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生物技术育种


叶国锐

2007210579

植物生物技术在作物改良中的利用

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利用小孢子培养为技术核心的十字花科蔬菜优异材料创新 利用小孢子培养为技术核心的十字花科蔬菜优异材料创新
1.项目的立项依据 1.1 项目的意义
众所周知:北方的大白菜、南方的青菜、全国的甘

蓝和萝卜、出口的青花菜、我省的 花椰菜、榨菜、雪菜等十字花科蔬菜,在农业生产中、在种植业结构调整中、在人们日常 生活中、在增加农民收入中有着举足轻重的地位;尤其在世界经济一体化趋势的今天,这 些十字花科蔬菜更凸现了我国之可贵的传统特色。在我国社会快速发展的今天,行业人士 无不深感:进入新世纪,我国蔬菜新品种数量虽呈对数式增加,而具市场潜力和应用前景 的突破性品种却凤毛麟角,目前主要蔬菜商业品种的遗传相似性越来越高,在兵临城下的 国际竞争面前我国蔬菜种业呈严峻形势,这给我国蔬菜育种提出了“快速、突破、创新” 之要求,而实现新品种突破的关键在于优异材料的创新。近年来快速发展起来的十字花科 蔬菜游离小孢子培养技术与传统育种技术的结合是优异材料快速创新的有途径之一,它只 需1~2年即可纯化远缘杂交产生的特异种质资源、纯化国内外引进的优良育种材料、纯化优 良性状聚合后的种质,而有效获得大量不同性状的DH纯系,通过鉴定与筛选进而得到优异 的材料,用于培育新品种,对由多基因控制的特异性状的筛选也能实现一步到位。迄今, 本课题组拥有大白菜、青菜、甘蓝、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等十字花科蔬菜种质1500 余份;在其远缘杂交、国内外优良品种的分离、多个优良性状的聚合等方面做了大量的工 作;在其游离小孢子培养方面投入了大量精力,其技术基本成熟,现已成功培育出一些大 白菜、甘蓝、青花菜、花椰菜的DH系,其中部分优异的DH系已应用于新品种的选育之中。 该项目的实施将为我省十字花科蔬菜种质资源的挖掘、 育种技术的提升和材料创新等 方面做出有益的探索; 将为十字花科蔬菜新品种的选育打下良好的基础; 将为我国十字花 科蔬菜优异材料的创新和新品种的选育走上“突破” “创新” “快速”发展轨道做出大的贡 献;对填补我国十字花科蔬菜优异材料短缺、提升我省蔬菜育种技术水平、提高我省蔬菜 育种地位、拉动我省种籽行业的知名度和竞争力、促进我省蔬菜产业的发展、增加农民收 入、推动我省农业的快速发展以及我省自主知识产权走出国门等方面都具重要意义。

1.2 国内外研究进展
研究现状 优异材料是构成优异品种的基础,优异材料的创新一直被国内外育种工作者高度重 视。1982 年,Lichter 首次报道甘蓝型油菜小孢子培养形成植株。随后,这一技术不断加 以改进。加拿大、英国、德国、日本均有报道,其中以加拿大所做工作最多,成果最为突 出。到目前为止,我国已经利用小孢子培养技术得到了大量的油菜小孢子植株,在大白菜 中利用小孢子培养技术获得了大批纯合自交不亲和系。 此外, 游离小孢子培养技术在小白

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菜、甘蓝、花椰菜、红菜薹、青花菜等十字花科蔬菜方面也有报道。 (1)利用小孢子培养育成的十字花科蔬菜新材料及新品种 目前, 游离小孢子培养技术正在十字花科作物育种中发挥着重大作用。 1998 年河南农 科院已经利用游离小孢子培养技术先后育成豫白菜 7 号、豫园 50 等多个大白菜新品种。 1998 年华中农业大学陈玉萍等借鉴大白菜小孢子的培养获得单倍体、再经加倍获得二倍 体纯系的方法,进行了包心芥菜品种游离小孢子技术的研究。1999 年北京市蔬菜研究中 而且还利用大白菜的小孢子 心利用小孢子培养技术育成了优质大白菜新品种桔红心 1 号, 胚状体获得了抗除草剂转基因植株。2005 年北京市农林科学院蔬菜研究中心利用游离小 孢子培养结合苗期人工接种抗病性鉴定技术育成中熟青麻叶类型京翠 70 号大白菜一代杂 种。天津的科研单位也正在利用小孢子技术进行自交系的纯化工作。 (2) 利用远缘杂交、小孢子培养进行十字花科蔬菜新种质创新 2006年福州市蔬菜研究所陈文辉等进行了甘蓝和青花菜杂种小孢子培养研究。 (3)利用小孢子培养筛选十字花科蔬菜各种抗性的突变体 利用培养物的突变能够产生抗病、抗盐、抗除草剂的高产植株。Ahmad L 等用 UV 紫外 线处理大白菜分离小孢子获得抗根腐病突变体。2005 年北京市农林科学院曹鸣庆等曾将 大白菜黑斑病毒素加入培养基, 结果从诱导得到的小孢子胚中筛选出了对黑斑病表现一定 程度抗性的大白菜小孢子植株。 发展趋势 虽然小孢子培养技术在育种工作和基础研究中有了很多应用, 对作物改良和种质创新 具有十分重要的地位和意义, 并随着小孢子培养技术及其各种育种方法的日益成熟, 越来 越被众多跨国种子公司和育种工作者作为实用生物技术所接纳并采用。 但是, 小孢子培养 技术有一些机制还不清楚。诱导频率不高、物种及基因型间存在差异,是目前实际应用中 的一大障碍。小孢子培养的启动仅是在猜测、探讨中。 今后发展的趋势: 在逐渐实现小孢子培养技术实用化的过程中, 深入研究小孢子胚胎 发生机制、激发机制、自然加倍机制以及与之相对应的生理生化、遗传因素;将小孢子培 养技术与传统育种技术、转基因技术、分子标记技术相结合。

1.3 主要参考文献
许勇,丁海凤. 蔬菜优异种质挖掘与创新是推动我国蔬菜种业进步的有效途径. 中国蔬菜,2005(7):18-21 葛亚明, 陈利萍. 植物细胞工程在十字花科作物种质创新中的研究进展. 细胞生物学杂志, 2004,26:471-474 顾宏辉, 胡林军, 周伟军. 小孢子培养技术在芸苔属作物育种上的应用研究进展. 农业生物技术学报, 2004,12 (2): 219-223 轩正英. 芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术研究进展. 塔里木大学学报, 2006, 18(3):46-50

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韩阳,许艳辉,冯辉. 白菜游离小孢子培养研究进展.沈阳农业大学学报, 2002,33( 3):228 – 231 汤青林,宋明,张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展.西南农业学报,2000,13(3):98-103 姜凤英,冯辉,李娜,王平.甘蓝类植物游离小孢子培养研究进展.辽宁农业科学, 2006(5):28-30 郭金英,申书兴,陈雪平等.十字花科蔬菜游离小孢子培养研究进展.河北农业大学学报,2002,25 张丽, 王静. 十字花科作物单倍体育种研究进展. 安徽农业科学, 2003, 31(2):231-234 史庆馨. 十字花科作物游离小孢子技术研究进展. 北方园艺, 2003 (4):9 王日勇, 肖旭峰. 蔬菜作物游离小孢子培养研究进展. 湖南农业科学, 2003,(5):16- 18 曹丽娟, 奕非时, 李锡香. 植物游离小孢子培养的研究进展. 2005, 36(5):660-663 陈文辉,方淑桂,曾小玲等. 甘蓝和青花菜杂种小孢子培养. 热带亚热带植物学报, 2006,l4(4):321- 326 Ahamd I, Day JP, Macdonald MV, et al. Haploid culture and UV mutagenesis in rapid-cycling Brassica napus for the generation of resistance to chlorsulfuron and Alternaria brassicicola. Annals of Botany, 1991, 67: 521-525. Bjorkman T, Pearson KJ. High temperature arrest of inflorescence development in broccoli (Brassica oleracea var. italica L.). Journal of Experimental Botany 49. 1998, 49: 101-106. Christine Q, Hon g SW, Elizabeth V, et al. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell, 2000, 12(4): 479–492. FAO / IAEA. Mutation Varieties Database. 2007, http://www-infocris.iaea.org/MVD/. Ferrie A. Combining microspores and mutagenesis. PBI bulletin, 1999, 17-19. Fletcher R, Coventry J, Kott LS. Doubled haploid technology for winter and winter Brassica napus. Revised edition. OAC Publication. Guelph, Ontario, Canada: University of Guelph, 1998. pp 42. Kaluzewiez A, Kordaow J, Czosnowski E, et al. Effect of thermal conditions on the initiation of broccoli curd. Journal of Polish Agricultural Universities, 2002, 5(2): 1-8. Kott LS. Application of doubled haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus. AgBiotech News and Information. 1998, 10: 69-74. NALC. 2004, URL: http://www.nalc.org/depart/hbrreports/hbr1100.html. Palmer, CE, Keller WA, Arnison PG. Utilization of Brassica haploids. In: Jain SM, Sopory SK and Veilleux RE (eds.), In Vitro Haploid Production in Higher Plants. Vol.3, Dordrecht, Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1996, 173-192. Zhang FL & Takahata Y. Microspore mutagenesis and in vitro selection for resistance to soft rot disease in Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis). Breeding Science, 1999, 49: 161-166.

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项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 2 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 2.1 研究内容
在本课题组现有的较为成熟的十字花科蔬菜游离小孢子培养技术的基础上,有计划、 有目标地较大规模地开展其游离小孢子培养, 以快速育成多个具有自主知识产权和育其种 应用前景的十字花科蔬菜优异育种材料,实现生物技术的实用化是本项目研究的主要目 标;围绕其目标,拟进行以下主要研究内容: (1)聚合杂交、构建核心种质 根据青菜(小白菜) 、大白菜、包心菜(结球甘蓝) 、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜 等不同十字花科蔬菜目前和长远的育种目标所需,结合多年积累的育种经验,在抗病性、 抗逆性、品质、商品性、耐寒性、耐热性、耐抽薹性、适应性等方面进行有目标的聚合杂 交,构建核心种质,以此预期培养出符合其不同育种需求的优异育种材料。 (2)规模化游离小孢子培养 利用本课题组现有的较为成熟的青菜(小白菜) 、大白菜、包心菜(结球甘蓝) 、青 花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等不同十字花科蔬菜游离小孢子培养技术体系,有规模地进行 其游离小孢子培养,预期培养出大量的 DH 植株。 (3)大量 DH 植株的系统鉴定 对培养出的大量 DH 植株,根据其不同的育种要求,进行其特征特性的系统鉴定, 特别是抗病性(多抗) 、抗逆性、品质、商品性、耐寒性、耐热性、耐抽薹性、适应性等 特异性鉴定。 (4)优异材料的评估与筛选 在大量 DH 材料系统鉴定的基础上,根据不同的育种目标,结合生产实际与多年的 育种经验(包括配合力测定) ,对其进行评估与筛选,以获得优异材料。 (5)培养技术体系的改良与完善 结合项目实施,对上述不同蔬菜的培养技术体系进行改良与完善,特别是榨菜、雪 菜及包心菜培养技术体系进行的改良与完善性研究,以提高其培养效率。

2.2 研究目标
升华传统的十字花科蔬菜育种技术;实现生物技术的实用化;在较短的时间内,利 用游离小孢子培养技术育成具有自主知识产权和应用前景的十字花科蔬菜优异育种材 料。 2、具体指标 (1)育成优异的十字花科蔬菜育种材料共计 30 份。其中:青菜(小白菜)4 份、大 白菜 9 份、包心菜(结球甘蓝)4 份、青花菜 3 份、花椰菜 6 份、榨菜 2 份、雪菜 2 份。 这些材料要求:是 DH 系,育性正常,在抗病性、抗逆性、商品性、品质、耐寒性、 耐热性、耐抽薹性、适应性等方面优异性突出,在育种(或生产上)可迅速利用。

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(2)形成较为完善的青菜(小白菜) 、大白菜、包心菜(结球甘蓝) 、青花菜、花椰 菜、榨菜、雪菜等 7 种十字花科蔬菜游离小孢子培养技术的实用化体系。 (3)发表游离小孢子培养及其材料创新的相关论文 3 篇。 3、应用或产业化前景 开展“以游离小孢子培养为技术核心的十字花科蔬菜优异材料创新”项目研究,对于 开发利用符合我省消费习惯的优良的地方品种,对于研发十字花科蔬菜特、异、优、新的 种质资源, 对于筛选各种抗性突变体育种材料, 对于育成符合市场需求的十字花科蔬菜突 破性优良新品种,对于促进我省蔬菜产业发展等方面具有广阔的应用和产业化前景。

2.3 拟解决的关键问题
(1)聚合杂交、构建核心种质 结合多年积累的育种经验,在抗病性、抗逆性、品质、商品性、耐寒性、耐热性、 耐抽薹性、适应性等方面进行有目标的聚合杂交,构建核心种质,以此预期培养出符合其 不同育种需求的优异育种材料。 (2)规模化游离小孢子培养 利用本课题组现有的较为成熟不同十字花科蔬菜游离小孢子培养技术体系,有规模 地进行其游离小孢子培养,预期培养出大量的 DH 植株。 (3)大量 DH 植株的系统鉴定 对培养出的大量 DH 植株进行其特征特性的系统鉴定。 (4)优异材料的评估与筛选 在大量 DH 材料系统鉴定的基础上,根据不同的育种目标,结合生产实际与多年的 育种经验(包括配合力测定) ,对其进行评估与筛选,以获得优异材料。 (5)培养技术体系的改良与完善 结合项目实施,对上述不同蔬菜的培养技术体系进行改良与完善,特别是榨菜、雪 菜及包心菜培养技术体系进行的改良与完善性研究,以提高其培养效率。

3.拟采取的研究方案及可行性分析。 拟采取的研究方案及可行性分析。
本项目以目标种质的广泛搜集与优良性状的聚合为起点, 以游离小孢子培养为材料纯 化的主要手段,在实现大量 DH 植株的基础上,结合常规选育与鉴定方法,实现耐抽薹、 耐热、抗病、优质等优异目标材料的创新;具体实施将本着充分利用现有资源、充分利用 现有技术积累、创新与传统相结合、研究与应用相结合、生物技术与传统技术相结合的原 则;采取内容、时间、空间互动的研究策略,确保在较短时间内,完成关键技术研究、优 异材料创新等项目任务。

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技术路线图
挖掘各类原始种质

聚合杂交、构建各类核心种质

性 状 鉴 定

规模化游离小孢子培养

UV 诱变技术

单核靠边期花蕾 培养 的 与

分离小孢子

高温处理

NLN 液培(25℃)
再 生 植 株 的 春

固体培养基培养
化 与 越 夏 技 术 的

优 异 突 变 体 的 筛 选 技 术 改 良 与 完 善 善 善 完 完 善 与 与 完 良 良 与 改 改 良 的 的 改 术 的 技 术 定 技 鉴 估 状 评 性 合 合 综 综 系 纯

D H

加倍

DH

综合性 的系

DH 纯系的综合评估与筛选

各种创新性优异育种材料



的游离小孢子培养

体系

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4.本项目的特色与创新之处 本项目的特色与创新之处 4.1 项目特色
(1)游离小孢子培养高成胚率技术; (2)小孢子抗病、耐盐碱突变体的筛选技术; (3)游离小孢子再生植株的春化、越夏及正常结籽技术; (4)品质、抗热性等综合性状的鉴定技术。

4.2 项目创新之处
本项目以目标种质的广泛搜集与优良性状的聚合为起点,以游离小孢子培养为材料 结合常规选育与鉴定方法, 实现耐抽薹、 纯化的主要手段, 在实现大量 DH 植株的基础上, 耐热、抗病、优质等优异目标材料的创新。 从种质的收集到鉴定、从目标性状的聚合到小孢子 DH 系培养、从 DH 植株的鉴定 到优异性综合评估均由项目组科技人员自主完成,项目科研属原始创新。

5.年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划及预期研究结果
项目计划 2010 年 1 月至 2012 年 12 月实施,其年度计划是:
起始年月 2010-01-01 至 2010-12-31 2011-01-01 至 2011-12-31 2012-01-01 至 2012-12-31 进 度 目 标 1、项目组织实施、工作准备。(细化方案、挖掘种质、改善设备等) 2、聚合杂交、构建各类核心培养材料。(鉴定、杂交、培植等) 3、游离小孢子培养及诱变。(培养、UV 诱变、技术改良与完善等) 1、游离小孢子培养。(培养、技术改良与完善等) 2、DH 材料的鉴定。(特征特性鉴定、育性鉴定等) 3、优异育种材料的筛选。(重要优异材料的筛选及繁殖) 1、技术关键的攻关,完善培养技术体系。(重点是榨菜、雪菜) 2、项目总结、验收。

6.研究基础与工作条件
1、项目申请单位多年一直开展十字花科蔬菜新品种的选育工作,曾承担过浙江省“八 五”、“九五”、“十五”大白菜、小白菜、青菜、萝卜等新品种的选育与推广项目。先 后选育成一批在生产上有重要栽培价值的十字花科蔬菜新品种,创造了明显的社会经济效 益,曾获浙江省科技进步二等奖和国家科技进步三等奖。目前正以抗病、丰产为基础,开 展优质型、生态型、加工型、出口型为目标的新品种选育工作。

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2、项目申请课题组现拥有十字花科蔬菜种质资源1500余份,其中:大白菜800余份、 青菜200余份、甘蓝100余份、青花菜100余份、花椰菜200余份、榨菜20余份、雪菜30余份、 其它50余份;并在其远缘杂交、国内外优良品种的分离、多个优良性状的聚合等方面做了 大量的种质储备工作,这为顺利完成本申请项目提供了良好的物质条件。 3、项目申请重点实施的游离小孢子培养,将在依托单位的省蔬菜重点实验室进行,该 实验室拥有实施本项目所需的主要仪器设备,包括LI-6400便携式光合仪、FACSCalibur 流 式细孢仪、分光光度计、HPLC、无菌过滤器、超净工作台、MQ超纯水装置、制冰机、大 容量离心机、人工气候室、光温培养箱、生化培养箱、冰箱冰柜、大功率摇床、大容量灭 菌锅、分析天平、倒置显微镜、微机与统计分析软件以及其它常规仪器等;和人工气候箱、 恒温组培室、无菌操作室、可控温室、连栋大棚、试验地等配套设施,这些为顺利完成本 申请项目提供了较完备的研究支撑条件。 4、本项目组成员具有良好的技术传承与互补梯队;项目申请者及所在课题组在十字 花科蔬菜新品种选育及其游离小孢子培养方面积累了较为丰富的实际经验; 近年来在十字 花科蔬菜游离小孢子培养技术及其育种应用方面方面投入了大量精力, 迄今已大量培养出 大白菜、甘蓝、青花菜、花椰菜 DH 再生植株,成功培育出一些大白菜、甘蓝、青花菜、 花椰菜的 DH 系,其中部分优异的 DH 系已应用于新品种的选育之中,并已初步建立了高 效的十字花科蔬菜小孢子培养技术体系, 发表十字花科蔬菜小孢子培养有关的研究论文十 多篇; 所熟练掌握的十字花科蔬菜高效游离小孢子培养技术, 是国内少数掌握芸薹属小孢 子培养技术的研究单位之一;此外,项目组还在油菜上进行过 UV 小孢子离体诱变试验, 取得了较好的研究结果,其试验过程及有关技术与本研究较为相似,可起到借鉴作用,同 时,通过多年的努力,已筛选出一批小孢子培养出胚率好的供体材料,为充分利用 UV 提 供了较好的试验平台,这些均为本项目取得预期研究结果提供了较好的技术保

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7.经费预算及使用说明
项目名称:以小孢子培养为技术核心的十字花科蔬菜优异材料创新 概算科目名称 (1) ) 合计 (2) ) 省财政拨款 经费 (3) ) 金额单位: 万元 地方部门配 套经费 (4) ) 自筹经费 (5) )

序号

1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

一、经费支出(合计)
1、设备费 (1)购置设备费 (2)试制设备费 (3)设备租赁费 2、材料费 3、测试化验加工费 4、燃料动力费 5、差旅费 6、会议费 7、合作、协作研究与交流费 8、 出版/文献/信息传播/知识产权事务费 9、人员劳务费 10、专家咨询费 11、管理费 12、其他开支

50

45

5

12 5 11 1 2.5 6.5 3 5 1 2 1

12 5 11 1 2.5 6.5 3 5 1 2 1

1
2 3 4 5 6

二、经费来源(合计)
1、申请省财政经费 2、地方、部门配套拨款 3、自筹经费 (1)单位自有货币资金 (2)其他资金 5 45

省财政科技经费拨付进度申请 金 额

第1年 27 60

第2年 13.5 30

第3年 4.5 10

比例(%)


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