时的 图 Ag/ 1. 在上述优化条件下 ,反应时间在 25 min 内 ,Ag/ Au Ag/ Au 核壳纳米粒子 (B) 、 Au2 HSA (0. 1 mg/ Ag/ 核壳纳米粒子与 HSA 结合反应完全 ; 在反应完成后的 L , C ) 、 Au2 HSA (0. 2 mg/ L , D) 和 Ag/ Au2 Ag/ 35 min 内 ,产物的 RRS 强度基本保持不变 ,表明反应产 HSA (0. 3 mg/ L , E) 的 RRS 光谱 Fig. 4  RRS spect ra of HSA ( A ) , Ag/ Au wit h 物有较好的稳定性 ,能满足分析操作的要求 。 Ag/ Au molar ratio of 1 ∶ 6 (B) , Ag/ Au2 HSA ( 0. 1. 3. 6   人血清总蛋白的测定 1mg/ L , C ) , Ag/ Au2 HSA ( 0. 2 mg/ L , D ) and 3. 6. 1   标准曲线   在最佳实验条件下 ,测定 Ag/ A u 核 ( ) 壳纳米粒子与不同标准 HSA 浓度的复合物的 RRS 强 Ag/ Au2 HSA 0. 3 mg/ L , E

图2  Ag/ Au 摩尔比为 1 ∶ 6 时 Ag/ Au 核壳纳米粒子的 HR TEM 图 ( A ) 和 EDX 谱图 (B) 1. Fig. 2  High resolution t ransmissio n elect ron micro scop yic ( HR TEM) image ( A ) and energy dispersive X2ray spect romet ry ( EDX) analysis result (B) of Ag/ Au co re/ shell nanoparticles wit h Ag/ Au molar ratio of 1 ∶ 6 1.

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Ag/ Au 纳米粒子的没食子酸还原制备及其共振瑞利散射光谱测定人血清总蛋白

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度 ,以 Δ I 为纵坐标 , HSA 浓度 ( c ,mg/ L ) 为横坐标绘制标 准曲线 。得到一元线性回归方程为 Δ I = - 0. 54 + 494. 82 C ,相关系数 ( r) 为 0. 9994 , 线性范围是 0. 0011 ~ 0. 35 σ mg/ L ,检出限 ( 3 ) 为 0. 36 g/ L , 相对标准偏差为 2. 3 % ( 0. 2 mg/ L HSA , n = 11 ) 。表明方法有很高的灵敏度 。 3. 6. 2   方法的选择性  HSA 浓度为 0. 2 mg/ L 时 , 考察 了常见共存离子和氨基酸对体系 RRS 强度的影响 。结果 表明 , 体 系 中 1 ×10 - 5 mol/ L 的 Ca2 + , Co 3 + , Li + , Na + , Mn2 + , Al 3 + , Mg2 + , Ag + , Zn2 + 等 阳 离 子 , 1 × - 5 mol/ L 的 Cl - , NO3 - , I - 等 阴离 子 均 不 干 扰 测   5   H 值对 Ag/ Au2 HSA (0. 2 mg/ L ) RRS 10 图 p 定 ; 除了 L2半胱氨酸由于含有的巯基与粒子外层的 Au 结 强度的影响 合产生沉淀而干扰测定外 ,51 0 mg/ L 的氨基丙酸 ,甘氨酸 , Fig. 5  Effect of p H on RRS intensity of Ag/ Au2 HSA ( 0. 2 mg/ L ) D , L2甲硫氨酸 , L2谷氨酸等氨基酸均不干扰测定 , 表明方 法有较好的选择性 ,能用于实际样品的测定 。 当各种蛋白质含量相同时 ,由于蛋白质的氨基酸组成 、 分子大小以及二级结构的不同会引起共振散 射信号的差异 。在最佳实验条件下 , 以 0. 2 mg/ L HSA 为标准 , 检验了几种不同蛋白质的响应差异 。 结果表明 ,牛血清白蛋白 (BSA ) 、 卵清蛋白和免疫球蛋白 ( Ig G) 的响应值分别为 99. 0 % ,98. 3 %和 96. 5 % ,而牛血红蛋白的响应差异相对较大为 80. 4 % ,可能是部分氨基酸组成或分子大小不同的缘故 。在 人血清中人血清白蛋白和免疫球蛋白是主要蛋白 ,它们的响应值基本一致 ,因而 , 本方法可用于测定人 血清中总蛋白的含量 。 3. 6. 3   人血清样品中总蛋白的测定 、 回收率与显著性检验   0. 01 mol/ L NaAc2 HAc 缓冲体系 ( p H 在 4. 4) 下 ,介质中 NaCl 浓度为 0. 05 mol/ L ,将人血清样品稀释 1000 倍 ,进行测定 。将本方法与经典的考 马斯亮蓝 G2250 法 ( CBB 法) [ 23 ] 进行对照 ,测定结果及加标回收率 ( 测试液中加入 0. 2 mg/ L HSA ) 见表 1 。本方法的 RSD 为 1. 5 %~2. 8 % ,样品平均回收率为 98. 2 %~102. 3 % 对两种分析方法测定结果的 F 检验和 t 检验表明 ,两种分析方法的测定精密度和含量平均值均无显著性差异 。
表1  人血清样品中总蛋白含量的测定 Table 1   Determination of total p roteins in human serum samples
样品
RRS 方法 RRS met hod Samples

测得值 Found
(g/ L) 69. 6 79. 5 77. 4 75. 3

RSD ( % , n = 5) 2. 1 1. 5 1. 8 2. 5

回收率 Recovery
( %) 101. 1 98. 2 99. 4 102. 3

样品 1 样品 2 样品 3 样品 4

Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4

 

   实验结果表明 ,本方法有很高的灵敏度和精密度 ,较好的选择性和稳定性 ,不仅可用于血清中微量 蛋白质的测定 ,也有望用于其它样品如尿液中微量蛋白质的测定 。
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考马斯亮蓝 G2250 方法 CBB G 250 met hod 2 测得值 Found RSD
(g/ L) 68. 8 78. 6 78. 2 76. 5 1. 9 2. 3 1. 6 2. 8

( % , n = 5)

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er . High resolutio n t ransmissio n elect ro n micro scopic ( HR T EM ) image and energy disper sive X2ray ence of A u and Ag in individual nanoparticle wit h t he average size of abo ut 25 nm. The Ag/ A u core/ shell nanoparticles wit h Au/ Ag molar ratio of 1 ∶ 6 were used as p ro bes to determine human serum 1. p roteins by reso nance Rayleigh scattering ( RRS) spect ro met ry. The result s indicated t hat in p H 4. 4 NaAc2 HAc buffer solutio ns and in t he p resence of NaCl of 0. 05 mol/ L , HSA was co mbined wit h regress equatio n of Δ I390 nm = - 0. 54 + 494. 82 C ( r = 0. 9994 ) and t he detectio n limit of 0. 36 g/ L . human serum , wit h a RSD of 2. 3 % and t he recovery range of 98. 2 % ? 102. 3 % , and t he result s were met ry ; Human serum p roteins
( Received 15 J uly 2010 ; accepted 8 October 2010)

indicating t he assay is of good selectivit y. The assay was applied to t he detectio n of total p roteins in in a good agreement wit h t hat of Coo massie brilliant blue G2250 assay.

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G allic Acid Based Synthesis of Silver/ Gold Nanoparticles and Resonance Rayleigh Scattering Detection of Human Serum Proteins
( Col le ge of S ciences , N ort heastern Uni versit y , S heny an g 110004) WAN G Wen2Xing , HUAN G Yu2Ping , XU Shu2 Kun 3

Abstract  Nearly sp herical Ag/ Au core/ shell nanoparticles wit h good mo nodisper sit y and stabilit y

at 390 nm (Δ I390 nm ) was linear to HSA co ncent ratio n in t he range of 0. 0011 - 0. 35 mg/ L , wit h t he

were synt hesized in aqueo us solutio n by seed growt h met hod using gallic acid as reductant and stabiliz2 Ag/ A u core/ shell nanoparticles to form stable co mplex. The enhanced reso nance scat tering intensit y Co2existing metal io ns and amino acids excep ting L2cysteine did not interfere wit h t he detectio n , spect ro met ry ( EDX) showed co mplete coating of gold o n t he surface of Ag nanoparticles and t he p res2

Keywords  Silver/ gold core/ shell nanoparticles ; Gallic acid ; Reso nance Rayleigh scat tering spect ro2


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802.1ag协议详细介绍
802.1ag 协议详细介绍 随着越来越多种类业务在互联网上的运行,对电信级网络的故障检测、管理 等也提出了更高的要求, 运营商会要求设备制造商提供的交换设备,光...
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