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Plant Cell 中文稿转录组微阵列显示乙烯在棉花纤维细胞伸长过程中具有主导作用


转录组微阵列、分子生物学以及生理学方法揭示 了植物激素乙烯在棉花纤维细胞伸长过程中具有 主导作用
施永辉 a 朱生伟 a,b 毛希增 a 冯建勋 a 秦咏梅 a 张亮 c 程京 c 魏丽萍 a 王志勇 b,d 朱玉贤 a,e,1

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蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室及北京大学生命科学学院 中科院植物研究所发育生物学中心 北京博奥生物芯片有限公司 美国加利福尼亚州斯坦福大学卡内基研究所植物生物学系 国家植物基因研究中心(北京) 通讯作者。电子邮件:zhuyx@water.pku.edu.cn,传真:86-10-6275-4427

摘要
陆地棉产生了世界上运用最广泛的自然纤维,但科学界仍然没有很好 地揭示控制纤维细胞伸长的真正机制。通过对棉花纤维 cDNA 文库进 行测序以及后续的微阵列分析,我们发现,乙烯合成是纤维伸长过程 中最显著上调的生物代谢途径之一,介导乙烯合成的类甲硫胺酸氨基 环丙烷羧酸氧化酶基因(ACO1-3)在这个时期中表达很高。体外培养 的棉花胚珠释放的乙烯气体的含量与 ACO 基因表达水平以及纤维生长 速度相一致。外缘添加的乙烯气体能显著促进纤维细胞的伸长,而乙 烯合成抑制剂 AVG 能特异地抑制纤维的生长。油菜素(BR)合成途 径在纤维生长过程中有轻微上调,用 BR 或油菜素合成抑制剂 BRZ 处 理纤维也能引起纤维细胞的伸长和抑制。但相比之下,用乙烯处理的 效果要明显得多,而且乙烯气体能够解除 BRZ 对纤维细胞伸长的抑制 作用,但 BRZ 则不能逆转 AVG 对纤维细胞伸长的抑制。本文结果表 明,乙烯在促进棉花纤维伸长中起主导作用,并且可能通过提高蔗糖 合酶、微管蛋白以及扩展素基因的表达而促进细胞伸长。

前言
棉花是纺织工业中的纤维原材料的主要来源。棉花纤维,也就是通常说的表皮 毛,是从胚珠表皮细胞分化而来的单细胞结构。陆地棉(Upland cotton, 拉丁名 Gossypium hirsutum)的成熟纤维通常能长到 30-40 毫米长,大约 15 微米的厚度, 占世界棉花产量的 90%以上(Basra and Malik, 1984; Tiwari and Wilkins, 1995),还 有 5-8%有另一个四倍体棉花,海岛棉生产得到(Gossypium barbadense)。

棉花产量主要由两个生物过程决定:纤维细胞的起始,和纤维细胞的伸长。纤 维的起始决定了在每个棉花胚珠上纤维的数量,纤维细胞的伸长则决定了每根纤维 的最终长度和强度。在最活跃的伸长期(开花后 5-20 天时,即 5-20 DPA),陆地 棉纤维细胞以最大为 2 毫米/天的速度快速生长(John and Keller, 1996; Ji et al 2002)。作为世界上最长的植物细胞之一,棉花纤维细胞被公认为是研究细胞伸长 和细胞壁生成的标准系统(Kim and Triplett, 2001)。

细胞伸长和扩展对于高等植物的的生长和形态的建成具有重要意义,当细胞退 出分生组织状态而进行分化时,一般都必须经过伸长和扩展的过程。细胞伸长的程 度取决于细胞的类型,并通常受到环境因素和内源激素的调控。长时间以来,生长 素(IAA),赤霉素(GA),油菜素(BR)被是参与细胞伸长的重要激素 (Phinney, 1984; Evans, 1985; Crozier et al., 2000; Wang and He, 2004)。在体外用 GA 和 BR 处理棉花胚珠,能促进纤维的伸长,而用 BRZ(一种抑制 BR 体内合成 的化合物)处理棉花胚珠则会导致纤维的起始被抑制。Sun et al. (2005)推断 BR 在 纤维起始和伸长都是必需的。不过,这些激素调控棉花纤维伸长的内在机制仍然是 未知的。一些科学家试图改变 IAA 和细胞分裂素合成有关的基因在纤维中的表 达,不过并没有观察到明显的表型变化(John, 1999)。而乙烯,是一种在植物果 实成熟、休眠解除、花器官衰老和脱落过程中已被广泛研究的激素(Bleecker and Kende, 2000; Crozier et al., 2000)。最近的文献报道表明,乙烯也有可能是植物根 毛和下胚轴发育的正调节因子(Raz and Ecker, 1999; Cho and Cosgrove, 2002;

Achard et al., 2003; Seifert et al., 2004; Grauwe et al., 2005)。乙烯反应缺失的植物突 变体,具有很明显的较短的根毛,而外缘施加的乙烯的前体物质 ACC(甲硫胺酸 氨基环丙烷羧酸),能导致根毛伸长并在其他位置产生新的根毛(Tanimoto et al., 1995; Pitts et al., 1998)。

目前,研究者们已经分离了许多在棉花纤维中表达的基因,例如有分别定位与 质膜和胞浆的 ATP 酶,焦磷酸羧化酶,一些主要内在蛋白,微管蛋白等(Smart et al., 1998)。研究者采用了 PCR 选择的 cDNA 减法建立文库的方法,鉴定了 172 个 在纤维中特异表达的基因,多数基因编码与细胞扩展、脂类合成以及细胞壁松弛有 关的蛋白。在所有基因中有 29 个基因在棉花纤维细胞快速伸长的时期表达增高了 50 倍以上(Ji et al., 2003)。其他相关的研究还发现,陆地棉的 ACTIN1 基因,蔗 糖合酶基因,亚洲棉(Gossypium arboreum)的 MYB2 基因,以及一些微管蛋白在 纤维中大量表达,并且可能参与了不同的调控纤维伸长的生物途径(Ji et al., 2002; Li et al., 2002b, 2005; Ruan et al., 2003; Feng et al., 2004; Wang et al., 2004)。在一个 研究项目中,研究者建立了含有 12,227 个亚洲棉 EST 的微阵列,并发现了 80 多个 在细胞次生壁合成时期(开花后 24 天)显著上调的基因(Apart et al., 2004)。

尽管这些分子生物学和基因组学的研究工作揭示了一些棉花纤维分化和扩展的 机制,我们仍然有必要对棉花细胞生长过程中起核心作用的基因做一个系统的、全 面的研究。为寻找到能调控纤维伸长的重要基因,我们从工业上应用最广泛的陆地 棉快速伸长的纤维细胞中分离得到了 12,233 个独立 EST。然后将这些 EST 扩增, 并点制 cDNA 微阵列,以纤维伸长不同时期的胚珠的 RNA 和一种无纤维突变体棉 花的 RNA 为材料,获得了纤维伸长时期的基因组表达谱。我们鉴定了大量的在纤 维伸长时期表达的基因,其中包括有乙烯激素合成的相关基因,并运用生化和生理 学的方法证实了乙烯在纤维发育时期的主导作用。

结果
1.从开花后 5-10 天的棉花纤维 cDNA 文库中获得 12,233 个独立 EST

我们采用开花后 5-10 天的野生型四倍体陆地棉的胚珠(包括纤维)作为起始 材料构建高质量的 cDNA 文库(Lu, 2002)。体外剪切之后,采用随机挑取克隆的 方法,进行了 15×2400 个菌落的测序,获得 29,992 个 EST 序列;将这些序列拼接 之后获得了 12,233 个独立 EST 序列,包括 4,648 个重叠序列(Cluster)和 7,585 个 单条序列(Singleton)。对 12,233 个独立序列进行手工分析,排除同个基因的可 变剪接形式之后,获得了 11,719 条独立 EST,用于随后的 PCR 扩增和建立 DNA 微阵列。

2.鉴定了 778 个在棉花纤维发育过程中高表达的 cDNA

绝大多数的独立 EST 都用 PCR 方法成功扩增(11,719 中成功了 11,692),并 点在氨基硅烷板上,制备用来鉴定纤维特异基因的棉花 cDNA 微阵列。首先,我 们提取了开花当天(0 天),开花后 3 天,5 天,10 天,15 天,20 天的棉花胚珠的 RNA,都与开花后 3 天的样品做比较,来获得纤维发育时期高表达的基因,共 2,522 个。同时,我们提取了一种无纤维陆地棉突变体(fl mutant)开花后 3 天和 10 天的胚珠 RNA,也进行了微阵列杂交。根据实验结果,我们将 2,522 个基因中 同时在无纤维突变体陆地棉胚珠中被诱导表达的基因删除掉,获得了 778 个棉花纤 维特异表达的基因。这 778 个基因在纤维发育时期被诱导表达,但不能在不长纤维 的突变体棉花中被诱导表达,如图 1A 下方所示(参见网络出版物的附表 1)。

我们采用了几个方法来评估本研究中微阵列实验数据的质量。首先,表 1 展现 了平行实验的相关系数,包括评估生物性重复(多次取样)和技术性重复(荧光交 换)的数值。其中,图 1B(上方)显示了其中一对经过荧光交换的样品的各个基 因的表达强度的相关性;同时我们用 Cy3 和 Cy5 同时标记开花后三天野生型陆地

棉的胚珠 RNA 样品进行自我杂交,结果发现微阵列上只有 1 个点偏离超出了 2 倍 线;这都表明本微阵列杂交具有很好的可重复性和精准性(图 1B;表 1)。

由于检测到在纤维伸长的中后期(开花 10 天或以后),微阵列上的基因的表 达谱具有较大的偏向性(例如图 1C),因此我们采用了线性归一化的策略来使原 始数据均一化(van de Peppel et al., 2003),代替通常情况下的 LOWESS 归一化方 法(Yang et al., 2002)。通过检测 40 个棉花内标看家基因的表达数据(见网络出 版物,附表 2),我们证明了线性归一化方法是非常可靠的。

3.鉴定了在纤维发育过程中显著上调的生化途径

所有点在 cDNA 微阵列上的基因都用 KOBAS 软件(KEGG Orthology Based Annotation System)(Mao et al., 2005)进行了分析以确定它们属于哪一类生化途 径。KOBAS 软件分析的结果将微阵列上全部 11,692 个基因中的 2,914 个定位于 168 个代谢途径,将 778 个棉花纤维特异表达的基因中的 162 个定位于 102 个代谢 途径。根据超几何分布的统计分析结果,其中有 12 个代谢途径被发现在棉花纤维 中显著上调(P<0.05)。经过 FDR 校正之后还有 5 个代谢途径的 P 值小于 0.05, 属于纤维中高表达的代谢途径(表 2)。乙烯合成途径中的全部 5 个基因有 3 个在 棉花纤维中特异表达,并且根据 P 值(0.0295)来看,乙烯代谢途径是最可能在棉 花纤维中特异表达的代谢途径。其他代谢途径,例如细胞骨架组成、脂肪酸合成及 延长途径的 P 值也小于 0.05。BR 合成途径的 P 值为 0.0629,在所有代谢途径中排 名第 12 位(表 2)。

4.鉴定了植物激素合成相关基因的表达谱

用 KOBAS 软件发现了乙烯和 BR 合成途径可能在纤维伸长过程中具有重要作 用,我们将乙烯,BR 合成途径中的所有基因的 cDNA 序列都克隆得到;此外还克 隆了赤霉素(GA)和生长素(IAA)合成途径中所有基因的 cDNA 序列。在所有

的 18 条 cDNA 中有 11 条包含了完整的读码框,并且根据 GenBank 中同源基因的 注释来命名。大多数基因都在其他植物中具有 60-70% Identity 的同源基因,并且具 有保守的蛋白功能结构域(见网络初版物,附表 3)。

经过对微阵列数据的分析,我们发现乙烯合成途径中的 ACO1-3 基因和 BR 合 成途径中的 SMT1 和 DET2 基因,在纤维伸长期的表达水平被显著上调,同时在无 纤维突变体胚珠中的表达水平很低(MAANOVA 方法,P<0.001;结果见表 3)。 相比之下,ACS6 基因,GA 合成途径中的 GA20ox1、GA20ox2、GA3ox1 基因则 在无纤维突变体中的表达水平反而更高,因此不被看作是纤维伸长相关的基因(表 3)。各激素代谢途径中的其他基因的表达则没有显著变化(图 2、表 3)。

ACO1-3、SMT1 和 DET2 基因的表达水平则进一步用实时 RT-PCR 的方法进 行定量(图 2A 和 2B,下方所示)。ACO1 和 ACO2 基因的转录本水平在 15 DPA (开花后 15 天)左右达到峰值,分别是 3 DPA 时期(纤维伸长早期)表达水平的 18 倍和 13 倍。ACO3 的表达谱也有类似的变化,但是在 10DPA 左右达到最高(图 2A 下方)。与相比,SMT1 和 DET2 的表达水平在 15DPA 和 10 DPA 达到最高, 分别为 3 DPA 时期的 6 倍和 3 倍(图 2B 下方)。执行 GA 或 IAA 合成功能的基因 的表达水平则没有显著变化(图 2C 和 2D)。

为证实 ACO 基因的表达具有纤维特异性,我们从胚珠上小心分离了纤维细 胞,提取 RNA 并进行实时 RT-PCR 定量分析。结果显示 ACO1、ACO2 和 ACO3 基因在纤维细胞中的表达比去处纤维细胞的胚珠组织中的表达水平分别高出 48.2、 357.1 和 33.1 倍(图 3A)。令人感兴趣的是,除去纤维细胞的胚珠组织中 ACO1-3 基因的表达水平与无纤维突变体胚珠组织中非常接近(图 3A)。ACO1 和 ACO3 基因在伸长期的纤维细胞中表达最高在根、茎、叶组织中也有少量表达;而 ACO2 只在纤维细胞中检测到有表达(图 3A)。

5.三个 ACO 基因都编码具有功能的酶

为证实 ACO1-3 基因是否编码具有真正功能的乙烯合成酶,我们将其全长读码 框克隆进入带有可诱导启动子的载体,并转入酵母细胞(Hamilton et al., 1991)。 加入底物 ACC 和各种辅助因子并有半乳糖诱导 ACO 基因的表达,我们发现带有 ACO 基因的酵母细胞能够产生大量乙烯气体(图 3B),而没有导入 ACO 基因的 酵母细胞则检测不到乙烯的存在,含有 ACO 基因但没有用半乳糖诱导的酵母细胞 也不能产生乙烯(图 3B)。ACO2 在酵母细胞中表现出较强的酶活性,而 ACO1 和 ACO3 的酶活性相对低一些(图 3B)。随后的 Western 杂交显示,ACO 基因蛋 白酶活性的不同可能因为各基因被诱导表达的水平之间存在差异(数据未显示)。

6.带有纤维的棉花胚珠能释放更高含量的乙烯气体

我们随后测定了不同组织中释放的乙烯含量,以确认 ACO 基因的表达是否能 促进乙烯气体的合成。我们在野生型陆地棉胚珠体外培养 12 天的密闭瓶中检测到 了 4.11± 0.36 nL× -1× -1FW 的乙烯含量。在无纤维突变体棉花胚珠的培养瓶中仅 h g 仅能检测到 0.19± 0.02 nL× -1× -1FW 的乙烯含量,在用乙烯合成的抑制剂 AVG 处 h g 理的野生型胚珠的培养瓶中也仅能检测到 0.67± 0.06 nL× -1× -1FW 的乙烯(图 h g 3C)。无论是野生型或是无纤维突变体棉花的幼苗在培养同样的时间内都不能产 生足以被检测到的乙烯气体(图 3C)。这些结果清楚地表明,伸长期的纤维细胞 能够合成相当多数量的乙烯气体。

7.乙烯能促进棉花纤维的伸长

在棉花纤维伸长期 ACO 基因的大量表达,以及产生的大量乙烯气体,都表明 乙烯可能参与调控了纤维细胞的伸长。我们采用乙烯气体处理体外培养的野生型陆 地棉胚珠,共处理 6 天时间,结果发现纤维细胞的长度与施加的乙烯气体的含量有 关(图 4A 和 4B)。用 0.1uM 乙烯气体处理,纤维细胞长度是不加乙烯的对照组 的 3 倍(3.6± mmVS 1.2± mm)。与之对应的是,用乙烯合成抑制剂 AVG 处 0.4 0.1

理胚珠则会显著抑制纤维的伸长。当培养基中加入 1uM 或 5uM 的 AVG,在培养 12 天之后几乎观察不到纤维细胞的存在(培养 12 天的野生型纤维长度约为 8.5mm,如图 4D 和 4E)。加入乙烯或 AVG 并不影响胚珠的大小(图 4C 和 4F),暗示乙烯可能是特异促进纤维细胞伸长的重要因子。

8.棉花纤维生长过程中乙烯和油菜素(BR)的相互作用

BR 合成基因(例如 DET2 和 SMT1 基因)在纤维伸长期的高水平表达(图 2B),暗示 BR 可能参与了纤维伸长的过程。BR 处理会诱导纤维细胞少量的伸长 (图 5A 和图 5B),而 BRZ 处理则会减少纤维细胞的长度(图 5D 和 5E)。BR 和 BRZ 处理分别能使棉花胚珠显著地变大或减小(图 5C 和 5F),这与 BR 作为 一个重要的促进生长的植物激素的角色相一致。AVG 或 BRZ 对于纤维细胞伸长的 抑制作用,可以分别通过在相同的培养瓶中添加乙烯和 BR 而消除(图 6A),证 实 AVG 或 BRZ 对纤维细胞伸长的抑制,只是通过对激素合成的抑制而导致的。

当乙烯和 BR 都被加到组培液中时,并不能使纤维细胞比单纯只添加乙烯的处 理组变得更长(图 6A)。这两种激素对于纤维细胞伸长的促进作用,并不能被各 自的抑制剂所消除(图 6A)。乙烯比 BR 具有更强的促进作用,0.1uM 的乙烯的 促进效果已经超过了 1.0uM 的 BR 的促进效果。同样的,BRZ 对纤维细胞伸长的 抑制作用,可以通过加入乙烯气体而大为减弱,而 BR 则不能恢复 AVG 对于纤维 细胞伸长的抑制作用(图 6A)。BR 在调控胚珠细胞的扩展方面具有的能力,如 图 6B 所示。

我们还通过 RT-PCR 分析来研究了 BR 对乙烯合成酶基因表达的影响,以及乙 烯对 BR 合成酶基因的影响。BR 处理野生型陆地棉胚珠 24 小时后,能诱导 ACS6 基因的表达,这与以前在豌豆中报道的结果一致(Yi et al., 1999),但是并不能明 显影响三个 ACO 基因的表达(图 6C)。用乙烯处理则能诱导 DEM1 和 DDWF1

基因的表达,但对于 BR 途径中更为重要的 SMT1 和 DET2 基因则没有太大影响。 这些结果表明,乙烯和 BR 能够相互促进各自与合成有关的基因的表达。

9.乙烯可能通过激活细胞壁合成、细胞壁松弛或细胞骨架重排的重要基因来促进纤 维伸长

后续的 RT-PCR 分析,证实了有一个蔗糖合酶基因(SuSy),一个微管蛋白基因 (TUB1),以及两个扩展素基因(EXP1 和 EXP2),在野生型陆地棉胚珠中的含 量比无纤维突变体中要高出许多(Figure 7)。用 5uM 的乙烯气体处理野生型的胚 珠,会导致这些基因的大量表达,与此同时在无纤维突变体中则观察不到相似的现 象。用 AVG 处理则会导致这些基因的表达下降到与无纤维突变体中类似的水平。

讨论
在本项研究中,我们基于基因组学、遗传学、分子生物学和生理学的方法,发 现了植物激素乙烯在棉花纤维发育过程中具有主导作用;我们还点制了棉花 cDNA 微阵列,采用不同发育阶段的野生陆地棉和无纤维陆地棉突变体胚珠材料,用来筛 选棉花纤维特异表达的基因。本研究将获得的纤维特异基因定位与不同的生化途 径,在 15 个纤维上调的生化途径中,乙烯合成途径排名第一(表 2)。随后的分 析表明 ACO1-ACO3 基因在纤维伸长期被诱导大量表达,开花后 10-15 天达到峰 值,并在开花 20 天后的成熟期迅速下降(参见附表 1,可在线查询)。而这三个 基因都没有发现在开花后 3 天或 10 天的无纤维突变体中被诱导表达(附表 1)。

我们还测定到,体外培养的野生型陆地棉胚珠,比无纤维突变体和用乙烯合成 抑制剂 AVG 处理的野生型对照组释放出高出很多倍的乙烯气体(图 3C),这与 乙烯合成酶 ACO 基因表达谱的结果相一致。此外,用乙烯处理野生型棉花胚珠能 显著促进纤维细胞的伸长,而用 AVG 处理则会特异地抑制纤维细胞生长(图 4)。这些结果都表明乙烯是促进棉花纤维伸长的正调控因子。

本研究从建立陆地棉开花后 5-10 天的 cDNA 文库开始,构建了还有 11,692 个 基因的棉花 cDNA 微阵列,是世界上目前最为全面的四倍体陆地棉微阵列。在我 们用微阵列发现的棉花纤维特异基因中,还有一些是曾经报道过的(Smart et al., 1998; Li et al., 2002a; Ji et al., 2003),证实了该微阵列方法的有效性(所有纤维特 异基因见附表 1)。Apart 等研究者曾于 2004 年用 cDNA 微阵列研究了亚洲棉 (Gossypium arboreum)在次生壁加厚时期转录组图谱变化,但未能根据微阵列结 果,揭示在纤维发育过程的重要影响因素(Apart et al., 2004)。

油菜素(BR)是植物中促进细胞伸长的重要激素之一。在本研究中我们在检 测到了 BR 合成有关的基因,例如 SMT1 和 DET2,在棉花纤维快速伸长的时期被 诱导表达。但接下来的实验中 BR 并不能如乙烯那样明显地促进纤维细胞的生长,

相反,BR 和 BR 的抑制剂 BRZ 能明显促进和抑制胚珠细胞的增大。同时,乙烯和 AVG 都只是特异地促进和抑制纤维细胞的伸长。在研究乙烯和 BR 相互作用的实 验中,我们发现乙烯能促进 BR 合成途径中 DEM1 和 DDWF1 基因的表达,BR 则 能促进乙烯合成途径中 ACS6 基因的表达。因此,乙烯和胚珠激素可能分别对纤维 和胚珠的伸长和生长具有主要影响,同时也彼此促进对方的合成,构成了棉花纤维 细胞极速伸长的主要原因。在本研究之前,Grauwe 等人于 2005 年报道了乙烯能促 进 BR 合成相关基因 CPD 的表达,Yi 等人在 1999 年报道了 BR 能促进豌豆中 ACS 家族基因的表达,可以作为本文结论的辅助证据。

本研究还发现,乙烯能够诱导蔗糖合酶(SuSy)、微管蛋白(TUB1)和扩展 素蛋白(EXPs)的表达(图 7)。这些基因都被发现是在纤维中特异表达,因此 乙烯可能通过增加细胞壁合成(SuSy)、细胞骨架合成(TUB1)和细胞壁松弛反 应(EXPs)等途径来促进纤维细胞的伸长。

综上所述,通过微阵列和生理生化实验,我们证实了乙烯激素在棉花纤维发育过程 中的主导作用。在棉花纤维细胞中研究乙烯和 BR 的相互作用,为揭示植物激素如 何调控细胞伸长的提供了很好的研究系统。

材料和方法
1.植物材料

徐州 142-陆地棉品种及其无纤维突变体(fl mutant,Zhang and Pan, 1992) 品种在温室中培养,在不同生长时期收取棉花胚珠。用于 RNA 的提取。对于体外 胚珠培养实验,我们采用开花后 1 天的新鲜胚珠;对于建 cDNA 库和微阵列杂 交,我们将不同时期的棉花胚珠摘下,剥开后迅速立刻存放于液氮中。

2.RNA 纯化、建立 cDNA 文库及测序

我们采用热硼酸方法从 1 克的起始材料(开花后 5-10 天的野生型陆地棉胚 珠)中提取总 RNA(Lu, 2002)。采用 Stratagene 公司的 cDNA Synthesis Kit,我 们合成了 cDNA 并将其克隆进入 ZAP Express Vector 的 EcoR I/Xho I 酶切位点,并 采用 ZAP-cDNA Gigapack Gold III Cloning Kit 进行噬菌体包装反应。经过体外剪 切,获得了含有平均长度为 1.6-1.7 Kb cDNA 的克隆菌落。

3.EST 序列拼接和分析

本研究共随机挑选了 36,000 个克隆,并进行 5’单向测序。在去除了载体、小 于 300bp 的短片段、和不精确碱基数超过 1.5%的序列之后,所有的 EST 序列采用 Stackpack 2.1 版本的软件进行了拼接以获得独立 EST 序列(Christoffels et al., 2001),并手工分析了可变剪切子的序列。所有的独立 EST 序列都进行了 BLASTX 的比对分析(http: //www.ncbi.nih.gov/blast/),并获得相应的注释。不存 在 e 值小于 10-2 同源序列的 EST 被注释为未知序列。

4.棉花纤维 cDNA 微阵列的构建

我们采用 96 孔的 Perkin-Elmer 9600 thermocycler 对 11,719 个含有独立 EST 的 质粒载体进行 PCR 扩增反应。采用引物为 M13 forward primer: 5’-CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGG TAAC-3’, M13 reverse primer: 5’-GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC-3’;反应体系为 50-?L,包括 1× PCR buffer (中国 大连 TaKaRa 公司), 2.0 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs,10 pmol primers, 5 U Taq polymerase, 和 10 ng 质粒模板。PCR 反应程序为:95° 3 分钟,然后 35 个循环 C ( 95° 1 分钟, 55° 20 秒, 72° 90 秒),最后在 72° 保温 5 分钟。取出 1 ?L C C C C PCR 反应产物,进行 1% 琼脂糖凝胶电泳证实扩增是否成功。余下的产物用乙醇沉 淀并重旋于 DMSO 中,准备点制微阵列。

我们选用了与 GenBank 中所有基因完全没有同源性的酵母基因组上的 8 条基 因间序列用作外标基因(External Control)。这些序列用 PCR 扩增后克隆进入 pSP64Poly(A)载体(来自美国 Promega 公司),随后进行体外转录产生 poly(A) -RNA。每个外标基因都在微阵列上重复点样 12 次。

5.DNA 荧光标记及杂交

我们采用 Eberwine 线性扩增及后续酶反应的方法进行 cDNA 标记实验。具体 来讲,每个待杂交样品选取 10ug 总 RNA,采用 TaKaRa 的 cDNA 合成系统合成双 链 cDNA,但不同的是采用 T7 oligo(dT) primer(序列为 5’- AAACG ACGGC CAGTG AATTG TAATA CGACT CACTA TAGGC GC TT TTT TTT TTT TTT TTT 3’)代替原来系统中的 poly-T primer。

完成双链 cDNA 合成反应之后,采用 Qiagen 公司的 PCR purification kit 纯化产 物并用 60uL 的 elution buffer 洗脱。取一半的洗脱产物,真空浓缩至 8ul,最后加 入到 20ul 总体积的体外转录反应液中,在 37° 温育 3 小时(采用美国 Promega 公 C 司的 T7 RiboMAX Express large scale RNA production system)。扩增后的 RNA 采 用 Qiagen 公司的 RNeasy mini kit 进行纯化回收。随后我们采用了 Klenow enzyme

labeling 的策略。具体步骤是,将 2ug 扩增后的 RNA 与 2ug random hexamers 混 合,70° 变性 5 分钟,冰上冷却;然后加入 4uL first stand buffer,2uL 0.1uM C DTT,1 uL 10mM dNTP,和 1.5uL SuperScript II(Invitrogen)。混合物在 25° 温 C 育 10 分钟,然后放入 42° 温育 60 分钟,该产物随后用 Qiagen 公司的 PCR C purification kit 纯化并真空浓缩为 10uL。cDNA 产物与 2ug random nanomer 混合, 95° 加热 3 分钟,并在冰上迅速冷却。随后加入各种反应成分使最终反应中含有 C 120 uM dATP,120 uM dGTP,120 uM dTTP,60 uM dCTP,和 40 uM Cy-dye (Amersham Pharmacia Biotech)。加入 1uL Klenow enzyme,在 37° 反应 60 分 C 钟。标记后的 cDNA 用 Qiagen PCR purification kit 纯化并洗脱。标记的外标基因和 待杂交样品的 RNA 的浓度根据 Cy-dye 的整合效率进行调整。将 DNA 在 95° 变 C 性 3 分钟后上样,进行杂交。在 42° 进行杂交反应,过夜;在室温下用两种溶液 C 连续(0.2% SDS, 2? SSC 42° 5 分钟;0.2? SSC 5 分钟)清洗微阵列。 C

6.微阵列图像扫描及数据处理

所有的微阵列杂交结果都用 Packard bioscience 公司的 ScanArray Express scanner 扫描,并用 ScanArray 2.0 软件获得图像结果。我们采用 Axon Instruments 公司的 GenePix Pro 4.0 软件从 16-bit 的 TIFF 图像中获得每个基因点的信号强度 值。每个时期的样品我们都重复采样 3 次作为生物性重复,每次的样品都经过荧光 交换作为技术性重复,因此微阵列上的每个基因(EST)共获得 6 次重复的表达数 据。我们采用线性归一化方法对所有基因的信号强度进行均一化,并将均一化的数 据导入 R 环境下的 MAANOVA 软件做多因素检验分析(采用 mixed effects ANOVA model,参见 Wu et al., 2003)。在 F-test 中,只有 P 值经 FDR 校正之后仍 然<0.001 的基因才被选为差异表达基因。随后,对于获得的纤维特异表达基因, 我们进行了聚类分析并用 Treeview 软件显示(Eisen et al., 1998)。

7.用 KOBAS 软件搜寻棉花纤维特异的代谢途径

我们应用了 KOBAS 软件(Mao et al., 2005)鉴定了棉花纤维法语中的生化代 谢途径,并计算了每一条代谢途径的统计学数据。KOBAS 软件可以将一组基因根 据基因同源性定位于 KEGG 数据中已知的代谢途径中去(本研究中采用的参数是 e value<1e-5,rank<10,sequence identity>30%)。为保证准确性,我们手工分析了 所有的代谢途径。KOBAS 软件可以通过计算某一条代谢途径中是否比整个转录组 中含有更高比例的纤维特异基因,从而得出这条代谢途径在纤维中特异表达的可能 性。每条代谢途径都有一个 KOBAS 软件计算的 P 值,用于检验下面的假说: H0: p0 ? p1 H1: p0 ? p1 . 其中 p 0 ?
n m , p1 ? , m 代表某条代谢途径中的纤维特异基因数量,M 代表整个 M N

微阵列上定位于这条代谢途径中的数量,n 代表定位于所有代谢途径中含有的纤维 特异表达基因数量的总和,N 代表微阵列上定位于所有代谢途径中的基因数量的总 和。每条代谢途径的 P 值对于该途径的超几何分布统计量:

m

1

p= 1
i= 0

M i

N

M n i
.

N n

由于结果中有大量的代谢途径,因此我们引入了 R 环境下的 GeneTS(2.8.0),采 用 FDR 校正来纠正第一类错误的比例 (Storey, 2002; Wichert et al., 2004)。P 值小于 0.05 的代谢途径被认为是统计学显著的纤维特异表达的代谢途径。

8.RT-PCR 及实时 RT-PCR 分析

本研究采用美国 Invitrogen 公司的 SuperScript first-strand synthesis system 合成 RT-PCR 或实时 RT-PCR 所需的 cDNA 模板。基因特异性引物由上海 Bioasia 公司 合成,具体序列见附表 3。陆地棉 UBQ7 基因用作内标基因,并使各样品的模板均

一化。我们采用 MJ Research 公司的 DNA engine opticon continuous fluorescence detection system 及其 SYBR Green PCR kit 进行实时 RT-PCR 反应(参见 Qin et al., 2005)。实时定量 RT-PCR 过程设定如下:95° 10 分钟;94° 10 秒,退火 20 C C 秒,20-30 秒 72° 延伸,循环 42 次;在 78-80° 收集荧光并读取数据。在最后一 C C 次 72° 延伸时,将会生成一条溶解曲线(从 65-95° C C,每秒上升 0.2° C)以检验是 否是单一扩增产物。

本研究对 ACO1-3、SMT1、和 DET2 基因进行实时定量 RT-PCR 分析时,样 品分别来自不同发育时期的(开花后 0-20 天)的野生型陆地棉胚珠(带有纤维细 胞)以及无纤维突变体陆地棉胚珠,以及野生型陆地棉的根、茎、叶等。

9.棉花胚珠体外培养及各种激素的处理方法

新鲜的棉花胚珠在开花后 1 天被摘下,在 70%乙醇中浸泡 1 分钟,去离子水 中漂洗后,再浸泡于含有 0.05% Tween-80 的 0.1% HgCl 溶液中达 20 分钟,达到除 菌的目的。按照 1973 年 Beasley 和 Ting 发表的培养方法,棉花胚珠按照相同的培 养基成分在无菌条件下培养。具体培养基成分见原始文献中的表 1,除了用 120 mM D-glucose 替换原有的 100 mM D-glucose 和 20 mM D-fructose (Beasley and Ting, 1974)。在培养基中可以按照需要的最终浓度加入各种植物激素,以及抑制剂化合 物。乙烯处理棉花胚珠则是将 50mL 的小培养瓶放入 2L 的玻璃容器中,注射入乙 烯气体使其达到所需浓度,然后密封培养,但保持小培养瓶的通气性以保证气体的 有效交换。在培养基中不含 GA 或 IAA。测量纤维长度时,将培养的胚珠在水中漂 洗,然后在 100° 加热 10 分钟,冷却到室温后,放入 45% 的乙酸中处理。在显微 C 镜明视场下将棉花纤维细胞梳开后,测量其长度。气体乙烯(99.9%) 购买自 Qianxi Chemicals 公司(中国北京)。 BR (brassinolide) 和 AVG (L-(2-aminoethoxyvinyl)glycine) 购买自 Sigma 公司 (美国 St. Louis, MO), BRZ (brassinazole) 则是受赠于 T. Asami 教授 (Asami et al., 2000)。

10.构建酵母表达载体并测定 ACO 基因酶活性

ACO1-3 的完整读码框用以下引物进行 PCR 扩增得到:ACO1, 5’CACCACAAAATGGAGCTCACTTTCCCTGTAATC-3’ (forward, F), 5’AACAGTTGCAATAGGACCCAAGTT-3’ (reverse, R); ACO2, 5’CACCACAAAATGGAGGTAGCTTTCCCTGTTATT-3’ (F), 5’AACAGTTGCAATAGGACCCAAGCT-3’ (R); ACO3, 5’CACCACAAAATGGCTACTTTCCCAGTGATCAAC-3’ (F), 5’AGCTGTTGCAATGGGAGCAGTAGC-3’ (R)。PCR 产物采用 QIAquick Gel Extraction kit 纯化,并克隆进入 pENTR/D/TOPO 载体 (美国 Invitrogen 公司) 构建 成 pENTR-ACO1-3 中间载体(经 M13 primer 测序验证)。随后,将 pENTRACO1-3 与 pYTV 载体进行 Gateway LR ClonaseTM Enzyme Mix 反应 (Invitrogen),获得酵母表达载体。未转化的酵母细胞 (strain PEP4),或转入空 pYTV 载体的酵母细胞,以及转化了 pYTV-ACO1-3 表达载体的酵母细胞在完全培 养基和不含 uracil 的培养基中,以 30° C、250 rpm 振荡培养。在最开始培养的 24 小时内以 2%的 Glucose 为能量来源和碳源,当 Glucose 消耗殆尽时,后 16 小时 补充进 Raffinose 代替 Glucose。当菌液的 OD600 达到 0.8 时,立刻加入最终浓度 为 2% 的 galactose 激活 GAL1 启动子并继续培养 4 个小时。取出每份大约含 106 细胞的酵母菌液 cells)用来转化不同起始浓度的 ACC 生成乙烯,在反应液中还应 包括 50 mM ascorbate, 200 ?M FeSO4 作为辅助因子。反应菌液在 15 cm? 1.5 cm 的 PE 塑料膜密封的试管中于 30° 振荡培养 1 小时。诱导 ACO 表达而产生的 C 乙烯气体用气象色谱仪测定(详细见后),减去未诱导的酵母反应液产生的乙烯数 量就得出 ACO 酶催化生成的乙烯数量。

取出 0.2 mL 表达 ACO1, ACO2, 和 ACO3 蛋白的酵母细胞,提取总蛋白,于 12%的 SDS-PAGE 中电泳跑胶并转膜。重组的 ACO1-3 蛋白用抗多聚组氨酸的单 克隆抗体检测(美国 R&D System 公司),并用偶联辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase)的抗鼠 IgG 进行显色反应(美国 Promega 公司)。

11.乙烯气体含量的分析

本研究使用气象色谱的方法对植物中释放的乙烯气体进行定量分析(气相色谱 仪:GC-14, Shimadzu;色谱柱:30-m HP-PLOT column, Agilent Technologies)。 在每一个 50mL 的培养瓶中我们加入约 20 个新鲜的开花后一天的陆地棉野生型或 无纤维突变体的胚珠,在黑暗中 30° 培养 12 天(各种激素或抑制剂化合物先溶于 C 小体积的乙醇,再稀释到最终的浓度)。为测量营养组织中释放的乙烯气体,野生 型和突变体陆地棉幼苗被种植于固体培养基中,并密封在不透气的大透明玻璃瓶 中,在自然生长条件下,同样培养 12 天(到大约 15cm 高,重 3g 左右)。我们从 每个培养瓶中抽取 100 ?L 的顶部气体,注射进入气象色谱仪中进行分析,每个样 品都进行三次重复实验。浓度为 0.1, 1, 10 和 50 ppm 的标准乙烯气体用来制作定量 曲线,并确定乙烯气体的准确保留时间。每个培养瓶中测定的乙烯含量都要减去培 养 1 天时释放的乙烯含量,以排除摘胚珠时可能产生的损伤性内源乙烯。本气象色 谱系统的检测低限为 0.01 ppm。

12.文中引用基因及其它数据的 GenBank 检索号

所有的 11,692 个独立 EST 的 GenBank 检索号为 DR452281-DR463972。所有 的微阵列数据都已经递交美国国家生物信息中心的基因表达数据库(National Center for Biotechnology Information GEO database) ,检索号为 GPL2610; GSE2901; GSM63341-GSM63346, GSM63365-GSM63379, GSM63391-GSM63420。 其它本文中出现过的基因的检索号如下:UBQ7, DQ116441; ACS6, DQ122174; ACO1, DQ116442; ACO2, DQ116443; ACO3, DQ116444; ACO4, DQ122175; SMT1, DQ116445; DET2, DQ116446; DDWF1, DQ122176; DEM1, DQ122177; DWARF1, DQ122178; DWF5, DQ122179; GA20ox1, DQ122181; GA20ox2, DQ122188; GA3ox1, DQ122182; GA3ox2 DQ122183; NIT, DQ122184; FMO1, DQ122185; TDC, DQ122187; Susy, U73588; TUB1, AF521240; EXP1, AY189969; EXP2, DQ204496.

13.附表

附表 1. 778 个纤维特异表达的陆地棉独立 EST 的表达谱及注释信息 附表 2. 40 个陆地棉内标看家基因的表达谱及注释信息 附表 3. 微阵列上包含的各植物激素合成途径中的主要基因的信息 附表 4. RT-PCR 及实时 RT-PCR 的基因特异引物

本文于 2005 年 12 月 12 日投递,经审稿并修改后 2006 年 1 月 12 日重新送审, 2006 年 1 月 18 日接收。2006 年 3 月正式出版。

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图1. 棉花纤维特异基因的表达谱聚类分析以及微阵列质量检验。 (A)上方为至少在纤维发育的某一个时期上调(开花后3天、5天、10天、15天或 20天)的所有2,522个陆地棉基因的聚类分析。下方为用无纤维突变体为对照最终

筛选出的778个陆地棉基因的表达谱聚类分析。红色表示比值大于1,绿色表示比值 小于1,比值等于用黑色表示。 (B)上图为开花后10天与开花后3天的样品进行一次荧光交换之后所得数据的比 较;下图则为开花后3天的样品分别用Cy5和Cy3标记后进行自我杂交后得到数据的 比较。 (C)开花后10天与开花后3天的陆地棉胚珠样品的杂交结果,显示有绝大部分基 因的表达水平在开花后10天的样品中更高。

图2.微阵列上所包含的主要激素合成途径中的所有基因的表达谱。 (A)(B)(C)(D)分别代表乙烯、油菜素(BR)、赤霉素(GA)、生长素 (IAA)中每个基因的每个表达数据都来自与6次重复杂交的平均值。各缩写的基 因符号代表:ACS6, ACC synthase 6; ACO, ACC oxidase; SMT1, 24-sterol Cmethyltransferase; DEM1, steroid demethylase; DWF5, sterol delta7 reductase; DWARF1, C-24 sterol reductase; DET2, steroid 5-alpha-reductase; DDWF1, putative cytochrome P450 gene catalyzing typhasterol to castasterone; GA20ox, GA 20-oxidase; GA3ox, GA 3-hydroxylase; NIT, nitrilase; FMO1, flavincontaining monooxygenase; TDC, tryptophan decarboxylase.

图 3. ACO1-3 基因的组织特异性表达谱、酶活性分析以及各种棉花组织产生乙烯 含量的分析。

(A) 实时定量 RT-PCR 结果显示,ACO1-3 基因在伸长期的棉花纤维中特异表达。 F 代表纯纤维组织;F+O 代表含有纤维的棉花胚珠组织;O 代表除去纤维的棉花 胚珠组织;wt 和 fl 分别代表野生型陆地棉和无纤维突变体陆地棉。 (B) ACO1-3 的酶活性鉴定结果。实心的标志为经 Glactose 诱导后 ACO1-3 蛋白分 别产生的乙烯含量,空心标志为未经诱导时产生的乙烯含量。 (C) 野生型陆地棉胚珠比其他各组样品都能产生更多的乙烯。所有的样品都培养了 12 天。WT 代表野生陆地棉胚珠;fl 代表无纤维突变体胚珠;AVG 表示在野生陆 地棉胚珠的培养液中加入最终浓度为 1.0 uM 的 AVG。野生型和无纤维突变体陆地 棉的营养组织(seedling)只能产生痕量的乙烯气体。

图 4. . 外源施加的乙烯和 AVG 能够促进或抑制纤维细胞的伸长。 (A) 不同浓度的外源乙烯处理野生型陆地棉胚珠,培养 7 天后胚珠及纤维的表型。 (B) 不同浓度的外源乙烯处理野生型陆地棉胚珠,培养 6 天结束时的纤维长度。 (C) 不同浓度的外源乙烯处理野生型陆地棉胚珠,培养 6 天结束时的胚珠体积。 (D) 不同浓度的 AVG 处理野生型陆地棉胚珠,培养 13 天后的胚珠及纤维的表型。 (E) 不同浓度的 AVG 处理野生型陆地棉胚珠,培养 12 天结束时的纤维长度。 (F) 不同浓度的AVG处理野生型陆地棉胚珠,培养12天结束时的胚珠表型。 CK代表不加任何处理的野生型陆地棉,体外培养同样的天数。(A)(D)中的标 尺分别代表2.5 mm和5.0 mm。

图 5. . 外源施加的 BR 和 BRZ 对纤维细胞伸长的影响。 (A) 不同浓度的 BR 处理野生型陆地棉胚珠,培养 7 天后胚珠及纤维的表型。 (B) 不同浓度的 BR 处理野生型陆地棉胚珠,培养 6 天结束时的纤维长度。 (C) 不同浓度的 BR 处理野生型陆地棉胚珠,培养 6 天结束时的胚珠体积。 (D) 不同浓度的 BRZ 处理野生型陆地棉胚珠,培养 13 天后的胚珠及纤维的表型。 (E) 不同浓度的 BRZ 处理野生型陆地棉胚珠,培养 12 天结束时的纤维长度。 (F) 不同浓度的BRZ处理野生型陆地棉胚珠,培养12天结束时的胚珠表型。 CK代表不加任何处理的野生型陆地棉,体外培养同样的天数。(A)(D)中的标 尺分别代表2.5 mm和5.0 mm。

图 6. 在纤维伸长、胚珠增大和基因表达方面乙烯和 BR 的相互作用。 (A) 乙烯、BR 及其各自抑制剂分别处理或组合处理野生型陆地面胚珠,体外培养 6 天结束时纤维的长度。CK 表示不加任何处理的对照样品;乙烯处理浓度为 0.1uM;AVG、BR、BRZ 都为 1.0 uM。 (B) 乙烯、BR 及其各自抑制剂分别处理或组合处理野生型陆地面胚珠,体外培养 6 天结束时胚珠的体积。CK 表示不加任何处理的对照样品;乙烯处理浓度为 0.1uM;AVG、BR、BRZ 都为 1.0 uM。 (C) 乙烯对 BR 合成基因表达水平的影响。 (D) BR 对乙烯合成基因表达水平的影响。(C 和 (D)中的 RNA 都来自用 5 uM 乙烯 或 BR 处理的胚珠样品。UBQ7 基因作为内标。加黑的基因表示受到激素的正调 控。

图7. 几个调控纤维伸长的下游基因对乙烯、AVG处理的反应。总RNA来自野生型 陆地棉(WT)和无纤维陆地棉突变体(fl),用乙烯(5 uM)或AVG(1 uM)处 理并培养3天后的胚珠组织。

表1. 来自不同组织样品的微阵列实验数据之间的相关系数
生物性重复实验之间的相关系数 微阵列样品 +3wt/0wt +3wt/+3wt +3wt/+3fl +5wt/+3wt +10wt/+3wt +15wt/+3wt +20wt/+3wt +10wt/+10fl (1,2) 0.924 0.982 0.925 0.933 0.912 0.966 0.965 0.963 (2,3) 0.928 0.989 0.918 0.926 0.932 0.964 0.945 0.951 (1,3) 0.938 0.933 0.931 0.917 0.924 0.951 0.966 0.952 技术性重复实验之间的相关系数 (1,1' ) 0.968 0.959 0.96 0.962 0.963 0.976 0.963 0.965 (2,2' ) 0.966 0.965 0.94 0.946 0.945 0.964 0.945 0.956 (3,3' ) 0.957 0.956 0.925 0.937 0.948 0.977 0.954 0.937

表 2. KOBAS 软件鉴定的代表性纤维特异表达的代谢途径
微阵列上所 纤维特异表 包括的基因 达基因的数 KEGG 代谢途径 Total (总和)
a

FDR 校正后的 P值 / P值 /

数量 2914

量 162

Ethylene biosysthesis (乙烯合成) Gamma-hexachlorocyclohexane degradation Cytoskeleton Fatty acid biosynthsis and elongation Glycosaminoglycan degradation Stilbene, coumarine and lignin biosynthesis Ascorbate and aldarate metabolism DDT degradation Fluorene degradation Androgen and estrogen metabolism N-Glycan degradation Brassinosteroid biosynthesis (油菜素合成) Atrazine degradation Pentose and glucuronate interconversions Glycerolipid metabolism ABC transporters, eukaryotic Fructose and mannose metabolism Riboflavin metabolism Glycosphingolipid metabolism Terpenoidbiosynthesis Bile acid biosynthesis Benzoate degradation via hydroxylation Cell division …… Auxin biosynthesis (生长素合成) Gibberellin biosynthesis (赤霉素合成) RNA polymerase Replication, recombination and repair factors

5 49 75 64 16 73 63 12 42 5 23 6 1 28 65 8 58 10 33 11 23 12 12

3 8 10 9 4 9 8 3 6 2 4 2 1 4 7 2 6 2 4 2 3 2 2

0.0016 0.0049 0.0077 0.0080 0.0099 0.0183 0.0217 0.0256 0.0267 0.0275 0.0356 0.0397 0.0556 0.0665 0.0665 0.0690 0.1002 0.1031 0.1076 0.1215 0.1325 0.1407 0.1407

0.0295 0.0376 0.0376 0.0376 0.0376 0.0522 0.0522 0.0522 0.0522 0.0522 0.0615 0.0629 0.0813 0.0819 0.0819 0.0819 0.1076 0.1076 0.1076 0.1140 0.1140 0.1140 0.1140

3 4 20 23

0 0 0 0

/ / / /

/ / / /

a

所有 KEGG 代谢途径都来自于 2005 年 7 月 1 日公布的 KEGG Release 35.0 的

版本。

表 3. 各植物激素合成途径中主要基因的微阵列数据信息
FDR 校正后的 P 值 微阵列编号 酶名
a

0wt/3wt 5wt/3wt 10wt/3wt 15wt/3wt 20wt/3wt 10wt/10fl P<0.005 P<0.001

Ethylene biosynthesis CM106A07 ACS6 CM027E10 ACO1 CM050E03 ACO2 CM094A02 ACO3 CM034H03 ACO4 0.041 0.12 0.089 0 0.12 0 0.0013 0.0045 0.014 0.0028 0 0 0.0009 0.30 0.0083 0 0.010 0.049 0.35 0.0023 0 0 0.0005 0.0026 Y
b

N Y Y Y N

Y Y Y N

0 0.0004 0.0062 0.032 0.20 0.038

BR biosynthesis CM005B02 SMT1 CM021F11 DWF5 CM010A11 DWARF1 CM054H06 DEM1 CM010F11 DET2 CM117F12 DDWF 0.0011 0.0092 0.54 0.030 0 0.13 0.080 0.12 0 0.017 0.9993 0.032 0.0007 0.0022 0 0.68 0.22 0.46 0.0050 0.0078 0 0.38 0.039 0.12 0.032 0.0010 0 0.0060 0.23 0.041 0 0.076 Y N N N Y N Y N N N N N

0.0011 0.0033 0.025 0.0004

GA biosynthesis CM092E03 GA20ox1 CM122F06 GA20ox2 CM041F09 GA3ox1 CM054D10 GA3ox2 0.31 0.0010 0.017 0.19 0.12 0.0022 0.0056 0.011 0 0.012 0 0 0 0.47 0 0.0001 0.0008 0 0.0005 0.34 Y Y Y
b b b

Y

b

N Y
b

0.020 0.0031 0.26 0.013

N

N

Auxin biosynthesis CM099B04 NIT CM040A08 FMO1 CM089E02 TDC 0.13 0.39 0.067 0.96 0.56 0.033 0.0084 0.036 0.0066 0.0024 0.081 0.0005 0.0028 0.29 0.0074 0.019 0.14 0.19 N N N N N N

a b

P< 1e-6 都显示为 0。 GP<0.001 但在无纤维突变体(fl)中表达水平更高的基因不当作纤维特异表达基

因。


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